（测试计量技术及仪器专业论文）近红外光谱扣除背景误差的研究.pdf

摘要 在近红外光谱分析技术中，影响近红外光谱的因素很多，如被测样品 的组分之间的相互作用、光谱仪的影晌等，这些因素在很大程度上破坏样品 的光谱，必须将这些影响光谱测量的背景因素进行扣除，以提高光谱测量的 准确性，从而保证校正模型的适用性和稳健性。本文通过对葡萄糖水溶液、 牛奶溶液以及人体血糖进行近红外光谱检测的实验分析，对扣除背景误差方 法的适用性进行研究。 论文的主要研究内容包括： 1 扣除背景方法原理及分析。首先介绍了近红外光谱测量原理；然后 从双光路补偿和扣标准液方法上对扣除背景方法的原理进行介绍；最后介绍 了近红外光谱的多元数据分析方法：多元线性回归( t d l r ) 、主成分回归 ( p c r ) 以及偏最小二乘( p l s ) ，并给出了校正模型的评价指标。 2 扣除背景方法在葡萄糖水溶液中的实验研究。实验结果表明：扣除水 背景的影响后，模型的建模精度提高了3 7 9 ，预测精度提高了2 2 5 。因 此，在糖水溶液中采用扣除水背景的方法能够有效的消除一部分仪器漂移以 及水的强吸收带来的影响，提高了近红外光谱测量的精度。 3 扣除背景方法在牛奶溶液中的实验研究。实验结果表明：扣除背景的 方法在测量牛奶中的脂肪和蛋白浓度时，并不能够有效地扣除牛奶中其他成 分相互干扰误差的影响，提高测量的精度。但是，在测量牛奶中的葡萄糖浓 度时，扣除纯牛奶背景的影响后，模型的建模精度提高了2 6 2 ，预测精度提 高了6 8 4 。因此，在牛奶溶液中采用扣除纯牛奶背景的方法测量牛奶中的 葡萄糖浓度，能够有效的消除牛奶中其他成分干扰误差的影响，提高了近红 外光谱测量的精度。 4 扣除背景方法在人体血糖无创检测中的实验研究。o g t t 实验结果表 明：扣除背景后，模型的建模精度和预测精度都没有得到提高。因此，在人 体血糖无创伤检测中，寻找一种合适的标准物作为背景以消除仪器漂移的影 响，成为下一步工作的重点。 关键词近红外光谱分析校正模型适用性扣除背景误差 a b s t r a c t d u r i n gt h en e a r - i n f r a r e ds p e c t r o s c o p ya n a l y s i s ，t h er e c i p r o c i t yo ft h e c o m p o n e n ti nt h es a m p l ea n dt h ei n f l u e n c eo ft h es p e c t r u mi n s t r u m e n tw i l l d e s t r o yt h es p e c t r u mo ft h es a m p l e s ot h e ym u s tb ed e d u c t e dt oi n c r e a s et h e v e r a c i t y o ft h es p e c t r u mm e a s u r e m e n t t h i sw i l le n s u r et h es u i t a b i l i t ya n d r o b u s t n e s so ft h ec a l i b r a t i o nm o d e l s i nt h ed i s s e r t a t i o n ，t h em e t h o do fd e d u c t i n g b a c k g r o u n de r r o ri s s t u d i e db yt h ee x p e r i m e n to fa q u e o u sm a t r i x 、m i l ka n d b l o o dg l u c o s eo ft h eb o d y t h e m a i nr e s e a r c hc o n t e n to f t h ed i s s e r t a t i o ni n v o l v e s ： f i r s t l y ，t h ep r i n c i p l eo ft h em e t h o do fd e d u c t i n gb a c k g r o u n de r r o ri s i n t r o d u c e d f i r s to fa l l ，t h ep r i n c i p l eo fn e a r i n f r a r e ds p e c t r u mm e a s u r e m e n ti s i n t r o d u c e d ；t h e nt h ep r i n c i p l eo ft h em e t h o do fd e d u c t i n gb a c k g r o u n de r r o ri s i n t r o d u c e db yt h ec o m p e n s a t i o no fb o t hl i g h t p a t h sa n dd e d u c t i n gt h es t a n d a r d s o l u t i o n ；t h em e t h o d so fm u l t i d a t ea n a l y s i sa r ei n t r o d u c e d ：t h em u l t i v a r i a t e l i n e a rr e g r e s s i o n ，p r i n c i p l ec o m p o n e n ta n a l y s i sa n dp a r t i ml e a s ts q u i r e t h e e v a l u a t i n gg u i d e l i n e so ft h ec a l i b r a t i o nm o d e l sa r ea l s op r e s e n t e d s e c o n d l y ，t h es u i t a b i l i t yo ft h em e t h o do fd e d u c t i n gb a c k g r o u n de r r o ri nt h e a q u e o u sm a t r i xi s s t u d i e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h em o d e l i n gp r e c i s i o n so f a n a l y t i c a lm o d e lh a v er a i s e d3 7 9 a n dt h ep r e d i c t a b l ep r e c i s i o n sh a v er a i s e d 2 2 5 a f t e rd e d u c t i n gt h eb a c k g r o u n de r r o ro fw a t e r s od e d u c t i n gt h e b a c k g r o u n de r r o ri nt h ea q u e o u sm a t r i xt oe l i m i n a t ep a r t i a l l yi n f l u e n c e so ft h e e x c u r s i o nt ot h ei n s t r u m e n ta n dt h es t r o n g a b s o r p t i o n o fw a t e rr a i s e st h e p r e c i s i o no fn e a r - i n f r a r e ds p e c t r u mm e a s u r e m e n t t h i r d l y ，t h es u i t a b i l i t yo ft h em e t h o do fd e d u c t i n gb a c k g r o u n de r r o ri nt h e m i l ki ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h em e t h o do fd e d u c t i n gb a c k g r o u n de r r o r c a n n o td e d u c te f f e c t i v e l yt h ee r r o ro ft h er e c i p r o c i t yo ft h eo t h e rc o m p o n e n t so f t h em i l kw h e nm e a s u r i n gt h ef a ta n dt h ep r o t e i ni nt h em i l k b u tw h e nm e a s u r i n g t h eg l u c o s ei nt h em i l k ，t h em o d e l i n gp r e c i s i o n so fg l u c o s em o d e lh a v er a i s e d 2 6 2 a n dt h ep r e d i c t a b l ep r e c i s i o n sh a v er a i s e d6 8 4 a f t e rd e d u c t i n gt h e l l b a c k g r o u n de r r o ro fp u r em i l k s od e d u c i n gt h ep u r em i l kb a c k g r o u n de r r o r w h e nm e a s u r i n gt h eg l u c o s ei nt h em i l kc a nd e d u c te f f e c t i v e l yt h ee r r o ro ft h e r e c i p r o c i t yo ft h eo t h e rc o m p o n e n t so f t h em i l ka n dr a i s e st h ep r e c i s i o no fn e a r 。 i n f r a r e ds p e c t r u mm e a s u r e m e n t l a s t l y ，t h es u i t a b i l i t y 0t h em e t h o do fd e d u c t i n gb a c k g r o u n de r r o ri nt h e b l o o dg l u c o s eo ft h eb o d ym e a s u r e m e n ti ss t u d i e d t h eo g t tr e s u l ts h o w st h a t t h em o d e l i n ga n dp r e d i c t a b l ep r e c i s i o n s o fa n a l y t i c a lm o d e la r e n tr a i s e d o b v i o u s l ya f t e rd e d u c t i n gf r o mt h eb a c k g r o u n d s ol o o k i n g f o ras u i t a b l e s t a n d a r dm a t t e ra sb a c k g r o u n dt oe l i m i n a t ep a r t i a l l yi n f l u e n c eo ft h ee x c u r s i o nt o t h ei n s t r u m e n ti si m p o r t a n tf o rt h en o n i n v a s i v em o n i t o r i n go ft h eb l o o dg l u c o s e k e y w o r d s n e a r - i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ，s p e c i a la n a l y s i s ，c a l i b r a t i o nm o d e l ， s u i t a b i l i t y ，d e d u c t i n gb a c k g r o u n de r r o r 1 i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁叠盘茔或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：屯酞民犯签字日期：如秽年月，伊日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解叁壅盘茔有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫盎盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名；际民狲 导师签名 荔诚是 签字日期：瑚箩年f 月f 5 日签字日期：如，年月f 厂自 第1 章绪论 1 1 近红外光谱分析技术 第1 章绪论 近红外光是指波长在7 8 0 n m - - 2 5 2 6 n m 范围内的电磁波【l 】。近红外光谱 的测量信息主要是含氮基团( 如c ，h ，0 h ，n h ，s - h 等) 分子振动的倍 频与合频吸收信息。不同基团产生的光谱在吸收峰位景和强度上有所不同， 根据朗伯比尔吸收定律( l a m b e r t b e e rl a w ) 1 2 1 ”，随着样品成份组成或者 结构的变化，其光谱特征也将发生变化。这是近红外光谱分析技术的理论基 础。由于近红外光谱含有丰富的物质分子结构信息，所以可用来分析绝大多 数种类的化合物及其混合物的成份浓度或其它物化性质。近红外光谱分析技 术是综合光谱学、化学计量学( c h e m o m e t r i c s ) 和计算机应用等多学科知识 的现代分析技术 4 1 。 近红外光谱分析技术的发展经历了以下几个主要阶段。1 8 0 0 年 h e r s c h e l 第一次发现了近红外区域【5 1 。1 9 世纪末，a b n e y 和f e s t i n g 在近红 外短波区域首次记录了有机化合物的近红外光谱【6 1 。1 9 2 8 年b r a c k e t t l 7 1 测得 第一张高分辨率的n i r 图，并对有关基团的光谱特征进行了解释。由于缺 乏可靠的仪器基础，5 0 年代以前，近红外光谱的研究只限于为数不多的几 个实验室中，而且没有得到实际应用。5 0 年代中期，k a y e l 8 1 首先研制出能 准确得到n i r 光谱的仪器，一些公司也相继开发了商业化的仪器。n o r r i s 等人在近红外光谱漫反射技术上所做的大量工作p 】，掀起了近红外光谱应用 的一个小高潮，近红外光谱分析技术在测定农副产品的品质方面得到了广泛 应用。进入6 0 年代中后期，由于经典近红外光谱分析技术暴露出灵敏度 低、抗干扰性差的弱点，加之各种新的分析技术的出现，使人们逐渐淡漠了 近红外光谱分析技术。8 0 年代中后期，随着计算机技术的发展和化学计量 学研究的深入，加之近红外光谱仪器制造技术的日趋完善，现代近红外光谱 分析技术因此也得到快速发展。 第1 章绪论 与其它常规分析技术不同，近红外光谱分析技术是一种间接测量技 术。它是应用化学计量学方法建立校正模型( c a l i b r a t i o nm o d e l ) ，从而实现 对未知样品的定性或者定量分析。主要步骤包括：选择有代表性的校正集 样本，并测量其近红外光谱；采用标准或已经认可的参考方法测定待测成 份的浓度( 物化性质) ，将其作为参考值；根据校正集样品的测量光谱和 被测的参考值，通过合理的化学计量学方法建立校正模型；测量未知待测 样品的近红外光谱，将其代入所建立的校正模型，计算得到待测样品的浓 度。 以化学计量学为基础的建模分析是近红外光谱分析技术中一个重要组 成部分。化学计量学是一门集化学、数学、统计学和计算机应用于一体的交 叉学科。它运用在计算机上实现的数学与统计学方法，优化测量过程，从化 学测量信号中最大限度地提取有用的化学信息，为复杂混合物的定性或者定 量分析提供了有力的工具，并在速度和准确度方面均得到很大的提高。近红 外光谱分析常用的化学计量学方法【l0 1 主要包括：偏最小二乘法( p l s ) 、主 成分回归( p c r ) 、主成分分析( p c a ) 等。 与传统分析技术相比，近红外光谱分析技术能在几秒至几分钟内，同 时测定样品中多种成份的浓度或性质参数；近红外光对物质的穿透能力较 强，无需对样品作任何预处理，可实现无损测量；另外，无需化学试剂，对 样品或者环境不会造成污染；近红外光子的能量比可见光还低，不会对人体 造成伤害。因此，近红外光谱分析技术具有高效、快速、成本低和绿色环保 等特点。近红外光谱分析技术不但可用于实验室分析，而且适用于现场检测 和实时在线分析。 目前近红外光谱分析技术应用领域非常广泛，主要包括：生命科学、 石油化工、冶金、农业、医药、轻工食品、环境保护等领域。近红外分析可 用于农产品中氨基酸、脂肪以及其它营养成份的品质分析，适合于育种、栽 培和农产品加工。在食品工业，可应用于牛奶1 、醋等物质的主要成份浓 度的现场检测。在石油化工领域，采用近红外光谱分析技术对被测物料的质 量参数( 如辛烷值、密度等) 进行在线分析，并与先进控制技术配合，进行 质量卡边操作，已产生巨大经济效益和社会效益。在生命科学领域，近红外 光谱分析可用于皮肤组织的水分、蛋白质和脂肪的测量，乳腺癌的检查，血 第1 章绪论 液的体积、血流速度、组织耗氧量以及血液中血红蛋白| 1 2 】、血糖【1 3 1 等成份 浓度的测定。其中，采用近红外光谱分析技术进行人体血糖浓度的无创伤检 测是目前世界瞩目的前沿课题之一。它不仅能够实现血糖浓度及时、安全、 无痛的自我监测，而且不需要消耗品，可大大降低测试费用，同时这一理论 方法的建立不仅适用于血糖，而且可以推广应用于体液中其它成份的无创伤 检测，对医学检测技术的发展具有重要的意义。 1 2 本课置研究的背景及意义 近红外区域的光谱特征决定了近红外光谱分析技术存在着一些技术难 点。就目前国内外近红外光谱分析的研究现状而言，虽然近红外光谱分析技 术的研究领域非常广泛，相关的研究论文和报道也比较多，但是能够成功地 解决实际测量中的技术难题，实现良好应用的案例并不多，尤其是对于复杂 的测量情况( 如牛奶成分的近红外光谱测量、人体血糖的近红外无创伤检 测) 。 近红外光谱分析技术面临的问题主要包括以下几点： ( 1 ) 由于近红外光谱区包括含氢基团不同级别的倍频和不同形式组合 的合频吸收，所以与中红外光谱相比，其谱峰较宽，谱峰重叠严重，而且吸 收强度较弱，光谱的信噪比低。因此，如何从复杂、重叠的光谱中提取微弱 的化学成份变化信息，提高测量精度，是近红外光谱分析技术中的一个技术 难点。 ( 2 ) 近红外光谱容易受到测量条件( 如温度、仪器) 、样品状态等外 界因素的影响，引起以系统误差为主的光谱不确定性。例如影响近红外吸收 峰位置的因素就有很多，如氧键的影响、温度的变化【1 ”。另外，很多其它 干扰信息，如散射、漫反射等现象引起的光谱变化都会被加载到样品近红外 光谱上。这些都使近红外光谱解析更加复杂化。 ( 3 ) 近红外光谱分析技术的应用需要化学计量学方法与检测技术、分 析仪器等专业知识的紧密结合 1 5 1 。然而目前理论研究与实际测量应用严重 脱节，建模方法的设计与优化均缺乏物理依据和理论指导。近红外光谱的分 析应该进一步从化学结构信息和数学建模方法两个角度综合提取模型的有用 第1 章绪论 信息，消除无关因素的影响，从而提高校正模型的稳健性和解释性。 ( 4 ) 由于红外光谱分析技术为“黑匣子”分析技术，化学计量学模型 比较复杂、抽象，物理意义不明确，因此需要对数学模型中重要的品质因数 ( 如回归系数、灵敏度、选择性、检测极限) 的意义进行分析，以帮助明确 影响系统构成的主要因素和系统特征，并可以判断近红外光谱测量过程是否 受到外界干扰因素的影响、建立的模型是否与待测成分的性质真正相关，为 测量结果的误差分析和测量方法、测量条件的优化提供物理依据。 这一系列技术难点原因是近红外光谱的信息来源于分子内部振动的倍 频和合频，其集中体现在复杂自然物的近红外分析是属于从复杂、重叠、变 动的光谱中来提取弱信息的技术。所谓复杂是指背景信息复杂；重叠是指谱 峰重叠，譬如c h 伸缩振动与弯曲振动的含频可能与n h 与0 一h 振动的合 频吸收重叠在一起，而c h 倍频的合频可能与c h 二倍频与o h 倍频吸收 重叠在一起等等；变动是指近红外光谱受仪器状态、外部环境等因素的影响 较大；弱信息是指其吸收强度较低。 近红外分析技术必须应用化学计量学的方法来建立相应的校正模型来 解决上述困难。因此，建立正确的校正模型是进行近红外光谱测量的关键。 近红外光谱分析技术是通过校正集样本的光谱信息、基础测量方法测定的化 学组成或理亿性质结合的化学计量学方法建立分析模型进行测量的技术，因 此，在近红外光谱分析中，用己建立的定最校正模型对未知样品的组成或性 质进行测量时，对分析模型的适用性做出判断是非常重要的，是判断测量的 结果是否与基础方法的结果一致的重要前提。 本课题研究的目的是在进行近红外光谱测量时，通过扣除背景的方法 来扣除被测样品的组分之间的相互干扰误差、光谱仪的漂移误差等因素的影 响以提高光谱测量的准确性，从而保证校正模型的适用性和稳健性，提高近 红外光谱测量的精度。 1 3 本文的主要研究内容 本文的主要研究内容如下 4 第1 章绪论 ( 1 ) 扣除背景方法原理及分析 本文第二章首先从分子振动与近红外光谱、近红外吸收光谱以及近红 外光谱分析与朗伯一比尔定律三个方面介绍了近红外光谱的测量原理，然后 从双光路补偿和扣标准液方法上对扣除背景方法的原理进行介绍，最后介绍 了近红外光谱的多元数据分析方法：多元线性回归( m l r ) 、主成分回归 ( p c r ) 以及偏最小二乘( p l s ) ，并给出了校正模型的评价指标。 ( 2 ) 扣除背景方法的实验研究 本文第三章采用扣除背景的方法对葡萄糖水溶液、牛奶溶液以及人体 血糖无创伤检测进行实验研究，以验证扣除背景方法的适用性。在采用近红 外光谱分析技术测量葡萄糖水溶液中葡萄糖浓度时，选取水作为标准液，讨 论扣除背景方法是否会提高校正模型的预测精度以及增强模型的适用性。在 测量牛奶中的脂肪、蛋白和葡萄糖浓度时，采用纯牛奶作为标准液，讨论了 扣除背景方法的适用性。最后在人体血糖无刨检测方面，采用2 0 的标准 反射板作为标准物，通过o g t t 实验来研究扣除背景方法的适用性。 釜：苎垫塑冀塞查鎏矍塞垒坌丝 2 1 概述 第2 章扣除背景方法原理及分析 现代近红外光谱以其分析速度快、成本低、不消耗样品、易于实现在 线分析等鲜明的特点，芷得到越来越广泛的应用，并成为近年来发展最快的 分析测试技术之一【l “。近红外谱区的吸收是由于分子振动的倍频或合频吸 收所造成的，因此，近红外光谱带中大量的是重叠峰和肩峰，所以精确近红 外谱带的归属很困难。另外，影响近红外谱带位置变化的因素也较多，如氢 键的影响、溶液稀释和温度的变化等。对于固体样品很多其它信息。如散 射、漫反射、特殊反射、表面光泽、折射指数和反射光的偏振等都被加载到 样品近红外光谱上。这些都使近红外光谱解析复杂化。 正是近红矫光谱具有上述特征，赋予了近红外光谱分析一些独特魅 力，如近红外可以不经预处理，直接检测各种类型的样品，除液体样品外， 还可检测粉末、纤维、糊状、乳状等形式样品。同时，构成近红外谱带的背 景复杂，从近红外提取的是微弱信息，必须依靠化学计量学的手段建立光谱 与样品物化性质( 如浓度) 之间的多元校正模型，然后通过校正模型实现对 未知样品性质的定量或定性分析 1 7 1 。因此，建立正确的校正模型是对未知 样品准确分析的前提。近红外光谱分析方法流程图如图2 - 1 f l ”。 样品准确分析的前提。近红外光谱分析方法流程图如图2 - 1 【l ”。 图2 1 方法流程图 第2 章扣除背景方法原理及分析 2 1 概述 第2 章扣除背景方法原理及分析 现代近红外光谱以其分析速度快、成本低、不消耗样品、易于实现在 线分析等鲜明的特点，正得到越来越广泛的应用，并成为近年来发展最快的 分析测试技术之一 1 6 1 。近红外谱区的吸收是由于分子振动的倍频或合频吸 收所造成的，因此，近红外光谱带中大量的是重叠峰和肩峰，所以精确近红 外谱带的归属很困难。另外，影响近红外谱带位置变化的因素也较多，如氢 键的影响、溶液稀释和温度的变化等。对于固体样品很多其它信息，如散 射、漫反射、特殊反射、表面光泽、折射指数和反射光的偏振等都被加载到 样品近红外光谱上。这些都使近红外光谱解析复杂化。 正是近红外光谱具有上述特征，赋予了近红外光谱分析一些独特魅 力，如近红外可以不经预处理，直接检测各种类型的样品，除液体样品外， 还可检测粉末、纤维、糊状、乳状等形式样品。同时，构成近红外谱带的背 景复杂，从近红外提取的是微弱信息，必须依靠化学计量学的手段建立光谱 与样品物化性质( 如浓度) 之间的多元校正模型，然后通过校正模型实现对 未知样品性质的定量或定性分析 1 7 1 。因此，建立正确的校正模型是对未知 样品准确分析的前提。近红外光谱分析方法流程图如图2 10 8 。 图2 - 1 方法流程图 第2 章扣除背景方法原理及分析 正确的校正模型是准确分析的前提，而影响近红外光谱的因素很多，如 样品的组分之间的相互作用、光谱仪的影响1 1 9 ( 检测器噪声环境对基线的 影响) 等，人为、环境或者仪器的突变必然在很大程度上破坏样品的光谱， 这些因素都可以作为背景因素，必须将这些影响光谱测量的背景因素进行扣 除，以提高光谱测量的准确性，从而保证校正模型的适用性和稳健性。 本章接下来首先介绍近红外光谱的测量原理，然后对扣除背景方法的 原理进行介绍，最后介绍了建立校正模型的多变量回归方法。 2 2 近红外光谱测量原理 2 2 1 分子振动与近红外光谱 近红外光谱属于分子吸收光谱，即物质在近红外光谱区的吸收主要是 由于分子振动状态的变化或者按量子的观点是分子的振动状态在不同振动能 级之间的跃迁而形成的【2 0 1 。由量子力学的相关理论【2 1 1 ，分子振动的频率包 括基频、各级倍频与各种合频1 2 朝。分子吸收红外辐射后，由基态振动能级 ( n = o ) 跃迁至第一振动激发态( n = 1 ) 时，所产生的吸收峰称为基频峰。 因为( 振动量子数的差值) n = l 时，n l = n ，所以基频峰的位置( n l ) 等于 分子的振动频率。在红外吸收光谱上除基频峰外，还有振动能级由基态 ( n = o ) 跃迁至第二激发态( n = 2 ) 、第三激发态( n = 3 ) ，所产生的 吸收峰称为倍频峰。由于分子非谐振性质，各倍频峰并非正好是基频峰的整 数倍，而是略小一些。除此之外，还有合频蜂( n l + n 2 ，2 n l + n 2 ，) ， 差频峰( n 1 n 2 ，2 n 1 n 2 ，) 等，这些峰多数很弱，一般不容易辨 认。倍频峰、合频峰和差频峰统称为泛频峰。所有近红外光谱的吸收谱带都 是中红外吸收基频( 4 0 0 0 1 6 0 0 c m _ 1 ) 的倍频及合频。图2 2 为分子中能级 示意图。 7 第2 章扣除背景方法原理及分析 、， 一 - - - - _ 图2 2 分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图 2 2 2 近红外吸收光谱 红外光谱技术是对有机物进行定性、定量和结构分析的有效手段之 一。和其它光谱技术相比，红外光谱技术的优势在于绝大多数有机物在红外 波段均有吸收。早在上个世纪中页，两位红外光谱的先驱者s u t h e r l a n d t 2 3 l 和 t h o m p s o n t “】就认为各种化合物的红外光谱是该化合物最具特色的性质。近 红外光谱技术定量分析是通过对特征吸收谱带强度的测量来求出组份含量： 当样品受到频率连续变化的近红外光照射时，分子吸收某些频率的辐射，产 生分子振动能级和转动能级从基态到激发态的跃迁，使相应于这些吸收区域 的透射光强度减弱，记录近红外光的百分透射比与波数或波长关系曲线，就 得到近红外光谱。近红外光谱分析技术通过己知样品的光谱与组成或性质相 关联，用化学计量学中的多元校正方法建立校正模型，然后根据模型和未知 样品的光谱预测未知样品的组成或性质，是一种间接测量技术【2 ”。 2 2 3 近红外光谱分析与朗伯一比尔定律 光与介质发生作用时，除发生光的反射现象和折射现象，还将发生光 的吸收现象。近红外光谱用于物质组成的定量分析就是基于物质组成的分予 第2 章扣除背景方法原理及分析 _ i _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ j _ e _ _ | _ _ _ _ _ ! 目_ | 自_ 一 对红外光的吸收作甩，其理论依据是朗伯比耳定律。对大多数介质，当光 在介质中经过一段距离后，部分光能转化为热能、电能或化学能形式。换言 之，光已被物质吸收。关于光的吸收机理，涉及到物理光学、生物光学等许 多领域的理论，有的甚至尚未完全搞清楚。 茹 盯 i 州 l 噜 l 譬l + - - + 1 l 图2 - 3 光在均匀介质中的传播 朗伯能量定律认为强度为i 的光在均匀物质中通过一段距离x 后，在 出的距离内，物质吸收光强度以是均匀的，其数学表达式为 2 6 1 ： d a k = 口。，( 2 一1 ) 解此微分方程有： = l o e “。 ( 2 - 2 ) 其中： j 。：入射辐射强度 j ：透过辐射强度 口。：物质的光衰减系数 ，： 光透过的距离 将公式( 2 2 ) 取常用对数有 l n ( i o i , ) = 口。f ( 2 - 3 ) 比尔研究了朗伯定律在液体吸收时的实际情况时发现，光通过溶液层 厚度一定且均匀的可吸收光的溶液时，光强度的减弱与溶液浓度的增加c 和入射光强度成正比： 埘，o i t ) = d 2 c ( 2 - 4 ) 两定律合并，即称为朗伯一比尔定律，可以将它看作是上述分子振动 原理的宏观表示，对于含n 种成分的混合溶液而言，其完整的数学表示式 为： 9 第2 章扣除背景方法原理及分析 a = l n ( 1 0 i ，) = l n ( 1 t ) = a 。( 五) = 口。( x ) c o l ( 2 5 ) 其中： ” a ：吸光度，是波长的函数 g ：成分拧的浓度( m g d l ) 上：吸收层厚度( m ) ：成分n 的吸光系数( m g d l m ) 扎透过率= 而 吸光系数，是物质本身的固有性质。实验证明，不同浓度的同一物质 在相同波数处具有相同的吸收系数；对于每一物质，不同波数处其吸光系数 不同。 朗伯比尔定律的适用条件为： ( 1 ) 吸收过程中，如果组成物质的各成分之间无相互作用，则各成分 的吸光度具有可加合性； ( 2 ) 辐射与物质的作用仅限于吸收过程，无荧光、散射光等化学现 象： ( 3 ) 吸收物是一种均匀分布的连续体系。 2 3 扣除背景方法 采用进行近红外光谱测量时，在建立校正模型之前，必须先将影响近 红外光谱的背景因素( 仪器的漂移、样品各组分之间的相互作用) 扣除，以 提高模型的有效性和适用性。因此，本文接下来提出了双光路补偿加扣标准 液以扣除背景因素影响的方法。 2 3 1 双光路补偿法 在进行近红外光谱测量时，仪器的状态、测量的环境包括温度、湿 度、噪声等无时无刻不在改变，而这些因素都不可避免地影响样品的近红外 光谱，从而影响模型的有效性和适应性。 本文中，在进行近红外光谱测量时，我们使用的光谱仪器是本课题组 1 0 第2 章扣除背景方法原理及分析 自行研制的第二代血糖仪，仪器采用的是双光路系统，目的就是为了补偿由 于仪器本身漂移带来的测量误差。下面对第二代血糖仪系统进行介绍。 图2 - 4 第二代血糖仪测量系统总体框图 ( 注：图2 - 4 仅代表采用第二代血糖仪对液体进行透射测量时的情况) 如图2 4 所示，光谱测量系统采用1 0 0 w 钨灯作为近红外光源；分光元 件为a o t f ( 声光可调谐滤波器) 分光系统，分光范围为1 1 0 0 n m 1 7 0 0 n m ， 分为5 0 个波长点；系统采用双光路法进行光谱测量，光信号由两个带半导 体制冷器的i n g a a s 检测器检测。光纤为两根透射光纤，其中一根光纤为两 分叉光纤，即分为两路，一路不经过样品直接进入参考路检测器( r ) ，另 一路连在样品池的一端作为入射光纤，另一根光纤连在样品池的另外一端作 为出射光纤，出射光纤连到测量路检测器上( m ) 。m 、r 的电压信号由多 通道数据采集卡n ip c i m i o 1 6 x e 5 0 进行采集f 2 ”。 在图2 - 4 仪器系统中，进入参考路中的光是为了修正仪器漂移引起的误 差。本课题组倪勇博士对双光路的补偿1 2 8 1 效果进行了评价，结果表明当仪 器状态改变时，参考光路和测量光路同步线性变化，且线性度很高( 均大于 0 9 9 7 ) ，因此采用双光路补偿方法可以在很大程度上消除仪器本身漂移带来 的影响，提高测量精度。 2 3 2 扣标准液法 采用双光路补偿方法在很大程度上消除仪器本身漂移带来的影响，但 第2 章扣除背景方法原理及分析 是却不能够消除由于被测样品中其他成分之间的相互作用而引起光谱变化的 影响。因此，我们提出了一种扣除标准液的方法来扣除样品中其他成分之间 相互作用带来的影响。 扣除标准液的方法，即相对于待测样品，找到一种性质跟待测样品相 似，浓度恒定的标准液作为背景，在测量被测样品之前，先测一组作为背景 的标准液样品以观察仪器的漂移情况，然后用测量到的待测样品的近红外光 谱去扣除作为背景的标准液的近红外光谱，以消除待测样品中其他成分相互 作用带来的影响，提高光谱测量的精度，从而提高模型的预测精度及适用 性。 2 3 3 扣背景方法的数据处理 本文中，采用扣除背景的方法进行近红外光谱测量实验时，实验步骤及 数据预处理方法如下： ( 一) 实验步骤： 1 仪器稳定，室内及样品池温度稳定到设定的温度，样品提前放入实验 塞： 2 测量程序启动，自动连续进行光谱采集； 3 进样标准液样品； 4 测量标准液的光谱，并记录下该有效光谱文件的序号； 5 进样任意一个被测样品i 6 濑4 量被测样品的光谱，并记录下该有效光谱文件的序号； 7 重复步骤3 - 6 ，直到测量完全部样品： ( 二) 实验数据的预处理方法： 1 求取每个样品的每条光谱的r a t i o 值( m r ) 。 2 求取每个被测样品中8 条光谱r a t i o 值的平均值r a t i o g k 和每个标准 液样品中8 条光谱r a t i o 值的平均值r a t i o w k 。 3 用每个被测样品的r a t i o g k 除以其相应的背景标准液样品的 r a t i o w k ，得到该被测样品的r a t i o r k 。 4 分别用r a t i o g k 以及r a t i o r k 数据建模分析。 1 2 第2 章扣除背景方法原理及分析 自l _ - _ _ _ _ _ _ - - _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ 自i _ _ _ i _ _ _ _ _ _ _ _ - 自j l 目_ _ _ - - - _ _ - _ _ - _ _ _ - _ - _ _ _ 衄 2 4 近红外光谱的多元数据分析方法 近红外光谱定量分析的理论依据是朗伯一比尔定律。然而实际体系中由 于测得的光谱数据不仅包括了被测样品的组成和结构信息，还包括了噪音， 即测量误差与不同组分之间的干扰等【1 4 】，这些因素的影响使得产生的吸光 度并非满足线性叠加关系，因此简单的线性回归和建立联立方程的方法不适 用定量分析。化学计量学是近红外光谱分析的有力工具，它可以有效的剔除 噪音，实现混合物多成分的同时定量分析。 定量校正模型的建立是化学计量学的核心技术，通过对样品光谱和其 质量参数进行关联，建立预测模型，运用预测模型和未知质量参数的样品光 谱来预测未知样品的组成和性质。可靠的定量模型的建立是对样品的组成或 性质做出准确预测的前提 2 9 - 3 1 ，因此定量校正方法的研究一直是红外光谱 分析中的一个核心问题。常见的多元校正方法有多元线性回归( m l r ) 、主 成分回归( p c r ) 以及偏最小二乘( p l s ) 等。 2 4 1 多元线性回归方法( m l r ) 多元回归模型一般分为两种，一种是经典模型( c l a s s i c a lm o d e l ) ，适用 于白色分析体系；另一种就是逆模型( i n v e r s em o 1 ) ，适用于灰色或黑色分 析体系，物质的物化性质看作是仪器响应的函数。近红外光谱不能满足 经典模型的要求，一般采用逆模型。m l r 、p c r 和p l s 等都属于逆模型。 遵从化学计量学的一般表述，在下文中，x 光谱矩阵用表示，样品浓度用y 或者j ，表示( y 用于单组分，l ，用于多组分) ，玎为样品数，p 为波长( 变 罴) 数。 多元线性回归的一般表示为： y = x b + e 其中y = 【_ y l ，y 2 ，y 。】7 为浓度参考值 为光谱数据，e 为残差。 ( 2 6 ) b 为模型回归系数，x = 【x 1 ，x 2 ，z 。】 该模型的解有三种情况：1 ) 当p n ，即变量数大于样本数，b 有无穷 多个解；2 ) 当p = 甩，如果满秩，有唯一解；3 ) 当p 0 ，两者呈正比关系，叫正相关；r 0 两者星负 相关；r 的值接近于0 ，两者没有线性相关关系。斤的计算公式为： r = ( 2 1 7 ) 三、预测集样本的标准偏差( 均方根预测误差r m s e p ) ： 胄m s e p ：属莩( 2 - 1 8 ) 其中： n ：建模用的样品数 四、变异系数( c v j 值 1 7 第2 章扣除背景方法原理及分析 盯= c v ：曼 i 其中，标准差口刻画测量重复性绝对离散程度的指标 是刻画测量重复性相对离散程度的指标 4 0 - 4 1 1 。 2 5 本章小结 ( 2 1 9 ) ( 2 2 0 ) 变异系数c v 值 本章首先介绍了近红外光谱测量的基本原理：包括分子振动和近红外 光谱的相关基本知识，近红外光谱吸收与分子振动间的关系和基本定律，近 红外光谱的基频、倍频和合频吸收产生的原因、近红外光谱定量分析的理论 基础朗伯一比尔定律。 本章接着对扣除背景的方法的原理进行了介绍：包括了双光路补偿法 和扣标准液法。最后，本章介绍了常用的多变量回归方法以及校正模型的评 价指标等。 第3 章扣除背景方法的实验研究 第3 章扣除背景方法的实验研究 上一章对扣除背景方法的原理作了介绍，本章将采用扣除背景的方法 对葡萄糖水溶液、牛奶溶液以及人体血糖无创伤检测进行实验研究，以验证 扣除背景方法的适用性。 3 1 蕾萄糖水溶液实验研究 3 1 1 水背景的选择 葡萄糖伸缩振动能产生很强的合频和倍频吸收带。葡萄糖水溶液的近 红外光谱的测量有吸收峰，葡萄糖的光谱是唯一的，但葡萄糖红外区的合频 和倍频光谱与水吸收波段的几个合频和倍频频率相互重迭，即被水的光谱所 覆盖。这是葡萄糖水溶液近红外光谱测量的主要干扰 4 2 - 4 3 1 。水、葡萄糖的 近红外吸收光谱如图3 - 1 、3 - 2 所示。 图3 1 水的近红外光谱图3 - 2 葡萄糖的近红外吸收光谱 因此，我们在测量葡萄糖水溶液中的葡萄糖浓度时，为了降低水的强 吸收带来的干扰，我们选择的标准液为水。 1 9 第3 章扣除背景方法的实验研究 本文的实验所采用的仪器是本课题组自行研制的第二代血糖仪，仪器采 用的是双光路系统，而有关双光路补偿的效果本课题组倪勇博士已经给出了 实验验证。因此，本文中扣除背景的影响主要是针对扣除标准液背景的影 响。 为了研究扣除水背景对仪器精度的提高，我们设计了如下的实验：配 制1 l 葡萄糖浓度为1 0 0 m g d l 的葡萄糖水溶液、1 l 的蒸馏水，分别作为被 测样品及背景样品在第二代血糖仪上进行透射光谱测量，样品采用蠕动甭进 样，测量的方法为在测量每一组糖水样品的光谱之前，先测量一组作为背景 的蒸馏水的光谱，重复进样1 5 次。 采用扣除背景数据处理方法对测量后的光谱数据进行处理，由于测量 的是定浓度的葡萄糖水溶液，因此仅对r a t i o o k 和r a t i o r k 的数据进行比 较，来评价扣除水的背景影响后，是否会提高光谱数据测量的精度。数据处 理结果如下： g 0 。0 0 9 几 帆 衍 。0 “0 g 7 7 1v v l 00 0 5 t 0 。0 0 4 3 ， n t 1 一 e o o o0 0 0 7 n 疋i 00 # 妙归舻 00 0 0 5 图3 - 3 扣除水背景前重复进样精度图3 4 扣除水背景后重复进样精度 由图3 - 4 可知，对葡萄糖浓度为1 0 0 m g d l 的葡萄糖水溶液进行1 5 次重 复测量，在扣除水的背景后，得到的1 5 组光谱数据的重复性精度( c v 值) 为o 0 0 0 4 0 0 0 0 7 ，而在没有扣除水的背景时，得到的1 5 组光谱数据的重复 性精度为0 0