（中西医结合临床专业论文）抗诺如病毒药物筛选的相关基础及其有效方药的文献研究.pdf

抗 诺如病毒 的重要病原体，同时也是婴幼儿散发性胃肠炎的常见病原( 仅次于轮状病毒) ， 无论发达国家还是发展中国家，n o v 都有很高的感染率。美国疾病控制中心 ( c d c ) 曾经估计，美国每年有至少2 3 0 0 万例n o v 导致的胃肠炎病例( 约占 其人口总数的1 0 ) ，占到所有已知病原体导致疾病总数的6 0 ，有超过7 3 3 1 u 9 5 的传染性胃肠炎暴发是由n o v 造成的，每年因n o v 胃肠炎的治疗费用和间 接经济损失达3 5 至7 5 亿美元。据前些年统计，在我国，腹泻病是位居第二位 的对小儿威胁较大的常见多发病，其中病毒性腹泻占4 0 以上，由n o v 引起的 腹泻估计占l 3 。实际上，过去由于未列入常规检测或报告项目，对该病毒感染 和发病的的危害仍被严重低估。 n o v 基因组属于单股正链r n a ，全长约7 5 7 7 k b ，包括3 个开放阅读框 ( o r f s ) 。o r f 2 编码的含5 4 0 个氨基酸的主要衣壳蛋白v p l 为n o v 抗原主 要决定簇，同时负责识别结合受体，近年来已成为n o v 的主要研究对象。n o v 具有高度遗传多样性，不同国家、社区同时可能存在不同的n o v 毒株流行。自 2 0 世纪9 0 年代中期首次确认g i i - 4 型n o v 毒株导致绝大部分n o v 胃肠炎暴发 和世界性大流行后，n o vg i i 4 型毒株一直为为全球优势流行株。我们课题组南 方医科大学公卫学院流行病学系自2 0 0 2 年以来对广东省多地n o v 感染进行了前 瞻性流行病学研究，结果表明n o vg i i 4 型为主要流行株，占到总数的8 2 9 ， 中文摘要 该结果得到了北京、长春、济南、兰, k l i 、福州等地n o v 研究的证实。 由于缺乏细胞培养系统，亦无合适的动物感染模型，一直以来抗n o v 胃肠 炎的药物研究进展缓慢，迄今为止，尚缺乏针对n o v 胃肠炎的有效抗病毒药物 和疫苗。近年来随着国外学者对n o v 基因组结构和发病机制研究的日益深入， 发现了一些具有前景的抗n o v 药物靶标，如：通过多糖受体阻断病毒与宿主细 胞相互作用、抑制病毒蛋白水解酶和多聚酶作用和抑制病毒复制等方面。这些 进展为抗n o v 性胃肠炎的药物研究提供了新思路。 本研究拟在前期工作基础上，以我国n o v 流行优势株g i i 4 型毒株为主要 研究对象，以n o v 入侵人体的主要致病蛋白v p l 及其所识别的人类组织血型抗 原( h b g a s ) 受体为研究切入点，克隆g i i 4 型n o vo r f 2 基因，利用杆状病 毒表达系统( b a c t o b a c ) 表达纯化g i i 4 型病毒样颗粒( v l p ) ，在此基础上， 采用凝集抑制实验法测定唾液h b g a s 受体分型( a 、b 、h ) ，建立一种体外n o v v l p s 结合唾液h b g a s 受体的酶联免疫( e i a ) 药物筛选模型。 中医药治疗病毒性腹泻历史悠久、经验丰富、疗效肯定，且自成体系。近 年来中医药界为寻求有效的疗法进行了多方探索，各地涌现出大量自拟新方， 经临床和实验证实具有独特的优势和广阔的开发前景。本研究通过收集中医药 治疗病毒性腹泻的现代有关文献，试图通过对病毒性腹泻有效方剂之基本结构 和核心药物的深入分析，筛选出具有研究前景的候选药物，并拟定更加合理和 可行的中医治疗方案，以期为利用此模型进行针对性的高通量抗n o v 中药化合 物筛选奠定文献基础。 一、g i i - 4 型诺如病毒o r f 2 基因的克隆与序列分析 从三株g i i 4 型n o v 粪便中( g z 5 5 ，g z 1 2 1 ，j m 4 8 2 ) 提取病毒r n a ，经 逆转录后，以c d n a 为模板，p c r 扩增出完整o r f 2 基因，分别与p m d l 8 t 载 体连接，得到重组质粒p m d l 8 t - g z 5 5o r f 2 ，p m d l 8 t - g z l 2 1o r f 2 ，p m d l 8 一t - j m 4 8 2o r f 2 。d n a 测序后进行全部核苷酸、氨基酸序列分析比较和进化树 分析。结果表明：根据g e n b a n k 公布的g i i 4 型n o v 保守序列设计合成特异性 i i 博士学位论文 引物，3 株g z 一5 5 ，g z 1 2 1 ，j m - 4 8 2n o v 粪便标本通过r t - p c r 均得到约1 7 k b 分子量大小o r f 2 区域片断，其长度与预计相符。重组质粒行b a m hi 和h i n d 双酶切后p c r 扩增出完整o r f 2 阅读框序列( 约1 6 2 k b ) 。利用d n a s t a r 软件 分析该3 株n o vo r f 2 序列，其中g z 5 5 、g z l 2 1o r f 2 共1 6 2 0 个碱基编码5 3 9 个氨基酸，j m 4 8 2o r f 2 共1 6 2 3 个碱基编码5 4 0 个氨基酸。g z 5 5 、g z l 2 1 和j m 4 8 2 与v a 3 8 7 氨基酸同源性分别为9 2 、9 3 、9 3 。经与g e n b a n k 代表性n o vg i 、 g i i 的o r f 2 氨基酸比较分析，结果表明：n o vo r f 2 包括2 个主要区域，n 端 结尾的壳区域( s 区域) 和c 端结尾的突出区域( p 区域) ；其编码的氨基酸序 列存在3 个相对保守序列：s 区与p 区结合部位的f l v p p t v e 序列、p 1 亚区 k t 或r t 氨基酸序列、p 区域c 末端保守精氨酸r 簇。结合文献分析这些保守 序列均具有不同的重要作用：含f l v p p t v e 铰链的p 二聚体和h b g a s 受体结 合力低而不含铰链的p 颗粒结合h b g a s 受体能力非常强；p l 亚区k t 或r t 氨 基酸序列为胰岛素酶切位点；c 末端保守精氨酸r 簇在识别受体过程是必需的。 二、o r f 2 基因在昆虫细胞中表达形成病毒样颗粒的研究 用限制性内切酶b a m hi 和h i n d l i i 将质粒p m d l 8 t - g z l 2 1o r f 2 酶切， 回收酶切的目的基因o r f 2 片段，再与用b a m hi 和h i n d l i i 双酶切的线性化载 体p f a s t b a c t m l 连接，获得重组转座载体p f a s t b a c g z l 2 1o r f 2 ，将其转化大肠 杆菌d h l 0 b a c ，得到重组杆状病毒穿梭质粒r b a c m i d g z l 2 1o r f 2 ，经用琼脂糖 凝胶电泳和p c r 鉴定后，将其转染昆虫s f 9 细胞，从培养上清中获得重组杆状 病毒r b a e g z l 2 1o r f 2 ，以之重新感染新鲜的s f 9 细胞表达外源蛋白。对细胞上 清进行s d s p a g e 和w e s t e r nb l o t 分析，发现重组病毒r b a c g z l 2 1o r f 2 表达 了分子量约为5 8 k d a 的n o v 衣壳蛋白，大小与v l p 相符，说明杆状病毒携带 的n o v 衣壳蛋白基因o r f 2 在昆虫细胞中得到成功表达。对细胞上清采用不连 续蔗糖密度梯度超速离心，纯化出v l p 并经负染电镜得到证实，其直径约为 3 0 n m ，形态和结构与野生型n o v 相同。为进一步研究v l p 的各种特性打下了 物质基础。 i i i 中文摘要 三、病毒样颗粒结合唾液h b g a s 受体的检测及意义 收集健康志愿者唾液标本，采用凝集抑制实验法检测唾液中h b g a s 血型物 质，用e i a 法检测n o v v l p 与h b g a s 的结合特性。结果显示，6 3 份唾液标本 检出o 型2 l 例( 占3 3 3 ) ，b 型1 4 例( 占2 2 2 ) ，a 型和非分泌型各1 3 例 ( 分别占2 0 6 ) ，a b 型2 例( 占3 2 ) 。n o v - v l p 与a 、b 、o 型均能结合( o d 值 2 5 ) ，与非分泌型唾液不结合( o d 值o 3 ) ，结合方式与r v a 3 8 7 相一致， 其与受体结合的特异性也再次表明我们成功在昆虫细胞中表达了v l p 。针对 n o v 结构蛋白v p l 的h b g a s 受体阻断剂的筛选和开发具有更为广阔的研究前 景和现实意义。本研究建立的n o v - v l p 和h b g a s 受体结合模型，重复性好， 且具有快速经济等优点，为开发我国人群n o v 暴发的防治药物提供了理想筛选 模型。 四、中医药抗病毒性腹泻有效方药的筛选和评价 以中国生物医学文献光盘数据库( c b m d i s c ) 和中国学术期刊全文数据库 ( c n ) 1 9 9 9 年1 月- 2 0 0 8 年1 2 月所收集的文献为资料范围，以( 病毒性腹 泻o r 秋季腹泻o r 急性胃肠炎) a n d ( 中医o r 中药o r 中成药o r 中西医结合 o r 经验报道) 为计算机检索式，从文献数据库中共枪索到文献3 7 4 篇，进一步 评定与筛选剔除不合格文献，最终收集到符合纳入和排除标准的合格文献1 5 8 篇，每篇文献中关于中药组方的描述均作为一条记录。 通过对组方的用药频次处理，发现中医药抗病毒性腹泻的处方用药主要有 如下特点：( 1 ) 重视经典方剂的运用：明确提到以经典方剂( 传统成方) 加味 治疗的文献4 7 篇，占总数的3 4 1 。核心方剂是五苓散、葛根芩连汤、泻心汤、 藿香正气散、理中汤和七味白术散。( 2 ) 用药集中：主要集中在云苓、白术、 葛根、藿香、苍术、黄芩、车前子等3 l 味核心药物，占药物出现总频次的7 8 5 。 药物类别主要集中在补虚药、利水渗湿药和化湿药等十大类。( 3 ) 健脾渗湿并 重：补虚药用药频次最多，且主要集中在健脾益气药( 白术、党参、山药、扁 豆) ；利水渗湿药仅居其次，集中在云苓、车前了、泽泻、猪苓、薏苡仁。“以 方测证”， 忌闭门留 比重相对 夹不同，可随证加减，或清化湿热、或温化寒湿、或疏表、或消导。收涩药出 现频次仅居第八位，表明多数医家不主张骤用补涩，以防闭门留寇。 通过对治疗病毒性腹泻有效方药的筛选和分析，特拟定优化组方用药方案如 下：炒白术1 0 9 、云苓1 0 9 、藿香1 0 9 、煨葛根1 0 9 、车前子1 0 9 、乌梅5 9 。 关键词：诺如病毒；o r f 2 ；病毒样颗粒；h b g a s 受体；有效方药；文献 v b a s i cr e s e d o c u m e n t f o r m u l a e n a m e ：z h a n gx u f u 1 s u d e r v l s o r ：i vz l l l - p l n g ， z l a o uy m g - c n u n j l 一 r a b s t r a c t n o r o v i r u s e s ( n o v ) a l eal e a d i n gc a u s eo fe p i d e m i c so fa c u t en o n b a c t e r i a l g a s t r o e n t e r i t i s ，a f f e c t i n gp e o p l eo fa l la g e sw o r l d w i d e n o vi n f e c t i o nw i t hh i g h i n f e c t i o nr a t e se x i s ti np o p u l a t i o n sb o t hi nd e v e l o p i n ga n dd e v e l o p e dc o u n t r i e s t h e v i r u s e sa r eh i g h l yc o n t a g i o u s ，u s u a l l yr e s u l t i n gi nl a r g eo u t b r e a k si nc r o w d e d c o m m u n i t i e so ri n s t i t u t i o n ss u c ha ss c h o o l s ，r e s t a u r a n t s ，h o s p i t a l s ，c h i l dc a r ec e n t e r s ， n u r s i n gh o m e sf o rt h ee l d e r l y ，c r u i s es h i p s ，a n dm i l i t a r ys e t t i n g s i tw a se s t i m a t e dt h a t 10 o ft h ep o p u l a t i o no f u n i t e ds t a t e se x p e r i e n c e dn o vg a s t r o e n t e r i t i se a c hy e a r ( 2 3 m i l l i o nc a s e s ) ；a n dn o va c c o u n t sf o ras u b s t a n t i a le x t e n to fd i s e a s ea n dp o t e n t i a l e c o n o m i cl o s s ( 3 5 - 7 5m i l l i o nd o l l a r s ) ，p a r t i c u l a r l yt ot h eh e a l t hs e r v i c ew h e r eal a r g e p r o p o r t i o no fo u t b r e a k so c c u r i nc h i n a , a c u t eg a s t r o e n t e r i t i s ( a g e ) i so n eo ft h e m o s tc o m m o ni l l n e s s e so fc h i l d r e n ，a sw e l la si no t h e rd e v e l o p i n gc o u n t r i e s i nf a m i l y s e t t i n g sg a s t r o e n t e r i t i si ss e c o n di n1 j r e q u e n c yo n l yt ot h ec o m m o nc o l d h o w e v e r ， t h e r ea r eo n l yf e wr e p o r t so nt h ep r e v a l e n c eo f n o vi nc h i n a s of a r ，a g ec a u s e db y n o vi n f e c t i o n sw e r en o tar o u t i n es u r v e i l l a n c ep r o j e c t ，j u s tc l a s s i f i e di n t ocg r a d e i n f e c t i o u sd i s e a s e sa so t h e ri n f e c t i o u sd i a r r h e a , i nc h i n a a n dt h er o l eo fn o v i n f e c t i o n sw a so v e ru n d e r e s t i m a t e d 。 i nt h ed e v e l o p m e n to fa n t i v i r a la g e n t sa g a i n s tn o r o v i r u s ，i n c l u d i n gt h ei n h i b i t i o no f v i r a la t t a c h m e n tt oh o s tc e l l s t h r o u g hc a r b o h y d r a t er e c e p t o r s ，i n h i b i t i o no fv i r a l p r o t e a s ea n dp o l y m e r a s ef u n c t i o n s ，a n di n t e r f e r e n c ei nv i r a lr e p l i c a t i o n g i i - 4n o r o v i r u ss t r a i nn o ww a sr e c o g n i z e da st h ep r e d o m i n a n ts t r a i nc i r c u l a t i n g a r o u n dt h ew o r l di n l a s t2 0y e a r s i nt h i ss t u d y , v l p sf r o mag i i 4n o v , w h i c hw a s i d e n t i f i e da st h ep r e v a l e n c es t r a i ni nc h i n ai no u rf o r m e rs t u d i e s ，w e r ee x p r e s s e di n i n s e c tc e l l s e i am e t h o d sf o rv l p s b i n d i n gt oh b g a sr e c e p t o rw e r ea l s oe s t a b l i s h e d t h e s e w o r k sw i l lp r o v i d eb a s i sf o rf u t u r ed r u g s c r e e n i n g c h i n e s em e d i c i n eh a da l o n gh i s t o r yf o rv i r a ld i a r r h e at r e a t m e n t m o r ea n dm o r e p r e s c r i p t i o n sw e r ee x p l o r e di nt h e s ey e a r sw i t hg o o de f f e c t i nt h ep r e s e n ts t u d y , h e r b a n dp r e s c r i p t i o n sw e r es c r e e n e db yd o c u m e n ts t u d ya sf u t u r ec h i n e s em e d i c i n e s t r a i nw a so b t a i n e dw h i c hc o d e5 4k da m i n oa c i d t h ec a p s i dr e g i o nc o n s i s t so ft w o m a j o rd o m a i n s ，t h es h e l l ( s ) a n dt h ep r o t r u s i o n ( p ) d o m a i n s ，w h i c ha r el i n k e db ya s h o r th i n g e t h esd o m a i nf o r m st h ei n t e r i o rs h e l lo ft h ec a p s i d ，w h i l et h epd o m a i n b u i l d su pa r c h - l i k es t r u c t u r e se x t e n d i n gf r o mt h es h e l l t h r e eo r f 2g e n eo fn o r o v i r u s g i i - 4s t r a i nw a so b t a i n e da n ds t r a i n si nt h i ss t u d ys h o w e d9 2 - 9 3 h o m o l o g yw i t h v a 38 7s t r a i n s a n dt h e r ee x i s t e d3c o n s e r v e dr e g i o n si no r f 2r e g i o n ：as h o r th i n g e ( f l v p p t v e ) b e t w e e npa n dsd o m a i n ；t h et r y p s i nc l e a v a g es i t e s ( k to rr ta m i n o a c i d ) a n dah i g h l yc o n s e r v e da r g i n i n e ( r ) c l u s t e ra tt h ect e r m i n u so ft h epd o m a i n ， w h i c hi sc r i t i c a lf o rr e c e p t o rb i n d i n g 2 e x p r e s s i o no f n o vc a p s i dp r o t e i n ( v l p s ) i n i n s e c tc e l l s g z121n o vo r f 2g e n ea m p l i f i e db yp c rb yu s i n gp m d 18 一tp l a s m i d ，w a s i n s e r t e di i l t ob a c u l o v i r u s e x p r e s s i o ns y s t e m ，c o n s t r u c t e dar e c o m b i n a n tv e c t o r , p f a s t b a c - g z i21 o r f 2 a f t e rt h e t r a n s p o s i t i o n i nd h10 b a c ，r e c o m b i n a n t b a c u l o v i r u sr b a c m i d - g z121o r f 2w a sg a i n e d a f t e rt h et r a n s f e e t i o nt os f 9c e l l s ， r b a c g z121o r f 2w a so b t a i n e di ns u p e m a t a n tc u l t u r e v l p se x p r e s s i o nw e r e c o n f i r m e db yu s i n gs d s p a g ea n dw e s t e r nb l o ta n ds h o w e da ne x p e c t e dm o l e c u l a r m a s sa b o u t5 8 k d a a n dt h ee x p r e s s e dv i ，p sh a da3 0 n md i a m e t e ru n d e re l e c t r o n i c m i c r o s c o p e i ti n d i c a t e dt h es u c c e s s f u le x p r e s s i o nv l p si ni n s e c tc e l l s ，w h i c hw i l l p r o v i d em a t e r i a lb a s i sf o rf u r t h e rs t u d y i n gt h ec h a r a c t e r i s t i co fn o v v l p s a b s t r a c t 3 g z121v l p sb i n dt os a l i v ah b g a sr e c e p t o ra n di t ss i g n i f i c a n c e s a l i v as p e c i m e n sw e r ec o l l e c t e df r o m6 3v o l u n t e e r s ；h b g a sa n t i g e n st y p e s w e r ei d e n t i f i e db yu s i n ga g g l u t i n a t i o ni n h i b i t i o na s s a y s ；t h eb i n d i n gp a t t e r n so fn o v t oh b g a sa n t i g e n sw e r ei d e n t i f i e db ye i a a m o n g6 3 v o l u n t e e r s ，o - a n t i g e n a c c o u n t e df o r3 3 3 ，bf o r2 2 2 ，aa n dn o n - s e c r e t o rf o r2 0 6 a n da bf o r3 2 ， r e s p e c t i v e l y g z12 1v l p sc a nb i n dt oa l ls e c r e t o r s ( o d 2 5 ) ，b u tn o tt oa l l n o n s e c r e t o r s ( o d - - 0 3 ) t h e s er e s u l t sa l s oc o n f i r m e do u rs u c c e s s f u le x p r e s s i o n v l p si ni n s e c tc e l l s w ee s t a b l i s h e de x p e r i m e n t a lm e t h o d so nn o v b i n d i n gt os a l i v a h b g a sa n t i g e n ；i tw i l lh e l pu st o e x p l o r et h eh o s ta d a p t a t i o nc h a r a c t e r , v i r u s e v o l u t i o na n de p i d e m i o l o g yo fn o v ；i tw i l la l s oh e l pu st oe s t a b l i s ht e c h n i q u e p l a t f o r mo fa n t i n o vd r u g ss c r e e n i n g ，a n dl a yt h eb a s i sf o rn o vp r e v e n t i o na n d t h e r a p yi nc h i n e s ep o p u l a t i o n 4 s c r e e n i n ga n de v a l u a t i o no f e f f e c t i v eh e r b sa n df o r m u l a ef o rv i r a ld i a r r h e a w eu s e dw o r d s ( v i r a ld i a r r h e a , a u t u m nd i a r r h e a ，a c u t eg a s t r o e n t e r i t i s ，a n d c h i n e s em e d i c i n e ，c h i n e s eh e r b ，c h i n e s em e d i c i n ep r o d u c t ，i n t e g r a t e dt r a d i t i o n a l c h i n e s ea n dw e s t e r nm e d i c i n ea n de x p e r i e n c er e p o r t ) a sk e yw o r d sa n dd i ds e a r c h d o c u m e n t si nc b m d i s ca n dc n k if r o mj a n19 9 9t od e c2 0 0 8 ；a n dw eo b t a i n e d3 7 4 d o c u m e n t s a f t e re l i m i n a t i n gu n q u a l i f i e dd o c u m e n t s ，158d o c u m e n t sw e r es e l e c t e dt o o u rs t u d y t h eh e r b so rf o r m u l a ef r o mo n ed o c u m e n ts a v e da sar e c o r d a f t e rt h ef r e q u e n c ys t u d yo ft h eh e r b sa n df o r m u l a ei nt h e s ed o c u m e n t s ，s o m e c h a r a c t e r i s t i c so fh e r b sa n df o r m u l a ew e r ef o u n d ：( 1 ) e m p h a s i z i n go nt h eu s eo f c l a s s i ct r a d i t i o n a lf o r m u l a e ( 2 ) e m p h a s i z i n go ns o m eh e r b s ；( 3 ) e q u a l l yf o c u s i n go n i n v i g o r a t i n gt h es p l e e nf o re l i m i n a t i n gd a m p n e s s ；( 4 ) a l s of o c u s i n go nt h ec a u s eo f t h ed i s e a s e c o m b i n i n gw i t ht h es c r e e n i n ga n da n a l y s i so ft h ee f f e c t i v eh e r b sf o rv i r a l d i a r r h e a ，w em a k et h ee s s e n c ep r e s c r i p t i o n ：b a k e dw h i t ea t r a c t y l o d e sr h i z o m e ( 10 9 ) ， v 博士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i 前言乙1 第一章g i i 4 型n o vo r f 2 基因的克隆与序列分析1 l 1 1 材料和方法1 1 1 2结果18 1 3 讨论2 4 第二章o r f 2 基冈存昆虫细胞中表达形成病毒样颗粒的研究2 7 2 1 材料和方法2 7 2 2 结果3 4 2 3讨论4 3 第三章病毒样颗粒结合唾液h b g a s 受体的检测及意义4 8 3 1 材料和方法4 8 3 2 结果5 1 3 3讨论5 3 第四章中医药抗病毒性腹泻有效方药的筛选与分析5 6 4 1 文献和数据的选择5 6 4 2 有效方药的筛选与分析。5 7 4 3 试拟优化组合治疗方案6 8 4 4 问题与展望7 0 全文小结7 2 参考文献7 3 附录一：中英文缩略词表8 3 附录二：p c r 扩增的g z 5 5 株o r f 2 区域d n a 测序图谱8 5 目录 8 8 肠炎药物靶点研究新进展9 0 因论治现状9 7 10 2 10 3 10 4 1 0 5 博士学位论文 前言 诺如病毒( n o r o v i r u s e s ，n o v ) 由美国学者k a p i k i a n 于1 9 7 2 年用免疫电镜 方法在美国诺瓦克镇腹泻患者的粪便中首先发现，当时称诺瓦克病毒( n o r w a l k v i r u s ，n v ) 【l 】，此后研究者不断从腹泻粪便标本中检测到此类病毒，先是称为 小圆结构病毒( s m a l lr o u n ds t r u c t u r e dv i r u s ，s r s v ) ，后称为诺瓦克样病毒 ( n o r w a l k 1 i k ev i r u s ，n l v ) ，直至2 0 0 2 年8 月第八届国际病毒命名委员会批准 定名为诺如病毒1 2 ，3 1 。由于n o v 至今不能体外组织培养，也没有动物模型，直 至1 9 9 0 年我国旅美学者江熙( j i a n gx i ) 教授首次从志愿者的腹泻标本中成功弄 清了病毒基因组的结构和核苷酸全序列【4 】，建立了检测n o v 的血清学和分子生 物学方法f 5 一，从而对该病毒病原学的重要性和流行病学特征有了越来越多的了 解7 1 ，n o v 感染的流行病学和临床特征见表1 。 一、病原学 l 、形态学 n o v 属于杯状病毒科诺如病毒属，与该科的札幌样病毒( s a p p o r o 1 i k ev i r u s s l v ) 一起合称为人类杯状病毒( h u m a nc a l i c i v i m s e s ，h u c v ) 3 1 。 诺如病毒颗粒的形态为直径2 6 - - 3 5 n m 的无包膜表面粗糙的二十面体对称 的球形，分子量5 8 6 5 k d ，外壳由1 8 0 个同一种外壳蛋白组成的9 0 个二聚体构 成，电镜下缺乏显著的形态特征，不像动物嵌杯病毒有明显的嵌杯凹陷或表面 孔洞。负染色电镜照片显示，n o v 是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆 状结构病毒f 8 9 1 。 2 、理化特性 n o v 对各种理化因子( 热、乙醚和酸) 有较强的抵抗力，在p h 2 7 的条件下 3 h 、2 0 乙醚1 8 - - 2 4h 或6 0 c 力h 热3 0m i n 仍具有传染性。并不能被如酒精和季 胺盐之类常见的消毒剂灭活，也耐受普通饮水中3 7 5p p m - - 6 2 5p p m 的c l 。浓度 ( 游离氯0 5p p m - - 一1 0p p m ) ，但在处理污水的1 0p p m 的c i 。浓度中被灭活【l o 】。 前言 3 、基因组学 n o v 基因组属于单股正链r n a ，拿长约7 5 7 7k b ，基因组的5 端共价连 接着一个蛋白v p g ，3 末端含有p o l y a 尾，包括3 个开放阅读框( o p e nr e a d i n g f r a m e s ，o r f s ) 。v p g 通过共价键与病毒r n a 结合，并为其提供5 帽子结构， 据推测，v p g 的作用是把病毒基因组转运到负链r n a 合成的部位。o r f l 为长 约5k b 的非结构蛋白，编码一个约2 0 0k d 的蛋白前体，在病毒蛋白酶的作用下 裂解成数个病毒复制所需要的非结构蛋白，如解旋酶、依赖于r n a 的r n a 聚 合酶( r n a - d e p e n d e n tr n ap o l y m e r a s e ，r d r p ) 等；o r f 2 和o r f 3 编码结构 蛋白，o r f 2 长约1 7 k b ，编码5 6 k d 的主要结构蛋白v p l ：o r f 3 长约0 6k b ， 编码一个2 2k d 的强碱性小结构蛋白，可能与基因组包装成病毒体有关【8 1 。( 见 图1 ) 表1 诺如病毒感染的流行病学和临床特征 t a b l e1 c l i n i c a la n de p i d e m i o l o g i cf e a t u r e so f n o r o v i r u si n f e c t i o n s 因 素描述 年龄因素 季节性 易暴发地区 潜伏期 症状 疾病自限性 病程 传染性 可感染各个年龄段 全年可以流行；暴发集中于寒冷季节 半封闭式环境( 如医院、巡海舰队、养老院等) 、部队、学校、 娱乐场所易于暴发人人间传播 l o 5 1 h 起病突然，以呕吐( 儿童多见) 或腹泻( 成人多见) 为主要表 现；腹泻无脓血、粘液与白细胞；1 3 感染者表现为隐性感染 相对于其他腹泻病程相对自限；然而在 6 5 岁老 人可致脱水和住院治疗 病程多为2 8 6 0 h ；约1 5 病人( 尤其是自身患有其它导致免 疫缺陷的疾病) 病程可超过3 天 发病后1 3 天排放病毒量最大，传染性最强；最近有资料表明 病毒排放时间可长达5 6 天；免疫缺陷病人病毒排放期延长 2 传播途径和传播 载体 免疫性 治疗 宿主 粪口传播； 莓污染或制 感染后可获得短期同型免疫；其它株别或感染一段时间后同型 别n o v 攻击可致感染；反复暴露可获得长期免疫力 目前主要是对症治疗预防脱水；尚无特异抗病毒药物：疫苗尚 处于初步研究阶段 人类；最近研究证据提示存在动物宿主的可能性 1 8 0m o l e c u l e s ( 9 0d i m e r s lo f v p l g e n o m i cr n a ( 。7 7k b ) o r f l o r f 2o r f 3 v p g i l a p 4 an t p a s ep 2 2v 哩p r o p o l v p g r n a , v p l , v p 2 s u b g e n o m i cr n a ( - z sk b ) o r f 20 r f 3 v p g 丁一l a l l a 鑫 v l p 譬 ( 来源：r o g e ri g l a s s ，u m e s hd p a r a s h a r , m a r yk e s t e s ne n g ljm e d2 0 0 9 ；3 6 1 ：1 7 7 6 - 8 5 ) 图1 ：诺如病毒衣壳蛋白和基因组结构图 f i g u r e l s t r u c t u r eo f n o r w a l k v i r u sc a p s i da n dg e n o m e ( 来源：r o g e ri g l a s s ，u m e s hd p a r a s h a r , m a r yk e s t e s ne n g ljm e d2 0 0 9 ；3 6 1 ：1 7 7 6 - 8 5 ) 图2 ：诺如病毒的系统进化分析 f i g u r e2 p h y l o g e n e t i ca n a l y s i so f n o r o v i r u s e s 4 博士学位论文 二、流行病学 由于n o v 对各种理化因子具有较强的抵抗力，传染件强，极易引起暴发流 行f 1 3 1 4 1 ，2 0 0 6 年美国c d c 已将n o v 列为生物恐怖b 类因子【1 5 1 9 1 。为了更加科 学的理解n o v ，r a l p hb a r i c 等在权威杂志p l o sm e d i c i n e 上提出了“胃肠性流 感的命名【2 0 2 1 1 。认为n o v 和流感在进化和宿主免疫方面非常相似，n o v 流 行优势株可以进化获得抗原空间并保持感染性而存活下来，