（工程热物理专业论文）低温保护剂玻璃化临界降温速率的实验确定研究.pdf

中国科学技术大学硕士学位论文( 2 0 0 3 ) 董轶锋 摘要 在对细胞、组织和器官等生物材料的低温保存中，一般需加入一定种类和浓 度的低温保护剂，并针对不同的对象设计特定的降温、复温程序，以避免冰晶形 成造成的损伤。 事实上，若使细胞及保护剂以极快的降温速率冷却到某一温度，则溶液将过 冷并转变为非晶态( 玻璃态) ，从而避免由细胞内外的结晶带来的低温损伤，这 就是所谓的玻璃化保存，该方法是低温保存领域2 0 年来的一个热点方向。在相 关的动力学参数中，低温保护剂的临界降温速率b 的确定具有重要的理论和实 践意义，如果v 。，被低估，则可能会造成细胞的损伤，如果被高估，则无谓增加 玻璃化保存的难度。 由于物理参数的缺乏，经典结晶动力学给出的临界降温速率的确定方法在低 温保存中缺少应用价值，本文根据b o u t r o n 的半经验结晶动力学模型，利用差示 扫描量热仪( d s c ) 获得了若干渗透性低温保护剂的临界降温速率和实验验证的临 界结晶率，给出了低温保护剂临界降温速率的计算公式的修正结果，并说明了 b o u t r o n 模型对一些非渗透性保护剂结晶过程的局限性。 关键词：低温保护剂玻璃化保存半经验结晶动力学模型临界降温速率d s c 中国科学技术大学硕一卜学位论文( 2 0 0 3 ) 董轶锋 a b s t r a c t d u r i n gt h ec r y o p r e s e r v a t i o no fc e l l s ，t i s s u e s ，a n de v e n0 r g a n sa n d o t h e rb i o m a t e r i a l s ，c r y o p r o t e c t i v ea g e n t s ( c p a s ) i su s u a l l ya d d e di na n d t h e np r o p e rc o o l i n ga n dr e w a r m i n gp r o t o c o l sa r ed e s i g n e d ，i no r d e rt o a v o i d “s o l u t i o ni n i u r y ”( c a u s e db yt h eh i g hc o n c e n t r a t i o no fe x t r a c e l l u l a r s o l u t i o ni n d u c e db ye x t r a c e l l u l a ri c ef o r m a t i o n ) a n d “i i fi n i u r y ”( c a u s e d b yi n t r a c e l l u l a ri c ef o r m a t i o n ) i ft h e c o o l i n g r a t eo ft h ec e l l s u s p e n s i o n s i s h i g he n o u g h e x t r a c e l l u l a rs o l u t i o nw i l lb es u p e r c o o l e dw i t h o u tf o r m a t i o no fi c ea n d t r a n s f o r mi n t oag l a s s ys t a t e i t ss o c a l l e dv i t r i f i c a t i o nc r y o p r e s e r v a t i o n m e t h o d w i t ht h eg o o d n e s so fn oc r y s t a l l i z a t i o n t h i sm e t h o dh a sa t t r a c t e d m o r ea t t e n t i o na n db e c o m eah o tt o p i ci nt h ep a s t2 0y e a r s a m o n gt h e d y n a m i cp a r a m e t e r so fg l a s s f o r m a t i o n ，t h ed e t e r m i n a t i o no ft h ec r i t i c a l c o o i n g r a t ei sv e r yi m p o r t a n t ，i f u n d e r e s t i m a t e d ，i tw i l lc a u s ec r y o i n j u r y , a n di fo v e r r a t e d ，i t sn e e d l e s sa n de v e nc o s t st o om u c h i t sh a r dt oo b t a i ns o m ea p p l i c a b l ed a t ao fc r i t i c a lc o o l i n gr a t ef r o m c l a s s i c a lc r y s t a l l i z a t i o nt h e o r yf o rf e w p h y s i c sp a r a m e t e r sa r ea v a i l a b l e b a s e do nt h e s e m i e m p i r i c a lc r y s t a l l i z a t i o n m o d e l d e v e l o p e db y r b o u t r o n ，t h e e x p e r i m e n t - v a l i d a t e d c r i t i c a l c r y s t a l l i z i n g r a t i o sa n d c r i t i c a l c o o l i n g r a t e so fs o m ep e n e t r a b l ec p a ss o l u t i o n sn e e d e df o r c o m p l e t e l yv i t r i f y i n gw e r eg i v e na c c o r d i n gt ot h ed s ce x p e r i m e n t s ，a n d m o d i f i c a t i o n sw e r em a d eo nt h ee x p r e s s i o no f c a l c u l a t i n gc r i t i c a lc o o l i n g r a t e s t h e nt h el i m i t a t i o no fb o u t r o n sm o d e lf o rt h e n o n p e n e t r a b l e c r y o p r o t e c t i v ea g e n t sw e r ed i s c u s s e d k e yw o r d s ：c r y o p r o t e c t i v ea g e n t s ( c p a s ) ，v i t r i f i c a t i o nc r y o p r e s e v a t i o n ， c r i t i c a lc o o l i n g r a t e ，s e m i e m p i r i c a lc r y s t a l l i z a t i o nm o d e l ，d s c i i 中国科学技术大学硕士学位论文( 2 0 0 3 ) 董轶锋 英文字母 c p a s 巴 疋 l 死 n p f j u g v c 7 x g x t t t c c t d m s o 希腊字母 n 符号表 低温保护剂 活化能常数 玻璃化转变温度 熔融终了温度 均相成核温度 异相成核温度 成核率 晶体长大速率晶体前缘发展速率 g i b b s 自由能 临界降温速率 临界结晶率 降温速率 降温结束时的冰晶生成量结晶率 时间温度转变曲线 连续一冷却一转变曲线 二甲亚砜 粘度 i i i 中国科学技术大学硕士学位论文( 2 0 0 3 ) 董轶锋 第一章绪论 玻璃化保存是生物材料低温保存的个热点方向，其中低温保护剂实现玻璃化临 界降温速率的确定具有重要的应用价值。 1 。1 生物材料的低温保存及其意义 低温生物学是研究在低温下，特别是在冰点( o 。c ) 以下，细胞、组织、机 体与环境相互作用的物理及生物特性的一门新兴的交叉学科，其主要内容包括动 植物对寒冷环境的忍耐性、冻伤及其防治，低温酶学，生物细胞及组织的低温保 存和移植，食品、药品的低温冷冻和干燥保存，以及若干低温医学的方向，如低 温麻醉、人的冻伤和低温保护等【1 。 低温保存是低温生物学的一个重要研究方向，其主要内容是研究细胞及组织 的低温损伤规律，特别是与细胞内外水结晶相关的损伤，依据物理和生物学原理， 建立生物物理模型，理解细胞低温损伤机理，优化长期低温保存的操作程序和设 备，实现生物细胞及组织在液氮温度( 一1 9 6 ) 下的长期保存( 数月甚至数年) ， 在临床上具有重要的应用价值。 从保存角度而言来看，人类血液成分( 红细胞、血小板) 的低温保存，使建立 血液成分库成为可能，解决输血、供血双方时间不同的矛盾，又可按不同患者的 要求提供不同的血液成分：骨髓细胞的低温则为癌症治疗开创了新的途径，胰岛 细胞经胰腺组织的低温保存使糖尿病的彻底治疗成为可能；动植物细胞和组织的 低温保存则为农牧业的发展带来了巨大的经济效益和变革：从损伤角度而言，利 用细胞在低温下的损伤机理，可以对常规的手术进行变革，发展新的低温医疗器 械，例如发展使肿瘤等有害细胞遭受低温损伤而死亡的低温器械。 人们在很久以前就有了将生物材料置于低温下长期保存的想法，生物体乃至 人体的低温保存经常出现在一些科幻小说中，然而，真正科学意义上的低温保存 中国科学技术大学硕士学位论p ；( 2 0 0 3 ) 董轶锋 研究始于1 9 4 9 年，在一次实验中，英国研究人员c p o l g e 和a u s m i t h 偶然发现 用甘油加入精子后可以经历低温不死亡，这个发现在n a t u r e ) ) 上发表后，引起 很大的重视，从此大批研究人员被吸引到“低温保存”课题上来【2 】。 在低温生物学的发展过程中，工程学的参与对其发展起了重要的作用，从7 0 年代起，工程学者开始介入此领域，他们基于自己的学科背景，着重研究降温中 溶液的固化过程和各种物理化学过程对细胞可能的损伤，探索实现低温保存的途 径和热控制的方法，发展相应的理论、技术和仪器等 3 】。 这里首先说明低温长期保存的可能性。 生物体为什么能在低温下长期保存? 这是因为低温能抑制生物体的生化活 动，我们知道，水是生物体内的主要成分，对细胞的结构和功能有着重要的意义， 在极低温下( 如液氮温度，一1 9 6 。c ) ，液态水已经不能存在，可能的物理状态只 有晶态和玻璃态，在这两种情况下，水的粘度很高( 1 0 1 3 p o i s e ) ，在通常的时间 尺度内，已无法进行有效的扩散。从另一个方面看，生物体内一切新陈代谢过程 中的化学变化，虽然大多数由酶催化而表现为多种特殊形式，但仍服从某些共同 的化学物理规律。由a r r h e n i u s 公式 k = 爿8 印f 一如偎7 1 ) ( 1 1 ) 式中k 是反应速率，尺为气体常数，7 1 为绝对温度，e 口是活化能，a 为a r r h e n i u s 因子，对给定的反应，a 为一常数。 改写后得 l n k = l n a 一黼丁( 1 2 ) 对于给定的反应，若以l n k 和1 t 分别做纵横坐标，上述关系为一斜率小于0 的直线，根据一般推荐的活化能匕的数值，就可算出反应速率k 随温度而降低 的情况，从而推算出生物生化反应速率与温度的关系。例如，若一生物体在4 。c 下能存活2 小时，由上述公式，它在一4 0 下能保存数日，在一8 0 下能保存数 月，而在一1 9 6 。c t 司 望保存几个世纪 2 。因此，细胞、组织乃至生物体的低温 2 中国科学技术大学硕士学位论文( 2 0 0 3 ) 董轶锋 下的长期保存是完全可能的。 在细胞保存的实际应用中，通常使首先将细胞和组织放入低温保护剂 ( c r y 0 d r o t e c t i v ea g e n t s ，c p a s ) 中，然后针对不同的对象设计特定的降温、复温 程序，降温至某一温度( 如一1 9 6 。c ，l a t m 下的液氮温度) ，并在该温度下进行 长期保存，最后将其复温，从保护剂中取出细胞和组织，加以检测后应用。 降温中细胞及其周围介质的变化如下：当降温至一5 时，细胞及其周围介 质还未冻结，都处于过冷状态，在一5 一1 5 c 之间，细胞外部开始结冰( 自 然结冰或溶液人工种晶结冰) ，但细胞内没有开始结冰，仍处于过冷状态，这可 能是由于细胞膜阻止了冰晶生长穿入细胞内部的缘故，水分开始渗出细胞，然后 在细胞外结冰，从一1 5 继续降温，接下来的物理现象取决于冷却速率的大小， 如果降温速度很慢，细胞就有充分的时间向外渗透水分，细胞内部溶液浓度 升高，允许有更深的过冷度，则最后结果为细胞脱水，无胞内冰出现，细胞将皱 缩，在到达共融温度之前，细胞内部将长期处在高浓度溶液( 主要为电解质) 状 态之下，溶液浓度增加所造成的细胞潜在损伤被m a z u r 等人 4 】统称为“溶液效 应”：如果冷却过快，水来不及渗出就过冷到更低温度，直至在细胞内结冰而使 细胞内外达到渗透压平衡。基于充分的实验数据和理论推导，m u l d r e w k 和 m c g a n l e 提出了一个胞内冰冷冻损伤的渗透分裂假定及模型，结果表明，降温 过程中水穿越细胞膜会引发细胞内结冰 5 】。 因此，与一般的认识相反，低温保存过程中细胞所面临的挑战不是在于其忍 耐低温的能力，而是来自于降复温过程中必须经过的一个温度区间( 一1 5 。c 一 6 0 。c ) ，该温度区间对细胞来讲具有杀伤性【6 】，多数的生物材料都能在低温下长 期保存，但由此而必须经历的两个阶段一一降复温却极易受到损伤。 1 9 7 2 年m a z u r 给出了低温损伤的两个假定 4 ：a ，在较慢的降温速率下，低 温损伤源于“溶质效应”，在降温中，细胞外部溶液开始结晶，溶液浓度升高， 此时细胞内部水的化学势增大，水分开始渗出细胞，细胞脱水而造成的损伤。b ， 高降温速率下，低温损伤源于胞内冰晶的生成( i n t r a c e l l u l a r i c e f o r m a t i o n i i f ) ， 3 中国科学技术大学硕士学位论文( 2 0 0 3 ) 董轶锋 综合差两因素的作用，就必然存在某一最佳冷却速率，对应于最佳的存活率。 避免产生大量的、大尺寸胞内冰晶是保证细胞存活的必要条件，但不是充分 条件，除了极简单的微生物、病毒、细菌外，大多数细胞还需要使用低温保护剂 ( c p a s ) ，迄今为止，人们发现的低温保护剂有数十种，按其能否渗透到细胞内 部，可将其分为渗透性和非渗透性两种。 常用的渗透性低温保护剂有甘油( g l y c e r 0 1 ) ，乙二醇( e t h y l e n eg l y c o l ，e g ) ， 1 2 丙二醇( 1 ，2 一p r o g p a n 9 - d i d ，p g ) ，二甲亚砜( d i m e t h y ls u l f o x i d e ，d m s o ) 及乙 酰胺，就大多数情况而言，能够稳定渗入细胞且在浓度为1 m 或稍稍偏上时对细 胞相对无毒。其保护原理在于，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液 的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程。加入保护剂后，在降温过程中将发生如 下变化，1 ) 溶液中溶质浓度减小，细胞摄入盐量减小，由保护剂代替，2 ) 保护 剂进入细胞，改变胞内过冷状态，可以降低溶质( 电解质) 浓度，而使给定温度 下的细胞皱缩程度降低。 常用的非渗透性低温保护剂包括蔗糖、聚乙烯吡硌酮( p v p ，p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ) 、羟乙基淀粉( h e s ) 、聚乙二醇( p e g ) ，及葡聚糖：( d e x t r a n ) ，海藻 糖( t r e h a l o s e ) 。这类物质能溶于水，但不能进入细胞，大多数情况下，没有渗透 性c p a 时，它们不具有保护作用，其作用在于增强渗透性c p a 的作用，或允许 使用浓度更低的渗透性c p a ，另外还有加快溶液玻璃化，稳定蛋白质和细胞膜， 以及防止进一步的结冰的作用1 7 。 由于单一的保护剂各有优缺点，不能满足生物材料低温保存多方面的要求， 故实际应用的保护剂都是按一定配方配制成复合型的，包括渗透性、非渗透型保 护剂，如v s l 保护剂由2 0 5 ( w v ) d m s o ，1 5 5 ( w z ) z 一酰胺，lc ( w 功l 一2 丙二醇，6 ( w v ) 聚乙二醇和改型的d u l b e c c o 溶液组成 2 】。 由丝占堂姿至丝置出：造盛绁盥丝篮鱼塑笾的基垦塑当筮苤! 基主：塑盥直 处逃晶笪生盛星造盛塑笾曲圭鼍固苤：固些：建鱼塑丝由筮毯晶鲍垄盛塑生蓬： 星篮鎏堡在瑟缝盛盛鲍萎重垂回壁垄= ： 4 里型兰垫查盔兰堡：! 兰焦笙壅f ! ! ! 1 2 苎墼堡 1 。2 生物材料的玻璃化保存 1 2 1 发展概况 在低温保存的初始研究阶段，主要研究的是平衡冻结方法，即通过寻求不同 细胞的最近冷却速率，以减少“溶质损伤”和“胞内冰生成”造成的损伤，但即 使在最佳条件下，也远远不能达到完全避免的目的。 事实上，使细胞及保护剂以极快的降温速率过冷到某一温度，则液体将固化 成为玻璃态( 非晶态) ，在该过程中，细胞内外完全避免了结晶，从而避免了通 常的平衡冻结过程中由于冰晶生成引起的机械损伤、溶液损伤和渗透压损伤，然 后以玻璃态低温下长期保存，这就是所谓的玻璃化保存。 最初的玻璃化保存的概念是由b j l u y e t 于1 9 3 7 年提出【2 ，他认为生命的本 质是生物系统的原子或其它结构元的一种专门而异常的排列，轻微的排列位置的 扰动就会破坏平衡从而导致死亡，结晶会使水分子从这些结构元中被撕裂，这就 是低温损伤的原因，玻璃化比冻结固化引起的结构变化要小，因而是一种理想的 低温保存途径。 受当时一些物理化学家的启发，l u y e t 认为如果生物体被快速的冷却，冰晶 就可能无法形成而实现玻璃化，但是，在当时盼情况下，纯水或含水稀溶液实现 玻璃化所需的冷却速率需要1 0 “c m i n ，这是无法实现的，以后用显微镜和x 射 线衍射的研究也表明，早期的快速冷却方法并不能实现玻璃化。另外，由于1 9 4 9 年发现加入甘油的精子可以在低温下存活，后续的研究使依赖低温保护剂慢速冻 结的保存方法获得了很大成功，1 9 5 5 年后，玻璃化保存的研究基本上都停止了。 直到7 0 年代中期，s k a e r 和f r a n k s 研究高分子聚合物( p v p ，h e s 等) 时， 提出了在骤冷条件下此类物质可以使细胞外实现玻璃化 2 】，b o u t r o n 和k a u f m a n n 开始了关于细胞内外非晶态剩余溶液性质的研究，提出如果在很慢的降温速率下 冷却，溶液能保持非晶态，则所有细胞都应该能得到保护而免受冰晶损伤，并提 出了些相关的降温过程的模型 2 ，7 。1 9 8 1 年，f a h y 提出了用高浓度的低温保 5 中国科学技术大学硕士学位论文( 2 0 0 3 ) 董轶锋 护剂溶液，可以在较慢的冷却速率以及高压条件下实现完全的玻璃化，随后又发 展了所谓的“玻璃化溶液”【1 8 】，1 9 8 5 年r a i l 和f a h y 报道用这种溶液，使老鼠 胚胎玻璃化保存获得了成功。 到目前为止，玻璃化保存技术已被成功地应用于人类的精子、血液、体外培 养的干细胞、胰岛组织、动物的胚胎以及某些植物组织，但尚未应用于心脏、肾 脏等大型脏器，考虑到生物材料的热物性特点，现国际低温生物学杂志 c r y o b i o l o g y 主编p e g g 认为，玻璃化可能是解决人类大型组织和器官低温保存的 唯一方法 8 。 在目前生物材料玻璃化保存的研究中，一方面是极大的提高冷却速率，即研 究快速降温方式，使细胞在无毒性的低浓度下实现玻璃化，例如，8 0 年代，运 用超快速的冷却方法使液体水直接玻璃化获得成功，但这对体积较大的生物材料 是不现实的，因为传热温差和生物体的导热系数都是有限的；另一种方法就是寻 找在常规的降温速率下能实现玻璃化的保护剂，即“玻璃化溶液”。这里以广泛 使用的玻璃化溶液e f s 为例，说明其组成以及各成分的作用，将乙二醇( e t h y l e n e g l y c 0 1 ) 分别在含有3 0 f i c o l l ( 分子量7 0 0 0 0 ) 和o 5 m 蔗糖( s u c r o s e ) 溶液的 磷酸缓冲液( p b s ) 中稀释到2 0 ，3 0 ，4 0 ( v v ) ，即制成e f s 2 0 ，e f s 3 0 ，e f s 4 0 。 其中各成分的作用如下，乙二醇是低分子物质，能够渗透到细胞内部，有利于细 胞内玻璃化，f i c o l l 是大分子物质，根据f a h y 的理论，有利于胞外玻璃化，蔗糖 能够提供高渗环境，防止细胞肿胀【9 】。 在寻找玻璃化溶液方面，为降低保护剂的高浓度造成的毒性，f a h y 研究了在 降温和复温过程中加以高压( 如1 0 0 0 a t m ) 的方法，尚有很多问题有待解决。目 前常见的研究方向是在改进玻璃化溶液及其载体溶液的配方，包括将现有保护剂 进行优化组合，尽管针对不同的情况，通过摸索获得了些成功【1 0 ，但到目前 为l e ，配方并没有通用性。 在上述研究中，都需要判定细胞以及胞外溶液在怎样的条件下才能实现完全 的玻璃化转变，作为上式条件的判断基础，低温保护剂临界降温速率v 。，的理论 6 中国科学技术大学硕士学位论文( 2 0 0 3 ) 董鞔 挚 和实验确定具有重要的意义，这是本文的主要内容。 1 2 2 研究现状 从晶体的生成与生长来看，玻璃态的形成是一个动力学的过程，形成能力随着冷 却条件的不同有很大的不同，其中，实现完全玻璃化的最小降温速率，即为临界 降温速率。 在低温保护剂的玻璃化研究方面，国内外的研究小组有： 1 ) 以法国低温生物学家b o u t r o n 为代表的研究小组，b o u t r o n 在结晶动力学 理论的基础上，通过建立半经验结晶模型( 将在本文介绍) 的方法，使 用d s c 对低温保护剂的玻璃化和反玻璃化能力给出了定量的结果，对不 同类型，系列醇类水溶液的展开研究，讨论了低温保护剂以及其它溶液 的玻璃化以及反玻璃化能力 1 1 ，1 2 ，1 3 ，1 9 。 2 ) 上海理工大学的华泽钊教授的研究小组，集中于各类玻璃化溶液的理论 和实验研究，低温保护剂实现玻璃化物理量的实验确定 9 ，1 4 ，1 5 。 3 ) 此外中国科学院理化技术中心、浙江大学、国内部队的一些研究所、各 地医院、血液中一心等等也在进行玻璃化保存的研究 1 6 。 1 3 本文简介 在生物材料的低温保存中，由于具有避免结晶的优点，完全的玻璃化保存引 起了研究者的青睐，作为判断降温过程中玻璃化的标志，低温保护剂的临界降温 速率的确定具有重要的理论和实践意义，如果v 。被高估，则无谓增加应用中玻 璃化保存的难度，如果被低估，则可能会有冰晶生成，造成细胞的损伤。 b o u t r o n 根据晶体生长的理论，提出了一个半经验的结晶动力学模型。在系 列假设的基础上，该模型推导出冰晶量随冷却速率以及其他参数变化的解析表达 式，任禾盛等人给出了若干修改，本文即在他们推导的基础上，利用差示量热扫 描4 发( d s c ) 的实验数据，获得了若干常用低温保护剂的水溶液达到完全玻璃化的 7 主里型堂垫查盔堂堡_ 上兰丝堡塞! ! ! ! 1 2 苎塾璧 一 临界降温速率，获得了验证的i 临界结晶率，不必构造丌t 和c c t 曲线，给出了 临界降温速率的计算公式的修正结果，并对不同类型的保护剂的适用性做了说 明，对生物体材料的玻璃化保存有一定的指导意义。 参考文献 【1 】李广武郑从仪唐兵，低温生物学长沙：湖南科学技术出版社1 9 9 8 【2 】华泽钊，任禾盛低温生物医学技术北京：科学出版社1 9 9 4 3 k e n n e t hr d i l l e r , e n g i n e e r i n g b a s e dc o n t r i b u t i o n si nc r y o b i o l o g yc r y o b i o l o g l y 1 9 9 7 3 4 ：3 0 4 3 1 4 4 】m a z u r p ，l e i b o ，s p ，a n dc h u ，e ，h y a t w o f a c t o rh y p o t h e s i so f f r e e z i n g i n j u r y e v i d e n c e f r o mc h i n e s eh a m s t e rt i s s u ec u l t u r ec e l l s ， e x p c e l l r e s 1 9 7 2 ，7 1 ：3 4 5 - 3 5 5 5 】m u l d r e w , k a n dm c g a n n l e ( 1 9 9 4 ) t h eo s m o t i cr u p t u r eh y p o t h e s i s o f i n t r a c e l l u l a rf r e e z i n gi n j u r y b i o p h y s 6 6 ，5 3 2 5 4 1 【6 】m a h a d e v a n m ( 1 9 8 0 ) c r y o b i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a ls t u d i e so f h u m a ns e m e n p h d t h e s i s m o n a s h u n i v e r s i t y m e l b o u r n e v i c t o r i a a u s t r a l i a m a z u r , r ( 1 9 6 3 ) k i n e t i c s o fw a t e rl o s sf r o mc e l l sa ts u b z e r o t e m p e r a t u r e s a n dt h e l i k e l i h o o do f i n t r a c c u u l a r f r e e z i n g ，g e n p h y s i 0 1 4 7 4 7 - 3 6 9 7 1b o u t r o n c o m p a r i s o nw i t h t h e t h e o r y o ft h ek i n e t i c sa n de x t e n to fi c e c r y s t a l l i z a t i o na n do ft h eg l a s sf o r m i n gt e n d e n c yi na q u e o u sc r y o p r o t e c t i v e s o l u t i o n j c r y o b i o l o g l y 1 9 8 6 2 3 ：8 8 - 1 0 2 【8 d e p e g g t h ec u r r e n ts t a t u so ft i s s u ec r y o p r e s e r v a t i o nc r y o - l e t t e rp p10 5 一l14 2 0 0 l 【9 】雷鸣等人类胚胎低温保存溶液e f s h 4 0 实现玻璃4 匕：r - 况条件的实验研究低 温工程n o 6 ，2 0 0 1 ，3 2 3 7 【l o 】k r a p i sm s h i m i z ua h i g h l ye f f i c i e n tm o d i f i e dv i t r i f i c a t i o nm e t h o d s ，f o rd a y s3 i nv i t r op r o d u c e db o v i n e e m b r y o s ，c r y o l e t t e r sp p2 0 3 - 2 0 6 ，1 9 9 9 【1 1 】e b o u t r o n g l a s s f o r m i n gt e n d e n c ya n ds t a b i l i t yo ft h ea m o r p h o u ss t a t e i n s o l u t i o n so fa2 ，3b u t a n e d i o lc o n t a i n i n gm a i n l yt h el e v oa n dd e x t r oi s o m e r s i nw a t e r , b u f f e ra n de u r o c o l l i n s c r y o b i o l o g y1 9 9 33 0 ：8 6 - 9 7 1 2 a b a u d o t ，l a l g e r , r b o u t r o n g l a s s f o r m i n gt e n d e n c y i nt h e s y s t e m w a t e r - d i m e t h y ls u l f o x i d ec r y o b i o l g o y 2 0 0 04 0 ：1 5 1 - 1 5 8 1 3 】a b a u d o tpb o u t r o n g l a s s - f o r m i n gt e n c e n c y a n d s t a b i l i t y o fa u q u o u s s o l u t i o n so f d i e h y l f o r m a n i d e a n d d i m e t h y l f o r m a m i d ec r y o b i o l o g y 3 7 ，1 8 7 1 9 9 ，1 9 9 8 1 4 】刘宝林华泽钊等蔗糖溶液玻璃化转变的实验测定低温工程1 9 9 7 第6 期 4 0 4 4 8 中国科学技术大学硕士学位论文( 2 0 0 3 ) 董轶锋 【1 5 】刘占杰华泽钊等不同保护剂浓度和不同降温速率对脂质体玻璃化转变温 度的影响低温工程2 0 0 0 第6 期2 5 1 6 】权国波以乙二醇为基础的玻璃化溶液对小鼠扩张囊胚的超低温保存黑龙 江动物繁殖1 9 9 9 第7 卷第4 期，4 4 4 8 【1 7 】瞅a h a s h it ，i n a d as ，p o m m i e rc g ，o s h e aj j ，b r o w ne j o s m o t i cs t r e s sa n d t h ef r e e z e t h a w c y c l e c a u s e s h e d d i n g o ff ca n dc 3 br e c e p t o r s b yh u m a n p o l y m o r p h o n u c l e a rl e u k o c y t e s ji m m a n o l19 8 5 ；13 4 ：4 0 6 2 1 8 f a h y , g m ，m a c f a r l a n e ，d r a n g e l l c a a n dm e r y m a n ，h t ( 1 9 8 4 ) v i t r i f i c a t i o na sa n a p p r o a c h t oc r y o p r e s e r v a t i o n c r y o b i o l o g y2 1 4 0 7 4 2 6 【1 9 】j e p e y r i d i e u a b a u d o tc r i t i c a lc o o l i n gr a t ea n dw a n n i n gr a t e st oa v o i d i c e c r y s t a l l i z a t i o n i ns m a l lp i e c e so fm a m m a l i a n o r g a n s p e r m e a t e dw i t h c r y o p r o t e c t v i ea g e n t s c r y o b i o l o g y3 3 1 9 9 6 ：4 3 6 4 4 6 9 中国科学技术大学碗士学位论文( 2 0 0 3 ) 董轶锋 第二章溶液玻璃化的理论研究 玻璃化就是液体以极快的速率被冷却到远低于其结晶点的温度，晶核的形成和生 长受到极大的限制，最终过冷到转变温度瓦时，形成玻璃态的过程。其中，实 现玻璃化的最小降温速率，即为临界降温速率v 。 本章从b o u t r o n 的半经验结晶动力学模型出发，推导了结晶量与降温速率的关系 式，为k ，的研究奠定了基础。 2 1 玻璃化的基本概念 在自然界中，固体有两种形式：固体和玻璃体。他们在宏观上都呈现固体的 特性，两者的根本区别在于其内部的微观结构，即晶态和玻璃态，晶态的微观构 成质点( 原子、分子、离子) 都是呈有序排列和具有格子构造的，而玻璃态的物 质质点是不规则排列或者只是“近程有序”，不具有晶态的“远程有序”的结构特 征，从x 射线衍射曲线可以看出，玻璃态与液态的曲线很相似，而与固态的曲 线相差较远。 在持续的降温过程中，液体可以通过两种方式固化，其体积一温度曲线如图 2 - 1 所示。在冷却速率比较低的情况下，液体在凝固点l 处结晶，表现为体积的 突然收缩，即弘丁曲线的不连续：但在足够高的降温速率下，却遵循另一条途径 到达固相，经过时并不发生相变，液相保持为过冷态至较低的温度疋，然后 发生玻璃化转变，此过程并不存在体积的不连续性，而仅仅是矿一7 1 曲线的斜率 减小【1 。 因此，丛翌丝丑定竖趁i 沤往丝拯迭的速壅这猃垫型重堡王基缠昌盛丝迢鏖! 昌丝鲍垄盛型生篓嚣到援太鳆喔剑：量终过猃到筮銮亟廑互：垄盛毯壅查盐过 猩：基虫：塞现兹蛰丝量尘陉遏运奎：凹垄蝤昼陉迢速奎蛰： 几乎所有液体都有形成玻璃态的能力 1 1 ，例如纯水的大约为3 1 0 8 1 0 中国科学技术大学硕：b 学位论文( 2 0 0 3 ) 董轶锋 m i n ，在纯水中加入某些溶质，可以降低所需的临界降温速率，目前常用的低温 保护剂( 如甘油，二甲亚砜，1 ，2 丙二醇等) 的水溶液，都具有易于实现玻璃化 的性质。 比 温度 图2 1 降温中的比容- 温度曲线 从热力学的角度来看，结晶是一级相变，两相的化学势相等，但其一阶偏导 数如比容v ，墒s 不相等，有相变潜热；而玻璃化转变具有二级相变的特征，主 要表现为两相的化学势相等，一阶偏导数也相等，无相变潜热，其二阶偏导数代 表的物理量( 热容勺，热膨胀系数口和压缩系数6 ) 不相等，其中c ，的不连续变 化是我们利用热分析法确定玻璃化转变的基础，利用热分析曲线，我们可以从竖 亟些垡士玉结晶些：荭鎏酋结主笪盒殴匦銮剀堑星查蕴耋工塞全墼建毽丝。 但玻璃化转变本质上并不是热力学意义上的相变，因为在转变中始终没有新 相出现，事实上，玻璃态的形成是一非平衡的过程，我们无法只从热力学的分析 来判断玻璃态形成的条件，这是因为热力学中并没有考虑时间这一重要因素，因 此我们还应从动力学角度寻找玻璃态的形成规律，其中，临界降温速率是最重要 的动力学条件。 玻璃态的形成主要取决于动力学因素，即冷却速率的大小。在从液态过冷到 玻璃态的过程中，冷却速率必须足够大，使穿过7 r 温度区间时无法发生成 核和晶体长大的过程，冷却速率大于结晶的成核速率和晶体长大速率，那么过冷 液体将固化为玻璃态。 中国科学技术入学硕士学位论文( 2 0 0 3 ) 董轶锋 下面给出l 临界降温速率b 的常见确定方法。 在降温结晶过程中，如果结晶转变是在等温情况下进行的，则可以给出所谓 的时间一温度一转变曲线，即1 v r t 曲线，可用来确定，如图2 2 所示。 图中，熔融温度以上为稳定液相，低于玻璃化转变温度则为玻璃相， c 型曲线以内为结晶率大于x ( 例如1 0 8 ) 的晶体相，之间为亚稳态液相。对于 给定液体，要使它在降温过程中避免结晶率大于1 0 一，并经历亚稳态最终形成玻 璃态所需的最小冷却速率，应由l 向结晶率x = 1 0 8 的转变曲线所引切线的斜率 来确定，即= ( 乙一t n ) t , ，如上图中的b 线，该冷却速率就是形成非晶体 ( 石 1 0 a ) 的临界冷却速率。 温度 l l “时间 图2 2t t t 曲线 在利用t t t 曲线确定低温保护剂的临界降温速率方面，有如下的工作： 1 ) 理论方面，u h l m a r m 在综合考虑晶体成核速率和晶体长大速率因素的 基础上，得到给定体积结晶率x 时温度与时间的关系式f 1 ，作出时间 一温度一转变( r r r ) 曲线，应用文献中的一些物理参数，获得了若 干物质的临界降温速率。考虑到该模型是建立在等温转变的基础上 的，与实际冷却过程不符，m a c f o r l a n e 考虑了非等温的结晶转变，提 出用数值积分法构成连续一冷却一转变( c c t ) 曲线，给出临界降温 速率 1 】。 1 2 中国科学技术大学硕士学位论文( 2 0 0 3 ) 董轶锋 2 )实验方面，s u t t o n 应用d s c 技术，对常见的保护剂直接测量其t t t 曲线，并由此画出c c t 曲线，得到临界降温速率【9 ，1 0 】。 实验中确定l 临界降温速率可用如下方法进行： 1 )将液体从熔融温度开始进行不同速率的程序降温，然后使用x 一射 线衍射，光散射，电子显微镜扫描等方法检测是否有结晶存在。 2 )使用差热分析仪( d i f f e r e n t i a lt h e r m a la n a l y s i s ，d t a ) 或者差示扫描 量热仪( d i f f e r e n t i a ls c a n n i n g c a l o r i m e t r y ，d s c ) ，对溶液进行不同降温 速率的扫描，如果没有检测到结晶放热量，即可认为是临界降温速 率。本文即采用该方法进行测定。 2 2 水溶液的结晶 上文提到，玻璃化是结晶被抑制的过程，因此我们先从水和水溶液的结晶谈 起。 从动力学的角度来看，物质在冷却过程中，最终形成晶体还是玻璃体，是两 种速率过程：晶体的成核和生长速率与降温速率直接竞争的结果，前者取决于相 变驱动力，即g i b b s 自由能差以及粘性扩散系数，这与过冷度有关，后者取决于 样品的几何形状，导热率、热容等。 结晶过程是由晶核形成和晶粒长大过程共同构成。在结晶过程中，母相中产 生稳定的新相核的过程称为成核过程，可分为均相成核和异相成核两种。由于液 相内能量和密度的随机起伏涨落，系统内分子不时随机聚集成团而自发成核的过 程为均相成核，其在系统内各个部分的成核几率都是一样的：在外来的颗粒如尘 埃、微晶粒或某些已有界面如固体壁面导致的不均匀处成核长大过程为异相成 核，这些不纯物和界面起了晶种的作用，相应的成核温度分别为均相死，异相 死p f ，通常t h t h , ， 。 成核率，是指在一定的温度下，单位时间单位容积中所生成的晶核数，晶体 长大速率u 是在一定温度下，单位时间晶体的线增长速率，两者都与过冷度有 1 3 中国科学技术大学硕士学位论文( 2 0 0 3 ) 董轶锋 关，这里以5 0 p v p ( w w ) 水溶液的二维冰晶径向生长率u 和成核率j 随温 度的变化加以说明 1 】，如图2 3 所示。 从图中可以看出： 1 ) 晶体的成核和长大都需要一定的过冷度，只有在一定的过冷度下，或u 才 能达到最大，这对应图中的两个峰值。随着过冷度增大，溶液粘度增加，使 质点移动困难，难以从溶液扩散到晶核表面，不利于成核长大：另一方面， 随着过冷度增大，质点动能降低，容易聚集和吸附到晶核表面，这又有利于 晶核的形成和长大。因此，过冷度对，和u 的影响有一个极值，通常，的峰 值位于较低的温度。 2 ) j 和u 两曲线通常都有一个“重叠区”，称为“析晶区”。在析晶区，和u 都较大，容易结晶，因此，要使自发结晶能力大的溶液在降温过程中形成玻 璃态，就应该增加冷却速率，以迅速越过析晶区，使之来不及结晶而玻璃化。 o 8 研m m m i n ) 0 4 0 0 以成核数s c m 3 ) 0 2 0 4 0 6 0 8 0 9 0 温度( ) 图2 - 35 0 p v p ( w w ) 水溶液的二维冰晶 径向生长率u 与成核率，随温度的关系 2 3 玻璃态的形成 2 3 1 粘度与温度的关系 溶