（药理学专业论文）环酰亚胺类肽候选药物24fcip13f抗肿瘤作用研究.pdf

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2 凋亡的影响2 8 2 9a n n e x i nv p i 双染测定细胞凋亡2 9 2 1 0w e s t e r nb l o t t i n g 实验法测定凋亡相关蛋白水平。2 9 2 1 12 4 f 对h l - 6 0 细胞增殖周期的影响2 9 3 统计学方法3 0 实验结果3 1 1 2 4 f 对肿瘤细胞a p n c d l 3 酶活性的抑制作用3 1 2 2 4 f 对肿瘤细胞生长抑制作用3 2 3 2 4 f 抑制e s 2 细胞侵袭与游走3 3 4 2 4 f 对裸鼠接种e s 2 肿瘤的生长抑制作用3 3 5 w e s t e r nb l o t t i n g 法评价2 4 f 对e s 2 表达a p n c d i3 抑制作用3 4 6 流式细胞术法检测2 4 f 对肿瘤细胞表达a p n c d l 3 抑制作用3 5 7 2 4 f 诱导肿瘤细胞凋亡3 7 7 12 4 f 对e s 2 细胞形态的影响3 7 7 22 4 f 对h l 6 0 和e s 2 细胞凋亡率的影响3 7 7 32 4 f 提高凋亡相关蛋白表达水平3 8 8 w e s t e r nb l o t t i n g 检测2 4 f 对e s 2 细胞v e g f 表达的抑制作用3 9 9 2 4 f 对h l - 6 0 细胞增殖周期的影响4 0 论4 3 论4 7 考文献。4 8 广一 山东大学硕士学位论文 _ _ - o o 。i - - _ _ _ _ _ _ _ - 。_ - _ _ - - _ _ - _ _ - - - _ _ _ _ _ - - - _ _ _ 。_ - - _ - - _ _ - _ _ - _ - - - - _ _ i _ _ - _ _ - _ _ _ - - - - _ _ _ - _ _ - _ _ _ i _ _ _ - - - - _ - - _ _ - - _ _ _ _ _ - _ _ - - - _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ - _ _ _ - - _ _ - _ _ _ _ _ _ _ 一 第二部分i f n - f f 对人自血病细胞a p n c d l 3 表达的调节作用研究5 4 前言。5 4甘舌5 4 材料和方法。5 4 1 实验材料5 4 2 实验方法5 5 2 1 i f n 吖对肿瘤细胞生长抑制实验5 5 2 2i f n - 丫对肿瘤细胞a p n c d l 3 酶活性的影响5 5 2 3 流式细胞术检测玎矾吖对肿瘤细胞a p n c d l 3 表达实验5 6 2 4i f n - 丫对肿瘤细胞a p n c d l 3m r n a 的影响5 6 3 统计学方法5 7 实验结果5 8 1 i f n 吖对肿瘤细胞生长抑制作用5 8 2 m n 吖对肿瘤细胞a p n c d l 3 的上调节作用5 8 3 i f n 丫提高肿瘤细胞a p n c d l 3 表达水平5 9 4 i f n 吖上调肿瘤细胞a p n c d l 3m r n a 表达水平6 1 讨论6 2 结论。6 3 参考文献。6 4 翌i 谢。6 6 攻读硕士学位期间发表论文。6 7 山东大学硕士学位论文 c o n t e n t s a b s t r a c ti nc h i n e s e 7 a b s t r a c t 9 s y m b o l i cd e s c r i p t i o n 1 2 p a r tl ：2 4 f , an o v e lg a h o y lc y c l i c - i m i d ed e r i v a t i v e s ，i n h i b i t st u m o rg r o w t hv i a d e c r e a s eo fa p n c d l 3 1 4 p r e f a c e 1 4 1 a m i n o p e p t i d a s en 1 5 1 1t h ee x p r e s s i o na n dm o l e c u l a rs t r u c t u r eo f a p n c d l 3 1 5 1 2t h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no f a p n c d l 3 。1 6 1 2 1t h er o l eo f a p n c d l 3i nt h eb l o o dc e l l s 1 6 1 2 2a p n c d l 3a n da n g i o g e n e s i s 1 7 1 2 3a p n c d l 3a n di m m u n er e s p o n s e 1 8 1 2 4a p n c d l 3a n dc e l ls u r f a c er e c e p t o r 1 8 2 t h er e l a t i o nb e t w e e na p n ，c d l 3a n dt u m o r 1 9 2 1i n c r e a s e di n v a s i o na n dt u m o rm e t a s t a s i s 1 9 2 2t h ep r o m o t i o no fp r o l i f e r a t i o na n di n h i b i t i o no fa p o p t o s i s 19 3 1 1 1 er e s e a r c ho fa m i n o p e p t i d a s ei n h i b i t o r , s 2 0 3 1c d l 3i n h i b i t o r s 。2 0 ：；2c d l 3m o n o c l o n a la n t i b o d y 2 0 3 3c d l3l i g a n d s 2 0 4 g a l l o y lc y c l i c - i m i d ed e r i v a t i v e sd r u g s 2 1 4 1t h ed e s i g no f g a l l o y lc y c l i c - i m i d ed e r i v a t i v e sd r u g s 2 1 4 2s y t h e s i so f3 - ( 2 - a n l i n o s u b s t i t u t e da c e t a m i d e ) - 2 ，6 - p i p e r i d i n e d i o n e - n a c e t i ca c i dd e r i v a t i v e sa n d2 4 e 2 2 r e s e a r c hw o r k 4 2 4 m a t e r i a l sa n dm e t h o d s ：1 4 1 m a t e r i a l s ：! 4 山东大学硕士学位论文 2 1e f f e c t so f 2 4 fo na p n c d l 3a c t i v i t y 2 6 2 2m t r a s s a y 2 7 2 3t r a n s w e l la s s a y 2 7 2 4e f f e c t so f2 4 fi ne s 一2i n n o e u l a t i n gn u d em i c e 2 7 2 5d e t e c t i o no fa p n c d l3e x p r e s s i o nv i aw e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i s 2 8 2 6d e t e c t i o no fa p n c d l3e x p r e s s i o nv i af l o wc y t o m e t r y 2 8 2 7d e t e c t i o no fv e g fe x p r e s s i o nv i aw e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i s 2 8 2 8h o e c h s t3 3 2 5 8s t a i n i n g 2 8 2 9a n n e x i nwp ia p o p t o s i sd e t e c t i o n 2 9 2 10d e t e c t i o no fa p o p t o s i sc o n c e r n e dp r o t e i ne x p r e s s i o nv i aw e s t e r n b l o t t i n ga n a l y s i s 2 9 2 11c e l lg e n e r a t i o nc y c l ea s s a y 2 9 3 s t a t i s t i c sm e t h o d s 3 0 r e s u l t s 3 1 1 d e c r e a s eo f a p n c d l 3a c t i v i t yi nh l 一6 0a n de s 一2c e l l s 3 1 2 c y t o t o x i c i t yo f 2 4 fo ng r o w t ho f t u m o rc e l l s 3 2 3 t r a n s w e l la s s a y 3 3 4 i n h i b i t i o no f2 4 fo ne s - 2i n o c u l a t e dn u d em i c e 3 3 5 i n h i b i t i o no fa p n c d13e x p r e s s i o nv i aw e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i s 3 4 6 i n h i b i t i o no f a p n c d l 3e x p r e s s i o nv i af l o wc y t o m e t r y 3 5 7 t h ee f f e c to f2 4 fo nt u m o rc e l l sa p o p t o s i s 3 7 7 1t h ee f f e c to ne s - 2m o r p h o u s 3 7 7 2t h ee f f e c to na p o p t o s i sr a t i oo fh l - 6 0a n de s - 2c e l l s 3 7 7 32 4 fc a l li n c r e a s ee x p r e s s i o no f a p o p t o s i sc o n c e r n e dp r o t e i n 3 8 8 i n h i b i t i o no fv e g fe x p r e s s i o nv i aw e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i s 3 9 9 t h ee f f e c to f 2 4 fo nh l - 6 0c e l l sg e n e r a t i o nc y c l e 4 0 d i s c u s s i o n 4 3 c o n c l u s i o n a 7 r e f e r e n c e s 5 山东大学硕士学位论文 p a r t2t h er e g u l a t i o no fi f n - tt oa p n c d l 3 。一。- 一一”一”5 4 p r e f a c e 5 4 m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 。s 4 1 m a t e r i a l s 5 4 2 m e t h o d s 5 5 2 1 】册a s s a y 5 5 2 2a p n c d l 3a c t i v i t ya s s a y 5 5 2 3d e t e c t i o no fa p n c d13e x p r e s s i o n sb yf l o wc ) ，t o m e t r y 5 6 2 4r e a l t i m ep c r 5 6 3 s t a t i s t i c sm e t h o d s ! i 7 r e s u l t s 。一。5 8 1 e f f e c t so fi f n - yo n ：i e l lg r o w t h 5 8 2 i n c r e a s eo f a p n c d l 3a c t i v i t yi nh l - 6 0a n dk 5 6 2c e l l s 。5 8 3 i n c r e a s eo fa n w c d l 3e x p r e s s i o ni nh l 广6 0a n dk 5 6 2c e l l s 5 9 4 i n c r e a s eo fa p n c d l 3m r n ai nh l - 6 0a n dk 5 ；6 2c e l l s 6 1 d i s c u s s i o n 6 2 c o n c l u s i o n 。6 3 r e f e r e n c e s 6 4 a c k n o w l e d g e m e n t s 6 6 p u b f i c a t i o n s 6 7 6 山东大学硕士学位论文 第一部分 类肽候选药物2 4 f ( c i p - 1 3 f ) 抗肿瘤作用研究 研究生：张晓帆 导师：曲显俊教授 中文摘要 研究背景：肿瘤细胞高表达氨肽酶n ( a p n c d l 3 ) 并降解细胞外基质，促进癌 细胞增殖与转移，a p n c d l 3 是药物设计与治疗的重要靶酶。基于a p n c d l 3 结构特点，我们设计合成了多系列的环酰亚胺小分子类肽化合物。通过筛选，发 现化合物2 4 f ( 或称c i p 1 3 f ) 具有较高活性，具有继续研究成为创新性药物 。一 的价值。 实验方法：以l 广亮氨酸对硝基苯胺底物法分析2 4 f 对肿瘤细胞a p n c d l 3 酶 活性的抑制作用；分别以免疫流式细胞术和w e s t e r nb l o t t i n g 法检测a p n c d l 3 表达水平；以m t r 法评价2 4 f 对癌细胞增殖抑制作用；以t r a n s w e l lc h a m b e r 法观察2 4 f 对肿瘤细胞增殖和游走能力抑制作用；以裸鼠移植人卵巢癌细胞 e s 2 模型，尾静脉注射给药评价2 4 f 的抗肿瘤活性。分别以h o e c h s t3 3 2 5 8 染 色法、a n n e x i n i 法检测2 4 f 对肿瘤细胞凋亡作用；以w e s t e r nb l o t t i n g 法 检测凋亡相关蛋白表达水平，包括c l e a v e de a s p a s e - 3 和c l e a v e dp a r p ( p o l y a d p r i b o s ep o l y m e r a s e ) ：以碘化丙啶染色流式细胞术法评价2 4 f 对肿瘤细胞增 殖周期的影响；以w e s t e r nb l o t t i n g 法测定了2 4 f 对肿瘤细胞内皮生长因子 v e g f 的抑制作用。 实验结果：2 4 f 对高表达a p n c d l 3 的白血病细胞h l - 6 0 和卵巢癌细胞e s 2 a p n c d l 3 活性抑制作用较强，以5 0 0 t t m o l l 剂量孵育6 0r a i n ，其抑制率分别 为5 2 5 和6 1 7 。2 4 f 对低表达a p n c d l 3 的s k o v 3 ，p l c p r f 5 和 7 山东大学硕士学位论文 e c v 3 0 4 细胞表面酶活性抑制作用较弱。2 4 f 对体外生长的h l - 6 0 和e s 2 细 胞的增殖具有一定的抑制作用，并明显抑制e s 2 细胞穿过人工基底膜能力。2 4 f 对裸鼠体内生长的e s 2 肿瘤具有较强的抑制作用，分别以1 0 ，5 0 m g k g 剂量 尾静脉注射给药2 周，对肿瘤生长抑制率分别为31 0 和3 8 0 。以w e s t e r n b l o t t i n g 及流式细胞术检测2 4 f 对肿瘤细胞a p n c d l 3 表达水平，发现2 4 f 对体内生长的e s 2 肿瘤组织a p n c d l 3 表达抑制作用较强。2 4 f 诱导e s 2 和h l 一6 0 细胞凋亡，荧光显微镜发现典型细胞凋亡形态，流式细胞术发现其凋 亡比例增加，其作用机制可能与其诱导凋亡相关蛋白d e a v e dc a s p a s e , - 3 和 c l e a v e dp a r p 水平升高有关。通过流式细胞术检测细胞周期发现，2 4 f 能使 h l 6 0 细胞停滞于g o g 1 期，阻止细胞进入g 2 m 期。另外，w e s t e r nb l o t t i n g 结果显示，2 4 f 能降低e s 2 细胞的v e g f 表达水平。 结论：环酰亚胺类肽化合物2 4 f 具有较强的抗癌活性，其机制可能与其抑制 a p n c d l 3 活性和表达水平有关，通过降低肿瘤细胞a p n c d l 3 酶活性和表达 水平，抑制肿瘤细胞增殖；2 4 f 诱导肿瘤细胞凋亡可能与其抑制a p n c d l 3 活 性和表达水平有相关性，因而产生较强的抗癌活性。 关键词：环酰亚胺类肽化合物：2 4 f ( c i p 1 3 f ) ：候选药物；抗肿瘤作用；a p n c d l 3 ； 凋亡 8 山东大学硕士学位论文 2 4 f ( c i p 一1 3 d ，an o v e lg a l l o y lc y c l i c i m i d ed e r i v a t i v e s ， i n h i b i t st u m o rg r o w t hv i ad e c r e a s eo fa p n ，c d l 3 s t u d e n t ：x i a o f a nz h a n g s u p e r v i s o r ：p r o f x i a n - j u nq u a b s t r a c t b a c k g r o u n d s ：a m i n o p e p t i d a s en ( a p n c d 13 ) i sa l le s s e n t i a lp e p t i d a s ei n v o l v e di n t h ep r o c e s so ft b m o rg r o w t ha n dm e t a s t a s i s i n h i b i t i o no fa p n c d 13m a yb ea l l e f f e c t i v es t r a t e g yf o rc a n c e rt r e a t m e n t w ec o n s t r u c t e das e r i e so fc y c l i c - i m i d e p e p t i d o m i m e t i c sc o m p o u n d s ，w h i c hw e r ed e s i g n e dt of i tt h ea c t i v ep o c k e t ss 1a n d s lo fa p n c d13t h a ta c ti nt u m o rp r o l i f e r a t i o n w ef o u n dt h a tt h ec o m p o u n d ( s ) - 2 一a m i n o - n - ( ( s ) - 1 ( 2 - ( h y d r o x y a m i n o ) - 2 - 0 x o e t l l y l ) 一2 ，6 - d i o x o p i p e r i d i n - 3 - y d - 3 - p h e n y l p r o p a n a m i d eh y d r o c h l o r i d e ( c o m p o u n dn o 2 4 f ，a l s o t e r m e da sc i p - 13 f ) d i s p l a y e das u b s t a n t i a lp o t e n t i a li n h i b i t o r ye f f e c to na p n c d l 3a c t i v i t y h e r e i n , w e e v a l u a t e dt h ee f f i c a c yo f2 4 fa sac a n d i d a t ec o m p o u n df o rt r e a t m e n to fc a n c e r sw i t l l p o s i t i v ea c t i v i t ya n de x p r e s s i o no f a p n c d l 3 m e t h o d s ：t h ee x p e r i m e n t sw e r ep e r f o r m e do ns e v e r a lh u m a nc a r c i n o m ac e l ll i n e s ， w h i c hh a v el l i g ha n dl o wl e v e l so fa p n c d13r e s p e c t i v e l y t h ea s s a yo fq u a n t i t a t i n g t h ee n z y m a t i cc l e a v a g eo ft h es u b s t r a t el - l e u c i n ep - n i t r o a n i l i d ew a se m p l o y e dt o e v a l u a t ea p n c d13a c t i v i t yo nt h es u r f a c eo fc a n c e rc e l l s a ni m m u n o f l u o r e s c e n t f l o wc y t o m e t r ya s s a ya n dw e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i sw e r eu s e dt om e a s u r et h e e x p r e s s i o nl e v e lo fa p n c d 13a f t e rt r e a t m e n tw i t h2 4 f m t ta s s a yw a se m p l o y e dt o e v a l u a t et h ee f f i c a c yo f2 4 fi nv i t r o t h et r a n s w e l lc h a m b e ra s s a yw a sa l s ou s e dt o m e a s u r et h ei n h i b i t o r ye f f e c to f2 4 fo l lt h ei n v a s i o na n dm i g r a t i o no fc a n c e rc e l l s p e n e t r a t i n gt h em a t r i g e l t h ei nv i v oe f f i c a c yo f2 4 fw a sa s s e s s e di n a ne s - 2 9 山东大学硕士学位论文 x e n o g r a f lm o u s em o d e l i nt h ea s s a y so fa p o p t o s i s ，h o e e h s ts t a i n i n ga n a l y s i sw a s e m p l o y e dt oe x a m i n ed n af r a g m e n ta f t e re a l l c e rc e l la p o p t o s i s c e l ls u r f a c eo f p h o s p h a t i d y l s e r i n ei na p o p t o t i cc e l l sw a sq u a n t i t a t i v e l yd e t e c t e db yu s i n ga n n e x i n v f i t ca n dp ia p o p t o s i sd e t e c t i o nk i t w e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i sw a se m p l o y e dt o e v a l u a t et h ee x p r e s s i o nl e v e l so fa p o p t o s i sr e l a t e dp r o t e i n si nc a n c e rc e l l se x p o s u r et o 2 4 fa n di ne s - 2x e n o g r a f l si nn u d em i c e i na d d i t i o n , w em e a s u r e dt h ec e l lc y c l e a r r e s tu s i n ga d r i d i n eo r a n g e e t h i d i u mb r o m i d e s t a i n i n ga f t e r2 4 f t r e a t m e n t r e s u l t s ：2 4 fs i g n i f i c a n t l yb l o c k e da p n c d13a c t i v i t yo nt h es u r f a c eo fe s - 2a n d h l - 6 0c e l l s ，w h i c ha r eh i g he x p r e s s i o nl e v e l so fa p n c d13 ，a sm e a s u r e d b y q u a n t i t a t i n gt h ee n z y m a t i cc l e a v a g eo ft h es u b s t r a t el - l e u c i n ep - n i t r o a n i l i d e 2 4 f w e a k l yi n h i b i t e da p n c d l3a c t i v i t yo nt h es u r f a c eo fs k o v 3 ，p l c p r f 5a n d e c v 3 0 4c e l l s ，w h i c ha r e r e l a t i v e l yl o wl e v e l so fa p n c d l 3 2 4 fe f f e c t i v e l y i n h i b i t e de s 一2a n dh l 6 0c e l lg r o w t ha n dm i g r a t i o nw i t h o u ts i g n i f i c a n tc y t o t o x i c e f f e c t t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a t2 4 fm a yi n h i b i tc a n c e rc e l lg r o w t hv i as u p p r e s s i o n o fa p n c d13 f u r t h e r , w ee v a l u a t et h ei n h i b i t o r ye f f e c to f2 4 fi nm i c eb e a r i n ge s 一2 x c n o g r a f l s 2 4 fd e l a y e dt h eg r o w t ho fe s - 2x e n o g r a f l si nm i c ea f t e r2w e e k so ft a i l v e i ni n j e c t i o n a td o s e so f10a n d5 0m g k go f2 4 f ，t h ei n h i b i t i o nr a t e sw e r e3 1 o a n d3 8 o ( 尸 0 0 1 v s c o n t r 0 1 ) ，r e s p e c t i v e l y 2 4 ft r e a t m e n tw a sg e n e r a l l yw e l l t o l e r a t e db ym i c ew i t hn os i g n i f i c a n c er e d u c t i o ni nb e d yw e i g h t i nt h ea s s a y so f w e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i s ，w ef o u n dt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fa p n c d13i ne s - 2 c e l l sw e r es i g