（分析化学专业论文）小分子荧光探针与核酸的相互作用及其分析应用.pdf

abs t r ac t 了 t h e t h e .6 s , rr a d e u p o f 6 c h a p t e r s , d e al s w i t h t h e i n t e r a c t i o n o f s m al l m o l e c u l e p r o b e s w it h n u c l e i c a c i d s a n d t h e i r a n a l y t i c al a p p l i c a t i o n . t h e c o n t e n t s a r e a s f o l l o w s : 1 . 二 。 r e v ie w isl p r e s e n te d 。 。 th e d e v e lo p m e n t o f n u c le ic a c id a s s a y s m e th o d a n d th e d , v e . o p m e n t c f s p e c tr o s c o p i c p r o b e s u s e d i n n u c l e i c a c i d s r e s e a r c h . :之 1 ” ， 一 : 二 3 卜.杏 : 。 : 世 ， : d i 。 。 o . . t h e i n t e r a c t i o n o f n u c l e i c a c i d s w i t h q u i n al d i n e r e d ( q r ) , a :一 : i : : : -: c : : c c e r r m e t h o d f o r d e t e c t i o n o f n u c l e i c a c i d s u s i n g q r a s t h e fl u o r e s c e n t !, r o b e i s p r e s e n t e d . 3 . b a s e d o n t h e s t u d i e s o n t h e in t e r a c t i o n o f n u c l e i c a c i d s w i t h p h e n o s a fr a n i n e ( p s ) , a n e w fl u o r e s c e n t m e t h o d f o r d e t e c t i o n o f n u c l e i c a c i d s u s i n g p s a s fl u o r e s c e n t p r o b e i s p r o p o s e d . 4 . t h r o u g h t h e s t u d i e s c n t h e i n t e r a c t i o n o f n u c l e i c a c i d s w i t h p i n a c y a n o l c h l o r i d e ( p c ) b y a b s o r p t i o n , fl u o r e s c e n c e a n d c i r c u l a r d i c h r o i s m s p e c t r o s c o p y , w e f i n d t h a t t h e b i n d i n g o f p c t o n u c l e i c a = i d s i s t h e f o r m a t i o n o f h - a g g r e g a t e o f p c o n t h e s u r f a c e o f n u c l e i c : x i d mo l e c u l e s 5 . u a s ? d t- n t h e s t v i e s o n t h e e n e r g y t r a n s f e r b e tw e e n a c r i d i n e o r a n g e ( a o ) a n d n c e r n s e f i w i i n e ( p s ) , a r o w m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f n u c l e i c a c i d s i s p u t 介二 ，/ ” 么 c . a n c % ; l r _ u c l e i c a c i d a s s a vm e t h o d b y t h e s y s t e m o f e n e r g y t r a n s f e r b e t w e e n fl u o r e s c e i n 气 - o d i u m ( f l ) a n d p h e n o s a f r a n in e ( p s ) i s p r o p o s e d . k e y w o r d s : d n a , r n a , s m a l l m o l e c u l e , e n e r g y t r a n s f e r , fl u o r e s c e n t p r o b e , d e t e r m i n a t i o n , i n t e r a c t i o n 第 ， 幸绪 论 第一章绪论 我们身处的3 1 世纪， 是一个科学高速发展的世纪， 其中尤其以生命科学的发展最 为耀眼。 作为科学技术的“ 眼睛”的分析化学也在不断地接受着新的挑战和要求， 从 而使生 物化学分析成为分析 化学中 最为 活跃的 研究领 域之一 1 .2 1 。 核酸( n u c l e i c a c i d s ) 是生物体重要组成物质， 是遗传信息的 携带者和基因表达的 物质基础， 它在生物的 成 长、 发育和繁殖等活动中， 具有十分重要的作用， 因此核酸研究具有非常重要的意义， 是分子生物学的重要领域。核酸的研究己有一百多年的历史。早在 1 8 0 8年，瑞士的 一位青年科学家f .m i e s c h e r 从外科绷带上脓细胞的细胞核中分离出了一种有机物质， 它的含磷量之高超出任何当时已经发现的有机化合物， 并且有很强的酸性.由于这种 物质是从细胞核分离出来的，当时就称它为核素 ( n u c l e i n ) e mi e s c h e r所分离的核素 就是今天我们所知的脱氧核搪核蛋白。 核素中脱氧核糖核酸的含量为3 0 %。以 后陆续 汪明，任何有机体，包括病毒、细菌、动植物等，都无例外地含有核酸。 核酸分 脱氧核 糖核酸 ( d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d , d n a ) 和核 糖核酸 ( r i b o n u c l e i c a c i d , r n a ) 两大类。 核酸的生物学作用是在发现核酸以后7 0 多年才被证明的， 这就是1 9 4 4 年由a v e ry等所完成的著名的肺炎球菌转化实验。 该实验证明了d n a是重要的 遗传 物质，是遗传信息的载体。 这一发现大大推动了对核酸结构和功能的研究， 在此基础 上进行的研究和发表的论文数以万计。在二十世纪五十年代，wa t s o n - c r i c k基于 c h a r g a f f 等 测定 各 种生 物的 碱 基组 成和 提出的a - t , g - c碱基 互补 理论而 建立 起的 d n a双螺旋结构模型，拉开了 分子生物学研究的序幕，为分子遗传学的 研究奠定了 基础。 到目 前为止，关于d n a的研究己有不少，如:碱基组成及分析、d n a的一级结 构 测定即d n a 序列的 分 析 13 1 , d n a指 纹 分 析 等， 这 些 研究 都 离 不开 现 代分 析 化学 技 术， 分析化学以其独特的灵敏少量精确成为核酸研究不可或缺的工具。为了更有效地 分析测定核酸， 科学工作者们开拓并发展了越来越多的核酸分析方法， 本章将对核酸 的定量测定及小分子与核酸的相互作用两方面的工作的研究进展进行评述。 军 介绪 论 i.- 1 核酸定量测定的研究进展 1 .1 . 1 核酸的光度分析 1 . 1 . 1 . 1 基于核酸的组成成分的测定 核酸由磷酸根、 碱基和戊糖三部分组成，因而可通过测定其组成成分对核酸进行 测定。 常 用的 基于核 酸的组成成分来测定核 酸的 方 法有: 磷含量光度法4 -6 1 硫酸法7 .8 1 二 苯 胺 法 9 - 1 1 1 ， a 引 噪 法1 2 - 14 等。 1 . 1 . 1 .2 基于试剂分子与d n a分子 之间的 相互作用的光度分析 试剂分子可以和d n a分子发生相互作用，对试剂分子的光学特性产生影响，从 而建立了d m a 的新灼 光度分析方法。 _ 刃少 年 p 份 测 等报道丫甲 基绿与 d n a相互作用后吸光度升高的现象，并用于 : x a的 分 析 测定 1 1 3 1虽 然甲 基 绿 法 操 作繁 琐， 但 其开 辟了 生 物染 色素 用 于核 酸 分 析的 广阔 前 景 继而出 现了 快 速、 简单、 灵敏且 能 用于 聚合酶 链反应的甲 苯胺蓝法 16 1 ， 乙 基紫法1 1 7 1 等一系列的基于染色素与核酸相互作用使生物染色素的吸光度降低而实现 对核酸测定的方法。 最近小分子金属配合物作为核酸探针成为核酸研究的另一热点， 随之出现了 许多 可以作为核酸探针的金属配合物。 但是可用于作为核酸光度分析的却很少，因此这方 面的工作还有待于进一步的开拓和挖掘。 1 . 1 .2 核酸的荧光分析 由于核酸的内源荧光很弱， 无法直接用于核酸的分析研究，因此需要采用间接荧 光法对其进行分析研究。 荧光分析法因为具有使用仪器简单， 方法灵敏， 操作简便等 优点而成为众多核酸定量分析方y 中发展最快， 应用最广的一种方法。 核酸的荧光分 折法分为两大类:荧光增强法和荧光减弱法， 它是基于核酸与荧光探针的相互作用， 改变了荧光探针的光学结构，从而使其荧光量子产率增多或者减少， 表现为其荧光强 度的增大或者减小。根据荧光强度的变化，实现对核酸的测定或者研究。 目 前出 现的 用于核酸分析的 荧光探针有: 有机分子探针、 稀土一 配体探针、 过渡 金属络合物探针等， 下面将进行分类讨论。 3 t s - 幸绪 论 1 . 1 . 2 . 1 有机小分不作为荧光探针 噢扮 乙 锭住 : 尽 应用是早也是 应用最广的 荧光 探针， 1 9 “年e b 首次被用于 双螺 旋州八灼 分 沂 资 叮了 ? ，艺下 ， 后 又 用于 监 测其 它 物质与d n a的 作 用 机理 2 0 ,2 1 ,2 2 1 ， 或 有 机 致癌物、. 毒素及抗癌药物在体内的过程2 3 1 ， 但是由 于试剂背景发射的影响， 灵敏度不 够高，加上e b的致癌性，使发展其他高灵敏、无毒安全的荧光探针成为必然。 双苯并咪哇染料 ( 如h o e c h e s t 3 3 2 5 8 ) ，也是常用的一种核酸分析试剂。 r i l e y 等 以h o e c h e s t 3 3 2 5 8作探针， 采用荧光微滴定技术建立了精确测定 d n a的方法2 4 1 l a b a r a c a 等将h o e c h e s t 3 3 2 5 8 成功地用于细胞和粗处理组织匀浆中d n a的测定2 5 1 s t o u t 等为了直接检测碱性洗脱液中的d n a ， 建立了用h o e c h e s t 3 3 2 5 8 检测单链d n a 的 新 方 法， 可以 检 测 低 至1 0 0 n g / m l 的s s d n a 2 6 1 0 叮 吮 类 化合 物也 是常 用的 一 类 核酸 荧 光 探 针， 用于 核 酸 测定 12 7 及抗 癌 药 物的 筛 选 2 8 1 。 近来 也 有邻菲 咯 琳 2 9 1 、 4 - n . n 一 二甲 氨 基一 4 - 氨 基一 苯 丙 烯酞 苯3 0 , 3 一 甲 氧 苯并 葱酮3 1 1 等有 机小 分子作为核酸荧光探针的 报道。 利 用d n a 对 藏 红t ( s t ) 荧 光 具 有 碎灭 作 用， 可 检测8 .3 n g / m l 的c t - d n a . 3 2 1 ， 同 理 许 金 钩等 建 立了 耐 尔 蓝( b ) 3 3 和 亚甲 基 蓝 3 4 1测 定d n a的 碎 灭 法。 基于9 . 1 0 -蕙醒- 2 一 磺酸钠与d n a之间的插入作用， 李文友等建立了荧光碎灭 法检测d n a的灵敏方法3 5 1 基于竹红菌素和核酸之间的非插入相互作用， 可导致竹红菌素荧光显著增强， 可 / 检 9 9 5 .0 2 0 0 n g / m l 的c t - d n a 和1 3 .0 - 2 0 0 n g / m l 的 酵 母r n a 3 6 1 0 1 . 1 .2 .2能 量 转 移 体 系 荧 光 探 针 能量转移 ( 或电子转移) 是自 然界中普遍存在的一种现象， 它是生物体代谢活动 的 基 础 3 7 1 ， 因 此 对与生 物 大分 子 有关的 能 量 转 移 现 象的 研究 有助 于 人 们 对生 命 活 动 本 质的认识。 基于 荧光共 振能 量转移的体系已 被用于 酶活性分 析 3 8 1 、 抗原一 抗体的 测定 3 9 1 等领 域，但用于d n 产之量分析的研究很少。张红漫等人对荧光素一藏红t之间的能量转 移体系进行了研少 :， 发现 d n a的存在对两种染料之间的能量转移有很大的影响，并 将 此现 象 用于d n a 测定， 结 果 令 人满 意 14 3 1 . 同 理 曹 瑛等 对叮 健 橙一 藏红t 和叮 咙 橙 一中性红能量转移体系在d n a存在下的 变化情况进行了 研究， 也发现d n a对它们的 能量转移有介导作用，并在此基础上开发了 新的d n a测定的方法a i l 寨 一 章绪 论 1 . 1 .2 .3 二聚体荧光探针 二聚体荧光探针是又一大类核酸荧光探针。 唾哇橙 ( t o ) 的同型二聚体和恶哇黄 c y o ) 的同型二聚体在水溶液中不发荧光， 但是与d s d n a作用后荧光量子产率显著 提高 ， 用 于 核 酸 的 定 量 测 定， 具 有 很 高 的 灵 敏 度， 可以 检 测0 .5 n g / m l 的 核 酸 4 2 ,4 3 1 在阴离子表面活性剂的胶束前预聚集作用下，叮t黄形成非荧光的同型二聚体， 大大 碎灭了叮睫黄的荧光，在核酸存在下，改变了单体和二聚体的平衡，可以用于核酸的 测定4 4 1 . 1 .2 .4 稀土配合物核酸荧光探针 钢系离子与核酸相互作用可产生斓系离子的特征荧光，由此可提供有关核酸组 成 的 信息。 三 价 铜系 稀土 离 子 如 械 ( ii i ) 4 5 ,4 1 1 , 镜 ( ii i ) 14 1 1,它 们本 身具 有荧 光， 在紫 外光照射下， 其共振能带与核酸的三线态重合4 8 1 ， 导致其荧光增强， 是理想的生物分 子 探针， 并成功用于 核酸的 测定4 9 ,5 0 1 由于钟 ( i i i ) 的各种阳离子体与d n a上的磷酸根发生静电作用， 在氯化钠介质 中， d n a碎灭了 饰的荧光， 建立了 饰的核酸分析方法5 1 1 应用锐在核酸存在下的荧光增强， 可进行核酸的分析测定 5 2 1 1 . 1 .2 . 5过渡金属络合物荧光探针 过渡金属络合物具有优良 的结构和空间选择性，可作为核酸荧光探针5 3 - s s j r u ( p h e n ) 尹 和r u ( b ip y ) 3 2 + ( p h e n = 1 , 1 0 一 菲 咯 琳， b i p y r 2 ,2 一 联 u 1m) 类 络 合 物 具 有 优良 的 化学稳定性、 氧化还原性、 激发态反应活性和合适的激发态寿命， 是良 好的核酸荧 光探针。 1 . 1 : 3 共振光散射技术在核酸分析中的应用 当光照射到分散体系时，它们之间有 3 种作用形式:光吸收、光反射和光散射， 但也可能直接透射过。当粒子的尺寸大于入射光的波长时发生反射，服从反射定律， 即入射角等于反射角，然而由于各个粒子的反射面不同，形成漫反射呈现出浑浊，相 反，粒子的尺寸小于入射光波的波长时，发生光散射。 光散射主要用在生物大分子的结构及分子量测定等物理性质方面，它可以提供 有关粒子大小、 形状等方面的信息， 在胶体化学和高分子溶液研究方面有广泛的应用。 核酸是最早被用光散射技术来研究和分析的生物大分子物质。 早在 1 9 8 4 年， k n o l l 等 5 1 1 就提出了以 染料键合d n a引 起染料的共振散射增强进行d n a的光散射标记，但 第 一 幸绪 论 是 并 未引 起 足 够的 重 视 和发 展。 1 9 9 3 年p a s t e rn a c k 等 1 5 7 使 用普 通荧 光分 光 光 度计建 立 的 共振光散射技术( r l s ) ， 在研究生物大分子识别、组装和聚集时出 现灵敏而丰富的 信 号 5 8 - 6 0 。 有 机小 分子与生 物大分子物 质如蛋白 质、 核酸分子作用时， 结合数 较大， 相 当于有机小分子在生物大分子上堆积，因而产生强烈的共振光散射增强信号。黄承志 等 在 此基 础 上 首次 提出 了 核 酸的r l s 光 谱分 析 法 6 2 1随 后r l s 光 谱 逐 渐成 为生 物 大 分子分析和研究的重要技术。 到 现在为 止， 染 料乙 基 紫 6 3 1 、 罗 丹明b 64 1 、 耐 尔 蓝 硫酸盐 6 5 1酚 藏花 红 6 6 1 、 藏 红t 6 7 1 等用于核酸的r l s 分析已 有报道。 1 . 1 . 4 其它方法 随着人们对核酸分析和研究的不断深入，电化学分析法、毛细管电泳法以及色 谱法等都已被应用于d n a分析中。 1 . 2 核酸与探针分子 ( 靶向分子)相互作用的研究进展 1 9 5 3 年w a t s o n 和c r ic k 6 8 提出d n a 的 双 螺 旋 结 构 模型， 从 分 子 水 平 上 阐 述了 生 命遗传信息通过d n a半保留复制的机理， 从此生物学进入了 分子生物学的新时代。 有关生物基本遗传物质d n a的 研究也就成为分子生物学和生物化学的重要课题， 其 中以d n a为作用靶点的分子， 即d n a靶向分子与d n a之间相互作用的研究一直是 一个比较活跃的领域。 1 .2 . 1不同d n a靶向化合物与d n a的相互作用 影响d n a靶向分子与d n a相互作用的因素很多， 其中最重要的是分子结构。 因 此探讨d n a靶向分子的结构与其对d n a的结合方式对于设计具有特定功能的d n a 靶向分子是很重要的。 1 .2 . 1 . 1 金属配合物 无机金属离子配合物，尤其是过渡金属离子配合物构成了d n a靶向化合物的一 大类， 这类化合物具有两大用途: ( 1 ) 可望设计成人工核酸酶， 从而实现对d n a链上 j 稼 一 章绪 论 某些位点的 特异性剪切; ( 2 ) 可望设计并合成出 性能 优良 的抗肿瘤药物或抗病毒剂。 1 .2 . 1 . 1 . 1 金属叶琳配合物 金属叶琳是一类广泛存在于自 然界中的生物活性物质。阳离子的四 ( 4 - n -甲 基 毗pq 基 ) 叶 琳 ( t m p y p ) 及其金属 配合物比 阴 离子型叶 琳对癌细 胞的光 动力效应强， 因而 被当作 d n a靶向模型化合物而广泛研究。研究表明，这类阳离子叶琳不仅在癌症与 肿瘤的光动力疗法中有诱人的前景16 9 1 ， 而且具有抗逆转录病毒作用。 另外，叶琳分子在与d n a结合的基础上，经过光活化、电化学活化或在氧及其 它化学活化剂如超氧化物离子存在的情况下，能选择地使 d n a断裂，因此可将其看 作是双功能化学物， 并且这种双功能性可以通过修饰而将其设计成为序列选择性更好 的人工核酸酶或抗癌药物。 1 .2 . 1 . 1 .2 铂配合物 自6 0 年代r o s e n b e r g 发现顺二氯二氨合铂( 1 1 ) 的 抗癌活性以 来， 有关顺铂及其他 具有类似结构的平面四 边形铂配合物的 抗癌活性研究一直非常活跃17 0 ,7 11 ，目 前除了 顺 铂及卡铂已经用于临床外，还有几种也已经处于临床实验阶段。大量研究表明，这类 药物的抗癌活性与其能和 d n a链共价结合并导致 d n a 结构变化的能力密切相关 17 2 ,7 3 1 ，由于顺铂及其类似物具有很强的毒副作用， 而且某些肿瘤对它们产生抗药性， 所以开发能克服抗药性或者具有广谱抗肿瘤活性的铂配合物成为目前及今后研究的 重点。 1 .2 . 1 . 1 . 3 其它过渡金属配合物 具有八面体结构的过渡金属配合物， 尤其是r u , r h , c 。 配合物与d n a相互作用的 研究也一直受到人们的重视， 许多r u 配合物具有的独特发光性能， 使其成为研究d n a 性质的一种有效的光物理和光化学探针1 7 4 ,7 5 1 1 .2 . 1 .2 d n a靶向 抗生素 1 .2 . 1 .2 . 1 多肤及蛋白 质类抗生素 博莱霉素 ( b l e o m y c i n , b l m) 是一种天然存在的 糖肤， 是此类抗生素的 代表， 临 床上常被用来治疗头、颈及鳞状细胞癌。近年来，从海洋生物中还发现了一系列高活 性的抗癌肤，其结构多为小分子环肤，它们不仅抗癌活性高，且稳定性好，有关此类 抗癌肚作用机制的研究尚需进一步探索。 1 .2 . 1 .2 .2 蕙环抗生素 第 一 幸绪 全 仑 葱 环 抗生素 是一 类 研究 的比 较多的 抗 癌 抗生 素， 阿 霉 素( a d r ia m y c in , a d m ) 、 道 诺霉素( d n m) 是这一家族中比 较重要的两种抗生素， 此外还有诺加霉素( n o g a l a m y c i n , n g ) 、 阿克拉霉素a等， 其共同的结构特征是含有一个由3 个共平面的六元环所构成 的四氢j 卜 四苯醒发色团。 1 .2 . 1 .2 .3烯二炔抗生素类 烯二炔是一类在临床与理论研究中都有很大价值的抗癌抗生素。 这类抗生素结构 上的独特之处在于其分子中含有一个张力较大的烯二炔环，一个能与靶d n a接近的 引导系统，另有激发系统以激活并起动级联反应。研究表明这类抗生素通过与 d n a 序列特异性结合并进而引起s s - d n a或d s - d n a的损伤而表现出生物活性。 1 .2 . 1 .2 .4 乙 撑亚胺型抗生素 乙 撑亚 胺型d n a 靶向 分 子是 一 类重 要的 烷 化剂， 丝 裂霉 素d 7 6 .7 7 ( m it o m y c in c mc )作为一种临床上常用的重要抗肿瘤剂，是这类化合物的代表物。 1 .2 . 1 .3 其它靶向 分子 除了上面提到的一些靶向分子之外， 还有存在一些烃化剂， 它们是具有平面结构 的多环芳烃分子，主要以 嵌插键合核酸， 作用于核酸分子碱基对， 在碱基对之间相对 滑动， 对核酸产生作用。另外， 含氮原子的平面杂环分子，由于分子结构和荷电性的 差异， 对核酸的作用也不同。 这类靶向 分子多用作检测核酸的各类探针如:叮陡、 吩 唾嚓、喳琳类分子等。 1 .2 .2 d n a与其靶向 分子的 作用方式 小分子与d n a结合的部位是核酸的碱基、磷酸骨架和戊糖环。核酸由平行堆积 的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条由核昔酸链形成的大沟、小沟组成了小分子 识别的位点。 虽然d n a靶向化合物的数量非常之大， 但与d n a的结合模式归纳起来 大致可以分为非共价结合、共价结合和剪切作用三类。 1 .2 .2 . 1 非共价结合 ( 1 )静电结合:即分子通过非特异性的相互作用结合于带负电荷的d n a螺旋外部， 一 般认为静电 结合没有选择性， 作用于磷酸 骨架， 文献7 8 认为， 核酸分子表面由 静电 力形成的水化层中水分子的排列与碱基有关。 ( 2 )嵌插结合:即在碱基对之间嵌入平面或者几乎平面的芳香环系统。嵌插结合的 第 一 章绪 论 作用力来自 芳环的离域， 体系与 碱基的二 体系间的二 一二 相互作用及疏水相互作用。 通常稠合芳环体系 都倾向 于结 合在g c 富 集区 7 9 1 ， 而对于一些含有庞大取 代基的分子， 如毗咤环取代的叶琳分子在与d n a作用时，毗健环取代基会尽快旋转，以保持与母 环的共平面，从而形成良 好的堆积形状与d n a的碱基嵌合。 ( 3 沟槽结合: 即d n a靶向 分子与d n a的大沟或者小沟的碱基对边缘直接发生相 互作 用， 通常非 稠合的芳 环体系能 通过一 定的 旋转后结 合在小 沟中a t 富 集区 8 0 1 ， 并 且在靶向 分子的供体基团与小沟中a的n 3 或t的o z 这些受体间常常有氢键形成。 小分子通过沟槽或者嵌插结合在核酸的螺旋沟或碱基中， 加上静电力的作用，常 会诱发许多生物效应，阻碍核酸信息的正常表达。同时这3 种力还凭借氢键、 范德华 力、疏水作用等使相互作用加强。 1 .2 .2 .2 共价结合以 及剪切作用 与非共价结合作用相比， d n a靶向分子与d n a共价结合的序列特异性识别能力 要强得多， 当分子与特定碱基作用并形成加合物， 则会使核酸的双链解旋且产生恋曲。 具有剪切作用的分子不但特异选择结合位点并会最终使核酸断链。 近期研究表明， 小分子与d n a相互作用形式还青 半嵌插结合” ( h a l f i n t e r c a l a t i o n ) 8 11 ， 不同 于 经典 的 结 合。 花青 染 料与 双 螺旋的 核酸 作 用时， 花青 染 料 有不同 的电 荷分 布， 其第二杂环在核酸沟内空间固定， 与相邻的碱基对作用， 与磷酸基还有静电作用。 环 核 营 酸 与。 a p i 的 结 合 也 是 一 利 ，新 的 模 式 18 2 1 a d n a 与 药 物a n t ip a n o s o m a l ( b e r e n i l a n d p e n t a m i d i n e ) 之间也是复杂的结合 模式， 弯曲 的 和未 弯曲的 共存8 3 1 。由 于 超分子化学 的 发 展， 分 子与 核 酸的 作 用还 涉及 到 长 距组 装( lo n g r a n g e a s s e m b ly ) 18 4 ,8 5 1 ， 带 有正 电 荷的 分 子 对核 酸 有 凝 聚 作 用( c o n d e n s i n g e ff e c t ) 8 6 1 ， 当 其与 核酸的 摩尔比 较高 且 介 质 的离子强度低时， 将诱导核酸超螺旋结构形成， 产生光共振现象，即分子在核酸表面 堆积形成一种超螺旋结构s s 1 1 . 2 .3 常用的研究方法及其特点 d n a与其靶向 分子间的相互作用研究，以 及其在药物设计与合成及药物作用机 理研究方面的重要意义，引起众多学者的兴趣，许多方法及技术被引入此研究领域。 1 . 2 . 3 . 1光谱法 d n a分子中的碱基具有光学活性，在 2 6 0 n m附近处有吸收，许多小d n a靶向 第 一 章绪 1 仑 分子或本身具有光学活性，或与d n a结合后产生光学活性，因此利少 u 光谱方法通过 考察d n a结合其靶向分子后结构上的变化来研究结合机理，是非常有效和应用址为 广泛的方法。 其中紫外/ 可见吸收光谱是研究d n a与其靶向分子相互作用的一种最方 便、最常用的技术。当小分子 j 核酸相互作用后，会引起吸收谱带变宽、红移 ( 或监 移) 效应和减色 ( 或增色) 效应。尤生 足以嵌插力式结合的分 j 代 ，变化会史人，tll ! 瓜 增人，熔点月1穴 j ， 有些小分子与核酸结合后， 会使原本荧光很弱的分子荧光强度增人很多。有些小 分子与核酸结合后会发生荧光碎灭作用。利用这些现象，可用荧光光谱法进行分析， 获得热力学和动力学数据。用e b作荧光探针，可以研究b endri m er s 的特异性结合位 点157 。还可以 用sca t c h ard 方程判断结合方式188 。 文献189 ! 利用计算机辅助计算程序进 行非线形非共价结合的scatch a r d 方程数据处理。 利用偏振光、圆二色光谱可获得与核酸作用后，旋光性发生变化的那些光学活性 小分子的立体选择性，获得一定的结构信息以及其对核酸构型的影响。 线二色光谱可快速区分非共价结合 ( 静电结合、沟内结合和嵌插结合)3种作用 形式、并且能得到作用的准确方向和动力学数据。 共振拉曼光谱可以 通过共振激发核酸色团来研究分子与核酸作用的精确位置， 同 时共振拉曼光谱的缺色性可以作为区分嵌插和沟内结合的依据。 红外光谱法、时间分辨共振拉曼光谱法也用于这方面的研究。 1 .2. 3， 2电化学法 采用电 化学方法研究其它分子与d n a的相互作用，虽然在一定程度上受分子电 活性与否的限制，但是由 于一些吸收光谱比较弱，或由于其电子跃迁谱带与d n a的 发生重叠， 而无法用诸如紫外/ 可 见等方法来研究的分子， 却有可能用直接或间接伏安 法方便地进行研究190 一 93。 1 .2 .3 . 3其他方法 生物学上最有利的工具是凝胶电泳的方法， 凝胶电泳是分离、纯化、鉴定、制备 d n a片断最常用的方法。共价结合的加合物采用引物延伸法;非共价结合的，则用 d n a足迹法;剪切作用的要用高分辨聚丙烯胺凝胶电泳。 粘度测定、核磁共振、平衡渗析、微量热法、x 一 射线晶体衍射、原子力显微镜 (af m ) 、 扫描隧道电 镜( s t m) 、 亲合色谱法、 能量转移法、 h p l c 、 电泳与质谱法( m s) 第 一 章绪 论 等方法用于小分子与d n a相互作用的研究也有文献报道都。 1 .3 本论文的工作及其意义 生物分析试剂与探针的研究与应用是生物分析化学的重要组成部分， 生命科学的 发展对生物活性物质的分子提出了更多的要求。 核酸是一类很重要的生物大分子， 探 索和开发新的核酸探针有利于更清晰地探测和研究核酸的结构和功能。 许多染料小分子可以 和核酸发生强烈的相互作用，是一类可以 利用的核酸探针， 适用于不同用途的核酸研究。 通过染料小分子和核酸的相互作用研究， 可开发探索新 的可用于低浓度下核酸的分析测定的染料，同时对设计有效的药物也有很重要的意 义。 本文选择了多环芳烃型染料分子作为研究对象， 其原因是由 于这类分子结构简单 与d n a作用方式简单， 可以作为研究与d n a相互作用的模型物， 几 其多为平而结构， 与d n a作用能力较强。 基于以 上原因，我们选择多环芳烃染料分子与d n a间相互作用作为我们的研究 对象进行了以下几方面的工作: ( 1 )用分 析手 段研究 表征 小分 子与d n a间 的 相互 作 用在此 基础上找到了 新类型的 d n a荧光探针。 ( 2 )研究了以d n a介导的不同染料分子之间的荧光能量转移现象， 在此基础上， 考 察了能量转移体系作为d n a荧光探针的可行性。 1 . 4 参 考 文 献 1 高鸿. 社， “ 分析化学的现状与未来”. 分沂必学成着 ( 高鸿主编) ，北京，科学出版 1 9 9 1 : 1 i m a i k , a n a l s c i . , 1 9 9 8 , 1 4 : 2 5 7 程介克，分沂叱学进屡 ( 汪尔康主编) ，南京，南京大学出版社，1 9 9 4 : 1 0 4 第 一 常堵 宝 仑 4 陈曾 燮， 刘竟，罗月. 生物化学实验，合肥:中国 科技大学出 版社，1 9 9 4 : 1 0 7 5 s k i d m o r e w d , d u g g a n e l , d o n z al e s l j , a n a l . b i o c h e m . , 1 9 6 4 , 9 : 3 7 0 6 s h e r i d a n re , o d o n n e l l c m, p a u t l e r e r , a n a l . b i o c h e m . , 1 9 7 3 , 5 2 : 6 5 7 7 b y v o e r p , a n a l . b i o c h e m， 1 9 6 5 , 1 3 : 3 1 4 8 b y v o e r p , a n a l . b i o c h e m . , 1 9 6 6 , 1 5 : 3 1 9 b u r t o n k , b i o c h e m . j , 1 9 5 6 , 6 2 : 3 1 5 1 0 l a n c k e r m v , g h e rys s e n s l c , a n a l . l e t t . , 1 9 5 6 , 1 9 : 6 1 5 1 1 l a n e k o 毛t e r a y a m a h , a n a l . b i o c h e m . , 1 9 7 4 , 5 8 : 4 3 9 1 2 c e r i o t t i g j , b i o . c h e m， 1 9 5 2 , 1 9 8 : 2 9 7 1 3 h u b b a r d r w, ma t t h e w w t , d u b b o w i k d a , a n a l . b i o c h e m . , 1 9 7 0 , 3 8 : 1 9 0 1 4 wi e n e r s l , u r i v e r z k y m, l e n d v a i s , s h a f e r s , me i l m a n e , a n a l . b i o c h e m . , 1 9 7 6 , 7 1 : 5 7 9 1 5 p e t e r s d l , d a h m u s m e , a n a l . b i o c h e m . , 1 9 7 9 , 9 3 : 3 0 6 1 6 k i l l e e n aa , mi c r o c h e m . j . , 1 9 9 5 , 5 2 : 3 3 3 1 7李天剑， 沈含熙， 罗云静， 分沂仑戮 1 9 9 8 , 2 6 : 1 3 7 2 1 8 l e p e c q j b , p a o l e tt i c , a n a l . b i o c h e m . , 1 9 6 6 , 1 7 : 1 0 0 1 9 l e p e c q j b , p a o l e tt i c , a n a l . b i o c h e m . , 1 9 6 7 , 2 7 : 8 7 2 0 l e p e c q j b , p a o l e tt i c , j . m o l . b i o l , 1 9 6 7 , 2 7 : 8 7 2 1 f o g l e s o n g p d , a n a l . b io c h e m . , 1 9 8 9 , 1 8 2 : 2 8 4 2 2 s a r i m a , b a tt i o n i j p , d u p p r e d , m a n s u y d , l e p e c q j b , b i o c h e m is t ry , 1 9 9 0 , 2 9 : 4 2 0 5 2 3 p a n d e y p c , we e t al l h h , a n a l . c h e m . , 1 9 9 5 , 6 7 : 7 8 7 2 4 r i l e y j , j e n n e r d , s m i t h j c , ma r k h a m a f , n u c l e i c a c i d r e s . 1 9 8 9 , 1 7 ( 2 0 ) : 8 3 8 3 2 5 c a r r a n o a v , g r a y j w , l a n g l e i s r q b b u r k h a r t - s c h u l t z k j , v a n d i l l a m a , p r o c . n a t a c a d . s c i . u s a . , 1 9 7 9 , 7 6 : 1 3 8 2 2 6 s o u t d l , b e c k e r f f , a n a l . b i o c h e m . , 1 9 8 2 , 1 2 7 : 3 0 2 2 7唐宏武， 陈蓓， 陈观锉， 曾云额， 淳等 李捞常学学舰 1 9 9 7 , 1 8 : 1 9 6 0 2 8 l a n c k e r m从g h e y s s e n s l c , a n a l . l e t t . , 1 9 8 6 , 1 9 : 6 1 5 2 9 y a n g x . , s h e n g l , y u r q , mi r c r o c h e m . j . , 1 9 9 9 , 6 2 :3 9 4 3 0 y a n g x , l i u w h , j i n w j , s h e n g l , y u r q , s e p c i r o c h i m . a c l a . p a r t a , 1 9 9 9 , 5 5 : 2 7 1 u 第 章绪 i t 3 1 f u k u s h i m a 丫h a y a s h i m, n a k a j i m a h , b i o s c i . b i o t e c h n o l . b i o c h e m . , 1 9 9 8 , 6 2 : 2 2 5 4 3 2 g u o x q , l i f , z h a o y b , a n a l . l e t t , 1 9 9 8 , 3 1 : 9 9 1 3 3 c h e n q q l i d h , z h a o y , y a n g h h , z h u q z , x u j q a n a ly s t , 1 9 9 9 , 1 2 4 : 9 0 1 3 4 l i w y , x u j qg u o x q , z h a o y b , a n a l . l e t t , 1 9 9 7 , 3 0 : 5 2 7 3 5李文友， 许金钩， 郭祥群， 朱庆枝， 赵一兵， 高等学校化学学报， 1 9 9 6 , 1 7 : 1 7 0 6 3 6 z h u q z , f a n g l , g u o x q , x u j c q l i w y , a n a ly s t , 1 9 9 7 , 1 2 2 : 9 3 7 3 7 s c o tt r a , ma u k aqg r a y h b , j . c h e m . e a u . , 1 9 8 5 , 6 2 : 9 3 2 3 8 z h a n g z z , s e i t e w r , a n a l . c h im . a c t a , 1 9 9 0 , 2 3 6 : 2 5 1 3 9 we i a p , b l u n e n t h a l h j n , a n a l . c h e m . , 1 9 9 4 , 6 6 : 1 5 0 0 4 0张红漫， 郭祥群， 李芳， 赵一兵， 许金钩， /w/ 7 丈尝笋脚 户 群群凳版j ， 1 9 9 7 , 3 6 : 8 9 1 4 1曹瑛， 放获才学厚士笋应老灵; 1 9 9 8 0 4 2 r y e h s , d a b o r a j m, q u e s a d a m a , ma t h i e s r a , g l a z e r a n , a n a l . b i o c h e m ., 1 9 9 3 , 2 0 8 , 1 4 4 4 3 r y e h s , y u e s , we m m e r d e , q u e s a d a m a , h a u g l a n d r p , ma t h i e s r a , g l a z e r a n , n u c l e i c a c id s . 1 9 9 2 , 2 0 , 2 8 0 3 4 4 z h a n g h m, g u o x q , z h a o y b . , w a n g d .y , x u j .g , a n a l . c h i m . a c t a , 1 9 9 8 , 3 6 1 , 9 4 5 g r o s s k , s i m p k i n s h , j . b i o . c h e m , 1 9 8 1 , 2 5 6 : 9 5 9 3 4 6 p r a t o , l o p e z e , ma t h i s qa n a l. b i o c h e m， 1 9 9 1 , 1 9 5 : 2 8 3 4 7 s i n h a a p b , 助e c t r o s c o p y i n i n o r g a n i c c h e m i s t r y , a c a d e m i c , n e w y o r k , 1 9 7 1 , 2 : 2 5 5 4 8慈云 祥， 胡 晓雷 ， 李 元宗， 常 文保， 分沂必 凳 1 9 9 2 , 2 0 : 1 0 8 3 4 9 s a a v e d r a s s ,