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嬲煳骅 基于电聚合硫堇膜的电化学免疫传感器的 研制及应用研究 摘要 电化学免疫分析法由于仪器设备简单，分析速度快，灵敏度高，线性范围宽 等优点，越来越受到科研工作者的广泛关注。本论文研制了基于聚硫堇戊二醛自 组装蛋白质的新体系，采用辣根过氧化物酶( 玎”) 标记抗体，使用双抗体夹心 法对甲胎蛋白( 岍) 的进行检测。此外，在光照情况下，加入二茂铁，使之与 聚硫堇纳米金抗体修饰电极发生光诱导反应，制成一种新型的光电免疫传感器， 并考察了该传感器的工作条件及其的响应性能。在最佳实验条件下，分别测定了 甲胎蛋白( 岍) 和癌胚抗原( c e a ) 的线性范围及检测限。结果表明，该方法 灵敏度高，分析快速、简便，在生物分析中具有广阔的应用前景。 本文主要开展了以下几个方面的工作： 一、基于电聚合硫堇膜的伏安型酶联免疫新体系的研究及应用 将硫堇电聚合到铂电极表面形成聚硫堇膜，通过戊二醛自组装蛋白质，使酶 标抗体与相应的抗原发生免疫反应时催化底物氧化聚硫堇，以聚硫堇膜电极的还 原电流表达抗原的量，从而制得高灵敏度的甲胎蛋白免疫传感器。通过循环伏安 法及差分脉冲伏安法考察了电极表面的电化学行为，并对免疫传感器的性能进行 了详细研究。在优化的实验条件下，伏安法检测甲胎蛋白的线性范围为5 0 0 砣0 0 n g m l l ，线性相关系数为0 9 9 5 7 ，检测限为3 7 0n g m l 1 。将该免疫传感器用 于血清样品中a f p 的检测，结果满意。 二、基于电聚合硫堇膜光电效应的新型免疫传感器的研制 在铂电极表面，通过聚合物膜大量的氨基活性基团，可以有效吸附纳米金， 进而固定蛋白质，在底液中加入二茂铁，利用了修饰电极表面聚合物膜与二茂铁 的光电效应，以聚硫堇膜电极的氧化电流表达抗原的量，从而制得高灵敏度的光 电免疫传感器。同时，通过循环伏安法和电流时间曲线考察了电极表面的电化学 行为，并对光电免疫传感器的工作条件和响应性能进行了详细研究。这种传感器 制作简单，而且在无酶的实验条件下，方法新颖，有一定的医学研究和临床检验 研究价值。 三、基于电聚合硫堇膜光电效应的新型免疫传感器的应用 将该免疫传感器应用于甲胎蛋白( j 岍) 和癌胚抗原( c e a ) 的免疫分析并 对实际样品的进行检测，结果令人满意。在优化的实验条件下，光电法检测甲胎 蛋白的线性范围为5 0 0 。1 5 0 n g m l l ，其氧化峰电流的增量和浓度的线性方程为： y = 0 1 1 5 2x 一2 1 8 2 ，线性相关系数为0 9 9 5 1 ，检测限为2 6 7n g m l l 。检测癌胚 抗原的线性范围为5 0 0 8 0 o n g m l l ，其氧化峰电流的增量和浓度的线性方程为： y = 0 1 4 6 4x 一1 4 8 6 ，线性相关系数为0 9 9 7 8 ，检测限为3 2 6n g m l l 。 关键词：免疫传感器聚硫堇光电效应纳米金甲胎蛋白癌胚抗原 p r e p ara n o na n da p p u c a n o no f e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o rb a s e d0 n p o l y ( t h i o n i n e ) f i l m e l e c t r o d e e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r sh a v eb e c o m eam o r ea n dm o r ep o p u l a r a n a l y t i c a lt e c h n i q u eo w i n g t oi t ss i m p l ei n s t r u m e n t a t i o n ，h i g hs e n s i t i v i t y , w i d e d y n a m i cr a n g e ，r e p r o d u c i b i l i t y , s i m p l i c i t ya n dr a p i d i t y i nt h ep a p e r , t h eg l u t a r a l d e h y d e o rn a n o - a uw a su s e dt oa t t a c hp r o t e i no nt h ep o l y ( t h i o n i n e ) f i l me l e c t r o d e ，f a b r i c a t i n g t h r e en o v e le l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r sb a s e do nt h ee l e c t r o c h e m i c a la n d p h o t o e l e c t r o c h e m i c a le f f e c to f t h em o d i f i e de l e c t r o d e a n dt w op r o t e i n sw e r ed e t e c t e d w i t ht h ep r e p a r e di m m u n o s e n s o r s t h em o r ed e t a i l e dc o n t e n ti sa sf o l l o w s ： 1 p r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no f 旺一f e t o p r o t e i ni m m u n o s e n s o rb a s e d o rt h e p o l y ( t h i o n i n e ) f d me l e c t r o d e a ne l e c t r o c h e m i c a la - f e t o p r o t e i ni m m u n o s e n s o rw a sc o n s t r u c t e db yu s i n ga n e l e c t r o p o l y m e r i z e d t h i o n i n ef i l mo n ap l a t i n u me l e c t r o d e t h ea m i n og r o u p so f p o l y ( t h i o n i n e ) w a s u s e dt o c o v a l e n t l y a t t a c h p r o t e i np r o b e sv i a t h e a i do f g l u t a r a l d e h y d eg r o s s - l i n k i n g ，a n de n z y m e e a r m a r k e da n t i b o d yc a t a l y z e di - 1 2 0 2 t o o x i d i z ep o l y ( t h i o n i n e ) w h e ni m m u n o r e a c t i o n t h ee l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s ew a s r e c o r d e da st h ed e t e c t e ds i g n a l u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h ei m m u n o s e n s o r s h o w e da s p e c i f i cr e s p o n s et oa - f e t o p r o t e i ni nt h er a n g ef r o m 5 0 0t o2 0 0n g m l lw i t h ad e t e c t i o nl i m i to f3 7 0n g m l l t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a su n d e r3 6 2 o = 5 ) f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fs a m p l e s t h ei m m u n o s e n s o ri ss a t i s f a c t o r yt o t h e d e t e r m i n a t i o no fh u m a ns e r u ms a m p l e s ，a n ds h o w sh i g hs t a b i l i t ya n ds e n s i t i v i t y 2 p r e p a r a t i o no fp h o t o e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o rb a s e do np o l y ( t h i o n i n e ) m me l e c t r o d e t h ea l o h a f e t a l p r o t e i n ( a f p ) a n d c a r c i n o e n b r y o n i ca n t i g e n ( c 蚴 p h o t o e l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o s e n s o rw a sp r e p a r e db a s e do i lp o l y ( t h i o n i n e ) f i l m e l e c t r o d e o nt h eb a s i so fp o l y ( ：t h i o n i n e ) f i l me l e c t r o d e ，t h eg o l dn a n o p a r t i c l e sw e r e 青岛科技大学研究生学位论文 目录 第一章绪论1 1 1 免疫传感器的简介1 1 1 1 膜电极免疫传感器1 1 1 2 酶标免疫传感器2 1 1 3 压电免疫传感器4 1 1 4 量热和磁免疫传感器5 1 1 5 光免疫传感器6 1 1 6 免疫场效应管传感器( i m m u a o f e t ) 6 1 2 电化学免疫传感器6 1 2 1 电流型酶免疫传感器7 1 2 2 电流型非酶标记免疫传感器8 1 2 3 电位型无标记免疫传感器8 1 2 4 电位型免疫传感器9 1 2 5 电位型非酶标记免疫传感器1 0 1 2 6 电化学免疫传感器的结构1 0 1 2 6 1 直接型电化学免疫传感器的结构1 1 1 2 6 2 间接型电化学免疫传感器的结构1 1 1 3 抗体与抗原1 2 1 3 1 免疫球蛋白及抗体的产生1 2 1 3 2 抗原”1 3 1 3 3 单克隆抗体和多克隆抗体1 3 1 3 4 免疫球蛋白的理化性质1 4 1 3 5 抗体和抗原的特异结合1 4 1 3 6 抗体( 抗原) 的固定化技术1 5 1 3 6 1 吸附法1 5 1 3 6 2 包埋法1 6 1 3 6 3 交联法1 6 1 3 6 4 偶联法1 6 1 4 本课题的目的和意义1 7 第二章基于硫堇电聚合膜的电流型甲胎蛋白免疫传感器的研 基丁电聚合硫第膜的电流型酶联免疫传感器的研制及应用研究 究1 9 2 1 引言o 00 00 1 9 2 2 实验部分2 0 2 2 1 实验仪器与试剂2 0 2 2 1 1 主要实验仪器2 0 2 2 1 2 主要实验试剂2 0 2 2 2 免疫电极的制备2 0 2 2 3 实验方法2 1 2 3 结果与讨论0 0 000 0 0q00000 00 2 2 2 3 1 电极层层自组装过程的电化学特性2 2 2 3 2 免疫电极对岍的响应2 2 2 3 3 实验参数对免疫传感器测试性能的影响2 4 2 3 3 1p h 值的选择2 4 2 3 3 2 孵育时间和温度的选择o og0 000 00 00oo a 2 5 2 3 3 3h 2 0 2 用量的选择2 6 2 3 4 传感器的性能2 6 2 3 4 1 对岍的线性响应和灵敏度2 6 2 3 4 2 再生性和特异性2 7 2 3 4 3 重现性和稳定性2 7 2 3 5 免疫传感器的应用oq ”2 8 2 4 本章小结2 8 第三章基于硫堇电聚合膜的光致电化学免疫传感器的研 究2 9 3 1 引言2 9 3 2 实验部分3 0 3 2 1 实验仪器与试剂3 0 3 2 1 1 主要实验仪器3 0 3 2 1 2 主要实验试剂3 0 3 2 2 纳米金溶液及免疫光电极的制备3 1 3 2 2 1 纳米金溶液的制备3 1 3 2 2 2 免疫光电极的制备3 1 3 2 3 实验方法3 2 青岛科技大学研究生学位论文 3 3 结果与讨论3 2 3 3 1 聚硫堇的光诱导反应3 2 3 3 2 免疫光电极层层自组装过程的表面形貌和电化学特性3 4 3 3 3 实验参数对免疫传感器及其光致电化学效应的影响3 6 3 3 3 1 二茂铁浓度的选择3 6 3 3 3 2 偏压，光照强度，波长的选择3 7 3 4 本章小结3 7 第四章基于硫堇电聚合膜的光致电化学免疫传感器对a f p 应用的研 箩苌”3 9 4 1 引言3 9 4 2 实验部分3 9 4 2 1 实验仪器与试剂3 9 4 2 1 1 主要实验仪器3 9 4 2 1 2 主要实验试剂4 0 4 2 2 实验方法4 0 4 3 结果与讨论4 0 4 3 1 孵育时间和温度的选择4 0 4 3 2 光免疫传感器对j 岍的线性响应和灵敏度4 1 4 3 3 再生性和特异性4 2 4 3 4 重现性和稳定性4 3 4 3 5 光免疫传感器的应用4 3 4 4 本章小结4 4 第五章基于硫堇电聚合膜的光致电化学免疫传感器对c e a 应用的研 多苌4 5 5 1 引言4 5 5 2 实验部分4 5 5 2 1 实验仪器与试剂4 5 5 2 1 1 主要实验仪器4 5 5 2 1 2 主要实验试剂4 6 5 2 2 实验方法4 6 5 3 结果与讨论4 6 基丁电聚合硫堇膜的电流型酶联免疫传感器的研制及应用研究 5 3 1 电极层层自组装过程的电化学特性4 6 5 3 2 孵育时间和温度的选择4 8 5 3 3 光免疫传感器对c e a 的线性响应和灵敏度4 9 5 3 4 再生性和特异性5 0 5 3 5 重现性和稳定性5 1 5 3 6 光免疫传感器的应用5 1 5 4 本章小结5 2 结论5 3 参考文献5 5 致谢6 3 攻读学位期间发表及待发表的学术论文目录6 5 声明6 7 青岛科技大学研究生学位论文 1 1 免疫传感器的简介 第一章绪论 免疫传感器是分子生物学，电化学，光学，微电子学相结合的产物，是利用 生物体内的免疫反应与专门的检测装置相结合构成的一种生物传感器，是七十年 代末国际上开发的一种重要的生物敏化测量器件。由于测量中采用了免疫和酶标 免疫反应，利用抗原、抗体之间的特异反应和酶标记抗原( 抗体) 的放大效应， 加上采用了各种高灵敏度的检测手段，使这类生物传感器具备了对某些蛋白质等 大分子物质具有分子识别、高灵敏的检测功能，至今已构成了生物传感器的一个 重要分支。其操作简单、便捷、无污染、灵敏度高、选择性好，有十分诱人的发 展前景。各类免疫传感器的进展情况如下。 1 1 1 膜电极免疫传感器 这类免疫电极即文献中的非标记免疫电极。自1 9 7 5 年j a n a t a 1 l 首次将伴刀豆 球蛋白a ( c o n a ) 固定于p v c 膜上，研制成可以测量甘露聚糖酵母的免疫电极 以来，这类传感器获得了较快的发展。d o r a z l o 和r e c h n i t z 2 1 利用豚鼠补体识别 羊红血细胞影( s r b c g ) 上的溶血素抗原抗体复合物，溶解s r b c g ，释放其中 的t m p a + ，再以三甲基苯胺( t m p a + ) 离子选择电极测定抗溶血素或豚鼠补体， 使这类免疫电极的灵敏度有所改善。a i z a w a 等1 3 】将与梅毒抗体特异结合的心肌磷 脂作为活性物质，将其固定在醋酸纤维素上作为抗原膜，用于诊断酶素。y a m a m o t o 等【4 】将经高温处理后的m 丝用c n b r 活化，固定人绒毛膜促性腺素( h c g ) 抗体， 制得了可以用于测量h c g 的免疫电极。a i z a w a 等【5 】从红细胞中提取的血型物质 制成抗原膜，用于血型的测定。当抗体抗原反应在膜表面进行时，使膜电位发生 变化，因此，可以利用简单的膜电位测量判定血型。s o l o k y 和r e c h n i t z l 6 l 采用4 - 氟间硝基苯与二氨基苯并1 8 冠6 的反应产物为载体，制成了可以用于2 ，4 二硝 基苯肼抗体测定的p v c 膜电极，为膜免疫电极的研制开辟了一种新的途径。在此 基础上，k e a t i n g 和r e c h n i t z l 7 1 又将苯并1 5 冠5 、二苯并1 8 冠6 分别与地戈辛 经化学反应结合，通过电极测量某固定k + 浓度溶液的电极电位变化。因膜内部分 载体与被测溶液中的抗体结合后，可以移动的k + 载体减少，电极电位发生变化， 由此可以间接测得该体系中地戈新抗体的浓度。b u s h 和r e c l m i t z 8 1 报道了种可 基于电聚合硫第膜的电化学免疫传感器的研制及应用研究 以用于测量半抗原2 ，禾二硝基苯肼( d n p ) 的可逆电极。小分子的2 ，4 一d n p 可 以自由通过胶原膜与d n p 抗体结合。由于该电极可逆，则可以进行连续测定。 近年来，国内已陆续研制成甲胎蛋白( i - a f p ) 9 1 、白喉毒素【1 0 1 、乙肝表面抗原 ( h b s a g ) 1 1 】、h c g 1 2 - 1 3 】等膜免疫电极。有报道【1 4 】将抗i g g 固定于聚苯乙烯薄膜 上，研制成免疫球蛋白g ( i g g ) 和抗埏g 电极，测得的线性范围分别是 1 。7 3 7 p g m l d 和5 。8 6 p g m l 。也有报道【1 4 1 用蚕丝作载体固定抗h b s 的h b s a g 免疫电极，可以在2 0 。3 2 0n g m l l 范围检测h b s a g 。林朝辉等以二醋酸纤维素戊 二醛已二胺膜以及合成的聚甲基丙烯酸羟乙酯膜，分别固定c 反应蛋白( c r p ) 抗体、免疫球蛋白m ( i g m ) 抗体、甲胎蛋白抗体( a f p ) 和甲状腺素( t 4 ) 抗 体，配合全固态基础电极制成的免疫电极，可以获得稳定、重现的结果。该法已 研制成c r p l l 5 l 、a f p 1 6 1 、i g m 和t 4 等免疫电极，并已用于人血清样品的测量。 2 0 0 1 年，彭图治等【1 7 1 报道了一种灵敏度高和使用简便的免疫电极，用于测定乳腺 癌抗原( c a l 5 3 ) 。c a l 5 3 抗体固定在用羟胺活化的聚氯乙烯( p v c ) 牛血清白蛋 白( b s a ) 基体膜上。当抗体膜与c a l 5 3 血清结合形成抗原体复合物膜后，将该复 合物膜固定在自制a g a g c l 基体电极顶端，利用毫伏计测定膜电位。人血清中其 他常见抗原对c a l 5 3 测定基本无干扰。同时，探讨了免疫膜的电位响应机理。 此类电极所测量的载体膜表面在抗原抗体复合物形成前后电性质的变化，因受免 疫反应速度和复合物、抗原、抗体所带电荷的影响，通常较难获得很高的电极灵 敏度。 1 1 2 酶标免疫传感器 酶标免疫传感器可以显著提高电极的灵敏度，常用竞争法和夹心法测量，已 报道主要的电极种类列于表1 - 1 。 表1 1 酶免疫传感器 t a b l e1 - 1l l l z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ts e n s o r 电极 抗原 电极原理标记酶灵敏度参考文献 膜 茶碱0 2 竞争 h r p 0 7n g m l - l h a g a 1 8 1 竞争 c a t a l a s e 尼龙经 5 x 1 0 - 8 。5 x 1 0 7 i t a g a i d 1 9 1 0 2 二甲亚 m 0 1 l 1 砜活化 2 、 青岛科技人学研究生学位论文 竞争 c a t a l a s el x l 0 - 3 5 x 1 0 3 h a g a 1 2 0 1 0 2 m 0 1 l l 夹心c a t a l a s e聚丙烯s h i m u r a t 2 1 1 经二甲5 x 1 0 - 8 。2 5 x 1 0 - 6 0 2 亚砜活 m 0 1 l 1 化 白蛋白 0 2 竞争g o d猪皮胶 l x l 0 8m 0 1 u 1m a t t i a s s o n 【2 2 1 b s a c双抗 u r e a s e 1 0 p g m l 1 m e y e r h o f f 2 3 】 n h 3 姗 1 0 8m 0 1 l 1 竞争 c a t a l a s ea c a i z a w a 2 4 1 h o g 0 2 3 x 1 0 - 9 1 5 x 1 0 - 5g - l 1 a c b r 竞争 c a t a l a s ea c g aa i z a w a 1 2 5 1 1 8 - 二氨 5 x 1 0 。1 1 。l x l 0 8 舡f p 0 2 基4 氨 基甲基 g m l l 辛烷 竞争 c a t a l a s ea c 叫虻6 x 1 0 。1 1 巧1 0 9 a i z a w a , i 硐 培g 0 2 b r m 0 1 l - 1 c 0 2竞争 c i - p o d g g m l 。1f o n o n g 2 7 1 h b si夹心 h r p 猪皮胶 0 5 5 0 1 , t g m u l b o i t i e u x 【凋 夹心g o d l x l 0 。1 0 1 0 x 1 0 7b o i t i e u x1 2 9 1 0 2猪皮胶 g m u l i g e i夹心h r p3 1n g m l li v n i t s k i i 【3 0 】 竞争 h i 心a c 经 李凡超p 1 】 丫干扰 i c n b r 活 21 t g l 。1 素 化 b s a ：牛血清白蛋白 a c b r ：溴代醋酸纤维素 g o d ：葡萄糖氧化酶 a p o d ：化过氧化氢酶 a c ：醋酸纤维素 r i r p ：辣根过氧化物酶 c a t a l a s e ：过氧化氢酶 c a m p ：g , 腺甘酸 g a ：戊二醛 u r e a f l ：脲酶 其中茶碱的测量【1 8 】是利用补体溶解脂质体释放出辣根过氧化物酶。催化还原 型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d h ) 氧化成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d + ) 用 3 毒 基于电聚合硫笔膜的电化学免疫传感器的研制及应用研究 氧电极对该反应后的0 2 进行了测量： 2 n a d h + 0 2 + 2 i - i + 一2 n a d + + 2 h 2 0 f o n o n g 2 7 1 ；! 贝1 i g g 的方法基于将c 1 p o d 与抗l a g i g g 连接后，使c 1 p o d 活性降低，避免了其余酶免疫法中所必需的游离标记物与已结合抗原抗体的标记 物分离。此现象是由于k g 与酶标记抗体结合后，空间位阻增大，底物接近活性 位置相对困难，或是酶本身结构改变所致。此外，b o r r e b a e c k 3 2 1 将c o n a 固定在 琼脂糖柱上，被测物质先流经c o n a 柱后，再到达0 2 电极探头。用此流动酶电 极法可以测得0 5 嵋m l 。1 的甲基q d 甘露吡喃。g y s s 和b o u n d i l l o n l 3 3 】采用玻 璃电极以用夹心法固定抗体i g g i g o 抗i g g - 葡萄糖氧化酶，固定的g o d 活性 可以通过测量以下反应的催化电流来衡量： 葡萄糖+ 苯醌一葡萄酸+ 氢醌氢醌一苯醌+ 2 i - i + + 2 e - 类似的方法【蚓报道了以玻碳电极测量n a d a 。d o y l e 等【3 5 1 用戊二醛偶联人q 酸性糖蛋白( o m d ) 和碱性磷酸酶，以碳糊电极在e l a = 7 5 0 m v 氧化催化产物苯 酚，进而对o m d 采用竞争法进行了测量，o m d 的检测下限可达1 0n g m l 1 。 d u r s t 和b l u b o u g h 3 6 】将脂质体和n a d + 固定于一修饰电极表面，被测抗原与脂质 体结合后补体使得脂质体溶解，释放其内部的底物失氢酶( s d h ) ，s d h 催化n a d + 还原为n a d h ，再用电化学的方法氧化n a d h 。通过测量氧化电流，即可测得抗 原的浓度。 1 1 3 压电免疫传感器 1 9 7 2 年s h o n s 等人【3 7 】首次将压电传感器用于免疫测定，在有塑料涂层的石英 晶体表面结合b s a ，用于测量b s a 抗体，所得灵敏度与传统的被动凝集法相似。 r i c e l 3 8 1 也用表面涂有聚合物的石英晶体固定抗原，对i g g 和i g e 进行了测定。 r o e d e r e 等【3 9 】将压电传感器用于测定溶液中的埏g ，通过在s t 切割的晶体表面修 饰一层缩水甘油丙氧基四甲基硅烷( g o p s ) ，再与垮g 抗体结合而实现的，该传 感器的测量范围为0 0 2 2 5 。2 2 5m g m l l ，但灵敏度较低。m u r a m a t s n 加】等用y 氨丙基四乙基硅烷修饰晶体表面，可以在1 0 缶一1 0 乞m g m l l 范围内测量i g o 。近 期曾报道【4 1 l 采用聚酰胺6 修饰晶体，吸附甲状腺素抗体后，可以测得5 1 7 x1 0 d 2 9 的甲状腺素。p m s a k s o c h a c z e w s k i 4 2 l 报道了在晶体上覆盖的聚乙烯亚胺，通过戊 二醛与抗体交联，测量鼠伤寒沙门氏菌，线性范围为1 0 5 1 0 9 c e u s m l l 。h a h n 等【4 3 】用抗苯甲酰芽子碱测定可卡因和盐酸可卡因，灵敏度为4 5 h z p p b 。e b e r s o l e 等i 州为扩大压电传感器中引入酶。在尼龙膜上选用夹心法固定复合物，而压电晶 体表面用聚乙烯二茂铁修饰。当尼龙膜上酶催化氧化r 为1 2 3 。时，1 2 1 3 。与紧贴尼 4 青岛科技大学研究生学位论文 龙膜的晶体表面修饰层间存在电子转移，引起压电晶体振动频率的改变。近期报 道的一种简单的压电生物传感器【4 5 i ，对压电晶体免疫传感器的基本原理、设计与 构造，并对常见的压电石英晶体免疫传感器生物敏感膜的制备方法进行了综述。 1 1 4 量热和磁免疫传感器 量热酶免疫分析法( t e u s a ) 所测量的是酶标抗原抗体复合物催化底物时产 生的反应热【4 6 l 。基本原理是将抗体固定在固相载体上，如琼脂糖c l - 4 b 上，利用 竞争法借助量热设备，测量反应热。文献报道的t e i i s a 传感器列于表1 2 。 表1 - 2 量热免疫传感器 t j l b l e1 2i m m u n o s o r b c n ts e i l s o r 抗原固定标记酶灵敏度测量时寿命参考文献 抗体间 他酶素抗他c a t a l a s c0 0 1 0 99 1 2 m i n8 天b o r r e b a e c k 1 4 7 酶素 h i 心 l l g m l 1 h s a 抗 c a t a l a s e l x l o 1 3 。1 5 2 0 天b o r r e b a e c k 4 7 1 h s al x l o 8 m 0 1 l 1 胰岛素原抗胰 h r pl x l 0 一。1 3m i i l 1 4 2 1 天 b i m b a u m 【鸺】 岛素5 5 x 1 0 - 6 t 0 0 1 l l h a s - 入血清白蛋白 r o b i n s o s l 4 9 1 以c n b r 活化后的可以磁化的纤维素为固相载体，用磁电极和循 环伏安法测量了g o d 的活性，其灵敏度为1 5 0 i n t u n i t s l 1 ，并对h c g 进行了测 量。电化学反应用以下反应式表示： 葡萄糖+ f c ( i i i ) 一葡萄酸+ f e ( i i ) f e ( i i ) 一f e ( i i i ) + e - 1 1 5 光免疫传感器 b r i g h t 等【5 0 】将标记有5 二甲氨基荼磺酰氯的抗i g g f a b 片断固定于聚四氟烯 5 基于电聚合硫草膜的电化学免疫传感器的研制及应用研究 与六氟丙烯的共聚物表面，该聚合物表面分别用3 氨丙基三乙氧硅烷和g o p s 修 饰。当被测样品中的抗原与已经固定的荧光标记抗原结合后，使抗体上的5 二甲 氨基萘磺酰氯荧光标记物荧光增强。与石英片相比，使用氟聚合物，使这种传感 器的检测下限和稳定性都有所改善，这种传感器经再生后，可以重复使用5 0 次。 t s a y 等【5 1 】研究的另一种传感器，将抗h c g 固定在石英片上，结合h c g 后的石 英片上产生一散射光栅，当激光照射时，产生散射。散射光的强度与石英片上的复 合物量有关，用以测定h c g 含量。m a n d e n i u s 5 2 1 在一用环氧硅烷处理后的石英片 表面接上k g ，待i g g 抗体与之结合后，再加入表面有i g g 的0 1 2 n m 的石英颗粒， 然后用椭圆光度法测量蛋白质的厚度。 近年来，光传感器已逐渐运用于免疫测量中。杨玉孝等【5 3 】利用建立的反射光 谱分析系统( a i r s ) 和s i 0 2 表面蛋白分布的原子力显微镜( a f m ) 表征，提出了利用 生物膜层反射光谱曲线极值点波长变化实时监测抗体抗原免疫反应的新方法。实 验表明，得到的生物免疫反应动力曲线与反应过程有很好的对应关系。该方法克 服了目前生物检测中膜厚算法的不足，方法简单有效，能够实现对生物反应过程 的实时监测。 1 1 6 免疫场效应管传感器( i m m u n o f e t ) 场效应晶体管( f i e l de f f e c tt r a n s i s t o r ，f e t ) 简称场效应管，是利用电场效 应来控制输出电流大小的半导体器件。i m m u n o f e t 是将抗原或抗体膜涂在场效应 管栅极表面上测试。j a n a t a l 5 5 】将心肌磷酯做成p v c 膜h i l m u n o f e t 测量梅毒。 b e r g r e l d 等t 5 6 】也用此类传感器对抗体进行了测试。由于这类传感器选择性差，寿 命短，且半导体表面绝缘性能不好，要解决这些问题，还需研究一种薄的、绝缘 性能和免疫响应性能均好的电极膜。目前i m m u n o f e t 还处于理论研究状态。 1 2 电化学免疫传感器 本论文制备的硫堇免疫探针，属于膜免疫传感器器件的一种，它在类型上属 于电化学免疫传感器器件。电化学免疫传感器是根据抗体对抗原具有唯一识别和 结合功能将抗体或抗原和电极组合而成的检测装置。根据所用的标记物种类的电 极类型，可将目前所报道的电化学免疫传感器分为如下五类1 5 刀。 6 青岛科技大学研究生学位论文 1 2 1 电流型酶免疫传感器 这种传感器是以酶免疫测定为基础，采用电流型电极将酶的底物浓度的改变 或其催化产物浓度的改变转变成电流信号的测定装置。这类免疫传感器有多种， 其中之一是以c l a r k 氧电极为基础而建立起来的酶免疫传感器。其结构很简单， 就是将抗体膜或抗原膜固定到氧电极的聚四氟乙烯膜上便可以构成这类传感器。 下面就以过氧化氢酶作为标记酶来说明其测定方法的原理：( 1 ) 在测定溶液中加 入标记过氧化氢酶抗原，然后将免疫传感器插入上述溶液中，未标记抗原( 被测 物) 和标记抗原对膜上的抗体发生竞争结合；( 2 ) 洗去未反应的抗原；( 3 ) 将传 感器插入测定酶活性的溶液中，这时传感器显示的电流值是由测定溶液中溶存氧 量决定的。然后向溶液中加入定量的h 2 0 2 ，结合在膜上的过氧化氢酶使h 2 0 2 分 解产生0 2 ，随之传感器的电流值增大。据此曾测定k g 、h c g 、甲胎蛋白、茶 碱和胰岛素等【5 8 - 6 3 1 。r e n n b e r g 等用氧电极组成酶免疫传感器测定氧的消耗 6 4 1 。 另一种类型的电流型酶免疫传感器是采用a p 作为标记酶来构成的。a p 能催 化磷酸苯酚酯水解生成苯酚和磷酸。苯酚在0 0 5 m o l l - 1 碳酸盐缓冲液中，在局陀= + 7 5 0m v ( v s a g - a g c i ) 电极电位的条件下可以被氧化，而其底物磷酸苯酚酯在 正电位下电的非活性物质。由于这个体系能释放出可以被氧化的产物，因此电分 析前不需除去样品和移动相中的氧。因此很容易用f j a - e c ( 流动注射分析法电 化学检出) 和l c e c ( 液相色谱法电化学检出) 检测催化产生的苯酚。测定兔 培g 或地谷新都是采用a p 标记抗原或抗体用f j a - e c 或l c e c 检测酶催化产物 苯酚来进行酶免疫测定的1 6 5 - 6 7 1 。在这两种情况下都是将样品( 2 0 i _ t l ) 流过薄层电 化学电池，苯酚在这个电池中，在8 7 0m v ( v s a g a g o ) 电极电位下，在碳糊 电极上氧化。采用f j a - e c ，可以允许样品通过的速度较高，但用l c e c ，可以 获得较低的检出限，而且由于苯酚在短的c 1 8 反向柱上保留而使苯酚与样品注 入所带来的电容峰分开。 此法地谷新的最低检出限为5 0p g m l l 。采用这个方法对患者样品分析，其 结果与公认的r i a 所得结果基本一致。 第三种类型是r o b i s o n 等提出的一种使用抗h c gm c a b 借助测定催化电流的 方法测定h c g 的电流型酶免疫传感器【6 8 1 。 还有一种使用电流型电极的情况，用脱氢酶作为标记测定n a d h 。e g g e r s 等 在用商品药盒检测苯妥英时【叫，没有用光学方法而是用电流型电极测定形成的 n a d h 。采用此法只要注意保护电极不被血清蛋白污染即可以得到与临床检验常 规方法基本一致的结果。 7 基丁电聚合硫蕈膜的电化学免疫传感器的研制及应用研究 非酶标记免疫传感器 在这种传感器中，抗体或抗原不是用酶标记的，而是用其他某种电活性物质 标记的。采用电活性物质标记抗原而进行的均相电化学免疫测定主要是根据抗原 和标记抗原对定量抗体进行竞争结合，而标记抗原与抗体结合后氧化或还原电流 减少。w e b b e r 等用二茂络铁标记吗啡按伏安免疫测定法测定二茂络铁吗啡结合 物在抗吗啡抗体的存在与不存在时的氧化作用【7 0 】，在抗体存在时，由二茂铁吗啡 结合物产生的氧化电流减少，这个实验结果构成了对吗啡均相测定的依据。他们 使用的工作电位为+ 5 0 0 m v ( v s s c e ) ，因此很容易使其他药物氧化。h e i n e m e n 等用醋酸汞标记的雌三醇在乙醇水溶液中用1 5 m o l l - 1 磷酸盐缓冲液作支持电解 质进行微分脉冲极谱时【7 1 1 ，在3 0 0m v ( v s s c e ) 电位下出现明显还原波。未标 记的雌三醇和汞标记的雌三醇不同。前者在所用的电压范围内是电非活性物质， 而汞标记的雌三醇与其抗体结合形成的复合物要比汞标记的雌三醇