（分析化学专业论文）基于功能核酸组装结构的腺苷和汞离子传感器研究.pdf

摘要 摘要 本论文主要开展了以功能d n a 为基础的新型传感器的研究。在合理设计 d n a 组装结构的基础上，将d n a 适配体和g 四螺旋d n a 酶的裂分体的序 列相融合，结合对d n a 分子的构象和力学性质的控制，以适配体和d n a 酶 分别作为目标识别和信号转导元件，分别组装构造了腺苷和汞离子的比色型均 相光学传感器。另外，还对电活性分子标志物二茂铁与多种含氨基小分子化合 物之间的偶联反应进行了研究，对基于d n a 适配体的信号增强型腺苷电化学 传感器进行了初步的探索。具体内容如下： 提出了对可结合氯高铁血红素( h e r o i n ) 的g 四螺旋脱氧核酶进行分子内 对称裂分的思路，通过这种裂分型的d n a 酶与腺苷的d n a 适配体之间合理 组装，构建出腺苷的高选择性光学比色传感器。在钾离子的帮助下，裂分的d n a 酶的两半将重新结合形成完整的g 四螺旋结构，并在进一步结合氯高铁血红素 分子后形成具有过氧化酶活性的d n a 酶。该d n a 酶在h 2 0 2 存在下，能够 催化氧化a b t s ( 2 ，2 - a z i n o b i s ( 3 e t h y l b c n z o t h i a z o l i n e ) 6 s u l f o n i ca c i d ) 生成蓝 绿色的自由基阳离子产物a b t s ”。目标物腺苷存在时，与传感器d n a 的适 配体区域结合，引起传感器组装体的构象变化，导致g 四螺旋结构与氯高铁血 红素之间不能有效复合，抑制了其对a b t s 的催化能力，体系光学吸收信号减 弱。由于腺苷与适配体之间具有高度特异性亲和作用，该传感器能够达到较高 的灵敏度和优异的选择性，在目前条件下所达到的最低检测限为6i t m ，而且 完全不受其它三种核苷类似物的干扰。本传感器具有简单、易构造、均相、廉 价等优点。 基于h g ( i i ) 对特定d n a 碱基序列的识别作用和d n a 酶的催化作用， 以及我们提出的分子内裂分型d n a 酶的概念，进一步对以上腺苷传感器的原 理进行拓展，构造了纯粹由d n a 组装而成的、无需化学标记的h g ( i i ) 比色 传感器。以t t 碱基错配为基础，使用对h g ( i i ) 有特异结合能力的一种发夹 结构序列替代腺苷传感器中的适配体，以分子内g 四螺旋结构裂分的两个片段 之间的分离与结合作用实现传感器的信号转导，构造了对h 9 2 + 有灵敏响应的 均相光学吸收型传感器。当溶液中有h g ( i i ) 存在时，其与发夹识别序列的特异 相互作用导致传感器的构象发生变化，抑制了g 四螺旋结构的两个裂分体与氯 高铁血红素之间的结合作用，导致传感器的光学输出信号减小。该传感器具有 很高的灵敏度，最低检出限为4 5n m ( 0 9p p b ) ，高于或相当于文献报道的同 类传感器，低于美国环境保护署( e p a ) 规定的饮用水中的h 9 2 + 中毒水平( 1 0 n m ) 。这种新的汞离子检测方法也有着良好的选择性，即使在高浓度的其它金 摘要 属离子存在时，也不会产生干扰。本传感器具有简单、模块化、易构造的特点， 更重要的是，这种传感器避免了其它方法所涉及的化学标记反应或纳米粒子的 合成及修饰，降低了检测的成本，提高了实验的稳定性。 对二茂铁单甲酸与多种氨基小分子化合物之间的偶联反应进行了研究，对 部分合成产物进行了分离和表征。得到了二茂铁胱胺的偶联产物，并对该产物 在金电极表面的电化学稳定性和电子转移特性进行了表征，对基于d n a 的信 号增强型腺苷电化学传感器进行了初步探索。 关键词：适配体d n a 酶裂分式铲四螺旋结构腺苷汞离子比色法传 感器二茂铁 n a b s t r a c t a b s t r a c t t w on o v e ls t r u c t u r e ds e n s o ra s s e m b l i e sf o ra d e n o s i n ea n dh g ( i i ) w e r e s u c c e s s f u l l yb u i l tb a s e do nf u n c t i o n a ld n a m o l e c u l e sa n dw e r ew e l lc h a r a c t e r i z e d t h e s en e ws e n s o r sa l le x h i b i t e ds a t i s f y i n gs e n s i t i v i t i e sa n de x c e l l e n ts p e c i f i c i t i e s a g a i n s tv a r i o u sa n a l o g o u ss p e c i e s i na d d i t i o n ，f e r r o c e n e c a r b o x y l i ca c i dd e r i v a t e d f u n c t i o n a ls m a l lm o l e c u l e c o m p o u n d s w e r e s y n t h e s i z e dt h r o u g h n - h y d r o x y s u c c i n i m i d ee s t e ra c t i v a t e da m i d a t i o nr e a c t i o n s ad n a - b a s e ds i g n a l - o n t y p ea d e n o s i n ee l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rw a sa l s od e s i g n e da n di n v e s t i g a t e db y p r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t s m o r ed e t a i l sa r eg i v e nb e l o w ： s p l i th e m i n - b i n d i n gg - q u a d r u p l e xd n a z y m eh a l v e sa n da na n t i a d e n o s i n e a p t a m e rw a se m p l o y e dt oc o n s t r u c tah o m o g e n e o u sa s s a yf o ro p t i c a ls e n s i n go f a d e n o s i n e i nt h ep r e s e n c eo fp o t a s s i u mi o n s ，t h et w od n a z y m eh a l v e sw o u l d c o o p e r a t i v e l yt r a n s f o r mi n t oa n i n t a c t g q u a d r u p l e xa f t e rc a p t u r i n gah e r o i n m o l e c u l e ，w h i c ht h e nb e c a m eah e m i n - i n t e r c a l a t e dd n a z y m ew i t hp e r o x i d a s e l i k e a c t i v i t i e sf o rt h ec a t a l y t i co x i d a t i o no fa b t sb yh 2 0 2 t h eo x i d a t i o nr e a c t i o nc o u l d g e n e r a t ea na b s o r b a n c ec h a n g eo fa na s s a ys o l u t i o nd u et ot h ea c c u m u l a t i o no f a b t s ( ac a t i o n i c r a d i c a l p r o d u c td u r i n g t h eo x i d a t i o no fa b t s ( 2 ， 2 - a z i n o - b i s ( 3 - e t h y l b e n z o t h i a z o l i n e ) - 6 一s u l f o n i ca c i d ) ) ，w h i c hw a st h e nt a k e na st h e o u t p u to ft h es e n s o r t h ei n t r o d u c t i o no fa d e n o s i n ew o u l dt r i g g e ra ni n t r a m o l e c u l a r c o n f o r m a t i o n a lc h a n g eo ft h es e n s o rs t r u c t u r ed u et ot h eb i n d i n go fa d e n o s i n et oi t s a p t a m e rp a r te m b e d d e di n t h es e n s o rm o d u l e ，w h i c ht h e np r o h i b i t e dt h ec o r r e c t f o r m a t i o no ft h eg - q u a d r u p l e x h e m i nc o m p l e xa n dl o w e r e dt h eo v e r a l lp e r o x i d a s e a c t i v i t yo ft h es e n s o ra s s e m b l yw i t hd e c r e a s e do p t i c a la b s o r b a n c eo u t p u to ft h ea s s a y t h a n k st ot h eh i g h l ys p e c i f i ca f f i n i t yo fa d e n o s i n et oi t sa p t a m e r ，t h ea d e n o s i n e s e n s o rw a s h i g h l y s e l e c t i v e a g a i n s tv a r i o u sp o s s i b l e i n t e r f e r e n c e si n c l u d i n g g u a n o s i n e ，c y t o d i n ea n du r i d i n e t h i sh o m o g e n e o u s ，e a s y - t o b u i l t ，l o wc o s ta n d c o l o r i m e t r i cs e n s o ro f f e r e das a r i s f y i n gd e t e c t i o nl i m i to f6l a mf o ra d e n o s i n eu n d e r s t i l ln o tf u l l yo p t i m i z e dd e t e c t i o nc o n d i t i o n s a sar e - e n g i n e e r e dv e r s i o no ft h ea d e n o s i n es e n s o lal a b e l f r e ec o l o r i m e t r i ch g ( i i ) s e n s o rw a sa l s od e s i g n e db yr a t i o n a l l yi n t e g r a t i n gam e r c u r ys p e c i f i ct ( t h y m i n e ) 埘c hd n a s e g m e n t ，t w os p l i tg q u a d r u p l e xh a l v e sa n dar i g i dd u p l e xs p a c e ri na w h o l e s i m i l a r l y , t h es p l i tg q u a d r u p l e xe n z y m es e r v e da sas i g n a lt r a n s d u c t i o n i i i a b s t r a c t m o d u l ei nt h i ss e n s o r s e n s o ri n d u c e dt h e i n t e r a c t i o no fh g ( i i ) w i t ht h et - r i c hd n ad o m a i nw i t h i nt h e f o r m a t i o no fah a i r p i ns t r u c t u r es t a b i l i z e d b ym u l t i p l e n o n c a n o n i c a lt - h g 也t b a s e p a i r i n g s ，w h i c h ，s i m i l a rt ot h ea d e n o s i n es e n s o r f i n a l l y l e dt oad e c r e a s e dc o l o r i m e t r i co u t p u to ft h es e n s o ra s s a y t h i ss e n s o rh a da h i g h s e n s i t i v i t yf o rh g ( i i ) w i t hal i m i to fd e t e c t i o n ( l o d ) o f4 5n m ( 0 9p p b ) ，w h i c hi s h i g h e rt h a no rc o m p a r a b l ew i t hp r e v i o u s l yr e p o r t e dh g + a s s a y sa n dl o w e rt h a nt h e t o x i cl e v e ld e f i n e db yu s e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na g e n c y ( e p a ) i nd r i n k a b l e w a t e r ( 10n m ) i ta l s oh a dv e r yh i g hs p e c i f i c i t yt oh g ( i i ) ，a n du pt o2 0p mo f10 o t h e rm e t a li o n sd i dn o ts h o wa n yi n t e r f e r e n c e sw i t ht h ed e t e c t i o n su n d e rs u i t a b l e c o n d i t i o n s t h i ss i m p l e ，m o d u l a ra n de a s y - t o - b u i l dh 9 2 + a s s a yr e q u i r e dn os y n t h e t i c e f f o r t ss u c ha sc h e m i c a l l a b e l i n g so rn a n o p a r t i c l ep r e p a r a t i o n sa n dc o n j u g a t i o n s ， w h i c hf u r t h e rl o w e r e di t sd e t e c t i o nc o s ta n di n c r e a s e d s y s t e ms t a b i l i t y f e r r o c e n ed e r i v a t i v e so fs o m ea m i n oc o m p o u n d sw e r es y n t h e s i z e d s o m eo f t h ep r o d u c t sw e r ei s o l a t e do n as i l i c ac o l u m na n dc h a r a c t e r i z e d f e r r o c e n e f u n c t i o n a l i z e dc y s t a m i n ew a sa s s e m b l e do na g o l de l e c t r o d ea n di t se l e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o r sw e r ei n v e s t i g a t e d 。i na d d i t i o n ，ad n a b a s e ds i g n a l o ne l e c t r o c h e m i c a l s e n s o ro fa d e n o s i n ew a sd e s i g n e da n ds o m ep r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e d m i t k e yw o r d s ：a p t a m e r , d n a z y m e ，s p l i tg q u a d r u p l e x ，a d e n o s i n e ，m e r c u r i ci o n s ， c o l o f i m e t r i c ，s e n s o r s ，f e r r o c e n e 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或 撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作 了明确的说明。 作者签名：盔挪签拿日期：塑幺墨：堡 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学 拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构 送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 曰公开口保密( 年) 作者签名：瘤娅 签字日期：壅哔址 导师签名： 签字日期：型翻：盘! 羔3 i 第1 章绪论 第1 章绪论 d n a ，又称脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，遗传信息的主要载 体和基因表达的物质基础，具有储存和传递遗传信息的功能【i 】。d n a 碱基的 不同排列顺序可以组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运作。其中包 含的指令，是构建细胞内的其他化合物，如蛋白质与r n a 所需。带有遗 传编码信息的d n a 片段称为基因，其他的d n a 序列( 非编码d n a ) ， 有些直接以自身结构发挥作用或参与调控遗传信息的表达，有些功能目前 还不明确。 生物体通过d n a 复制将遗传信息由亲代传递给子代，所以d n a 构成了 遗传过程的分子基础。d n a 分子的功能是贮存决定物种性状的几乎所有蛋 白质和r n a 分子的全部遗传信息；编码和设计生物体在一定的时间和空 间有序地转录基因和表达蛋白完成定向发育的所有程序；初步确定了生物 体独有的性状和个性以及和环境相互作用时所有的应激反应。 5 3 f i g u r e1 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fd n am o l e c u l a rs t m c t i i r e 构成d n a 的基本单元是碱基( b a s e ) 、脱氧核糖( d e o x y r i b o s e ) 和磷酸 ( p h o s p h o r i ca c i d ) 。d n a 的碱基有四种：腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、胞嘧啶 ( c ) 和胸腺嘧啶( t ) 。d n a 分子的双螺旋结构口1 是由两条反向平行的多核苷 酸链围绕同一中心轴相互缠绕而成，两条链均为右手螺旋。碱基位于双螺旋内 侧，磷酸与核糖在外侧并通过3 ，5 一磷酸二酯键彼此连接，形成d n a 分子 第1 章绪论 的骨架。碱基平面与纵轴垂直，糖环的平面则与纵轴平行。两条链配对偏向一 侧，形成一条大沟( m a j o rg r o o v e ) 和一条小沟( m i n o rg r o o v e ) 。双螺旋的平均 直径为2n m ，两个相邻的碱基对之间在螺旋轴上的垂直距离为0 3 4n m 。两条 链上的碱基互补配对：a 只能与t 相配对，通过两个氢键连接；c 与g 相 配对，形成三个氢键( 图1 1 ) 。d n a 单链和双链均可以通过扭曲和折叠等形成 更复杂的空间构象，其中，超螺旋是d n a 双螺旋缠绕折叠的一种形式。生物 体内的核酸通常都与蛋白质结合形成复合物，以核蛋白( n u c l e o p r o t e i n ) 的形式 存在。基因组d n a 与组蛋白结合形成染色体( 染色质) 。 1 1 核酸适配体 过去几十年间，抗体技术迅速发展，它对医学及整个生命科学的发展做出 了巨大贡献。但是自从1 9 9 0 年美国科学家t u e r k l 3 1 和e l l i n g t o n 4 1 分别从约 1 0 ”种寡核苷酸分子库中筛选出r n a 型寡核苷酸适配体以来，抗体技术受到 前所未有的挑战。寡核苷酸适配体不但能和抗体一样能与配体高效，专一地结 合，而且有着许多抗体无法比拟的地方，如配体广泛、分子量小、易合成、易 贮存和易修饰等优点。寡核苷酸适配体与配体特异性识别，为生物化学、分子 生物学及生物医学等领域提供了一个高效快速的分析检测研究平台，极大地扩 展了核酸的应用【5 ，6 】。 1 1 1 核酸适配体的体外筛选 核酸适配体( a p t a m e r ，该命名来源于拉丁文a p t u s ，意为“合适、匹配”) 是指利用指数级富集的配体系统进化( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb y e x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ，简称s e l e x ) 技术1 3 , 4 1 ，从人工合成的寡核苷酸序列初 始文库中经多轮筛选得到的能够与相应配体专一性紧密结合的一类单链核苷酸 序列。s e l e x 技术的基本原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链 随机寡核苷酸文库，将合成的寡核苷酸文库与配体混合，然后洗脱去掉未与配 体结合的核酸，分离并保留与配体结合的核酸并以之为模板进行p c r 扩增， 将扩增产物再用于下一轮的筛选。通过重复的筛选与扩增，最后可得到高亲和 力和高特异性的核酸适配体序列【。刀。 这里结合图1 2 说明筛选r n a 适配体的s e l e x 过程。包括以下几个步 骤【7 】：( 1 ) 体外合成随机寡核苷酸文库。用自动固相合成法建立一个碱基数为n 的随机d n a 文库，则文库含有4 n 条不同序列。这些d n a 序列的两端为固 定的引物序列( 以方便p c r 扩增) ，中间为随机序列，长度在2 0 8 0 个碱基。 2 第1 章绪论 文库容量在1 0 ”一1 0 ”之间。5 端引物里包含一段t 7 启动子序列，可被t 7 r n a 聚合酶识别，井转录为r n a 文库：( 2 ) 在适宜条件下，将单链寡核苷 酸文库与靶分予进行温育，使之形成寡核苷酸与靶分子的复合物：( 3 ) 遥过硝 酸纤维索滤膜法、变性凝胶电泳、柱层析法或免疫吸附法等方法将未结台目标 物的寡核苷酸分离出去； ( 4 ) 经洗脱、纯化后，结合靶分子的寡核苷酸从复合 物中解离：( 5 ) 得到的特异结合的寡核苷酸库经反转录- p c r 扩增，相应d n a 产物为下一轮筛选所使用：( 6 ) 继续循环相同的步骤，随筛选轮数的增加，寡 聚核苷酸与靶分子的亲和力逐渐增强，最后得到亲和力和特异性很高的核酸适配 体。一般经过8 - 2 0 个循环过程，可完成筛选过程。将筛选得到的产物克隆入载 体，井对选出的克隆进行测序和结构分析，获知其序列和结构特征。理论上通过 s e l e x 技术可咀筛选出能结合任意配体的核酸适配体配体的范围可以从金属 离予、小分子到氨基酸、多肽、蛋白质，乃至整个细胞。 r e g i o ns y m h “l d n aire 。_ 0 n 露 n p “ 乌 勺 f i g u r e l , 2s c h e m eo f t h e i n v i t r os e l 髓t i o no f 衄r n aa p t a m 日v i a s e l e x t e e l m i q u e s e l e x 技术自提出以来经历了许多革新。大多数改进集中在分离结合与未 结合目标物的d n a 上，例如亲和柱，过滤器，磁珠阻”凝胶电泳，毛细管 电泳t o - 1 9 1 ，表面等离激子共振，原子力显微镜及荧光显微镜等多种技术i 。部 曾被尝试。通过实验室机器人装置实现自动并行筛选1 2 z - z s l 以及微流控装置的使用 2 6 1 推动了s e l e x 技术的向前发展。最近有人报道将一条能够与文库中随机序 劬厂m 一 一 厂二7 巡r 第1 章绪论 列的长链d n a 杂交的短链d n a 固定在亲和柱上，与固定的短链d n a 杂交 的长链d n a 结合目标分子后，由于结构发生转换，从柱子上脱落，然后结合 目标分子的长链d n a 被分离收梨2 7 1 。该方法避免了在柱子上固定目标物的过 程，使固定过程变得容易而且成本低廉。总之，通过s e l e x 技术进行适配体的 选择是目前筛选适配体相对实际可行的办法。 1 1 2 核酸适配体的种类 t a b l e1 1d n a a p t a m e rt a r g e t sr e p o r t e di nl i t e r a t u r e t a r g e tt y p ee x a m p l e s m e t a li o n s k ( d 【3 们，h g ( i i ) t 3 1 】 s m a l l c o c a i n e 3 2 】，c h o l i ca c i d 3 3 1 ，a s p a r t a m e 3 4 1 ，17 f l - e s t r a d i o l 3 5 】 o r g a n i cm o l e c u l e s t h e o l y p h l l i n e 3 6 1 ，p o r p h y r i n s 3 7 】 n u c l e o t i d e s a t p ( o ra d e n o s i n e , a m p ) 3 8 】 a m i n oa c i d s a r g i n i n e 3 9 4 0 l - t y r o s i n a m i d e 4 1 】 o r g a n i cd y e s r e a c t i v eg r e e n19 4 2 1 ，s u l f o r h o d a m i n eb 4 3 1 ，c y a n i n ed y r e 4 4 1 e n z y m e s h u m a nt h r o m b i n l 4 5 1 ，n e u t r o p h i le l a s t a s e 4 6 1 ，h i v - 1r n a s eh 4 7 1 ， t a qd n ap o l y m e r a s e 4 8 1 ，h i v - r e v e r s et r a n s c r i p t a s e 4 9 1 ，p r o t e i n k i n a s ec 5 0 1 g r o w t hf a c t o r sp l a t e l e t d e r i v e dg r o w t h f a c t o rb c h a i n 5n ，h u m a nb a s i c f i b r o b l a s t g r o w t hf a c t o r 5 2 1 ，h u m a nk e r a t i n o c y t eg r o w t h f a c t o r i s 3 a n t i b o d i e sh u m a n i g e 5 4 】 r n at a r r n a i s s i o l i g o s a c c h a r i d e s c e l l o b i o s e 5 6 1 s i a l y l l a c t o s e 5 7 】 d r u g s ( r ) - t h a l i d o m i d e 5 8 1 v i r a l p r o t e i n s o ri n f l u e n z av i r u ss u r f a c eg l y c o p r o t e i n s 5 9 , 6 0 ，h i vm n e n v e l o p e c o m p o n e n t sg l y c o p r o t e i n 6 0 6 1 ，t e n a s c i n c 【6 1 】 c e l l sa n db a c t e r i aa n t h r a xs p o r e s 6 2 1 ，y p e n 1e n d o t h e l i a l 6 3 1 ，p ci2c e l l s 6 q ，j u r k a t tl e u k e m i ac e l l s 6 5 1 ，c c r f c e ml e u k e m i ac e l l s 6 6 1 s m a l l - c e l l l u n gc a n c e r ( s c l c ) c e l l sf 6 7 】b c e l lt u m o rc e l l s 6 8 l 适配体一般由几十个核苷酸( 2 0 6 0 个碱基) 组成，可以是r n a 或者单 链的d n a 分子。适配体是通过s e l e x 技术筛选得到的，加之单链核酸可形 4 第1 章绪论 成三维结构的多样性及适配体与配体相互作用的多样性，理论上自然界的多数 物质( 各种有机小分子、生物大分子、细胞器、甚至是组织) 都可以筛选出相 应的核酸适配体【2 引，所以配体范围非常广泛。 目前已经筛选得到多种目标物的适配体。1 9 9 6 年，仅n e x s t a r 药物公司和 科罗拉多大学得到的适配体就超过一百种。目前，全世界的科学家分离得到的 适配体种类繁多，已经远远不止这个数卧2 9 1 。表1 1 列出了部分文献已报道的 各类目标物的d n a 适配体，包括金属离子，有机小分子，氨基酸，蛋白质， 抗体，病毒，药物，甚至是整个细胞等。 1 1 3 核酸适配体与配体的相互作用 适配体与配体的亲和力非常强，解离常数可达n m o l l - 1 或p m o l l 1 级 别。核酸适配体与各种配体的结合是基于核苷酸序列及其空间构象的多样性， 通过链内某些互补碱基间以及分子间的相互作用等自身发生适应性折叠，形成 稳定的三维空间结构，如发夹( h a i r p i n ) 、假结( p s e u d o k n o t ) 、衅四联体 ( g q u a r t e t ) 、茎环( s t e m 1 0 0 p ) 等，决定这些结构的碱基往往是与配体结合的 重要位点。采用核磁共振或x 射线衍射等手段可以从结构上对核酸适配体与 配体的作用机理进行较为深入的研究。 从对获得的一些高分辨的核酸适配体与配体复合物的三维结构研究中发现 核酸适配体与配体主要通过“假碱基对”( p s e u d ob a s ep a i r s ) 的堆积作用、氢键 作用、静电作用和形状匹配等产生高特异性的结合力【6 9 1 。“假碱基对”的堆积 是指配体的芳香环部位与核酸分子的碱基平面平行，并有重叠，类似于核酸分 子里的碱基堆积作用。如茶碱分子中的芳香环能与其核酸适配体分子里的碱基 重叠p 6 1 。在多数的核酸适配体一配体复合物里，尤其是核酸适配体一蛋白质复合 物，堆积作用扮演一个关键角色。其次是氢键作用，如分子的侧链进入核酸分 子折叠部位的深处，与核酸的碱基形成较强的氢键是核酸适配体识别精氨酸的 重要原因【7 们。形状匹配和静电作用是核酸适配体能特异识别氨基葡糖苷的主要 原斟7 。 凝血酶是一种能够使血液凝固的重要的丝氨酸蛋白酶，其结构中存在纤维 蛋白原( f i b r i n o g e n ) 结合位点和肝磷脂( h e p a r i n ) 结合位点【7 2 】( 图1 3a ) 。1 9 9 2 年，b o o k 等人首次分离得到了1 5 个碱基长度的凝血酶的寡核苷酸适配体【4 5 1 ， 离解常数( 肠) 大约为1 0 0n m 。适配体的结构为一分子内的g - 四螺旋结构( 图 1 3b ) ，能够与纤维蛋白原位点结合。结晶数据表明同样的适配体也能够与肝 磷脂位点结合1 7 3 。m a c a y a 及其合作者也独立进行了凝血酶适配体的筛选研究 【7 训，该序列除了包括四螺旋结构还含有一段双链区域( 图1 3c ) ，该适配体被 5 第1 章绪论 发现具有更高的亲和力( 1 0 2 5n m ) 。以上筛选都是将凝血酶吸附在刀豆球 蛋白小琼脂糖凝胶上进行的。t a s s e t 及其同事利用硝化纤维素过滤膜 ( n i t r o c e l l u l o s ef i l t e r ) 分离结合和未结合凝血酶的d n a ，得到了肝磷脂结合位 点更高亲和力的适配体( k a 0 5r i m ) ( 图1 3d ) 【7 5 】。通过对适配体与凝血酶 的作用机理进行研究发现，二者的结合主要是通过适配体特殊的g 一四螺旋结 构与凝血酶侧链上a r 9 1 2 6 、l y s 2 3 6 、l y s 2 4 0 和a r 9 9 3 几个在生理条件下带正 电荷的氨基酸之间的静电相互作用r 7 6 】。 ab h e p a r i nb i n d m g e x o s i t e f i b r i n o g e nr e c o g n i t o n e x o s i t e 产 d u f i g u r e1 3d n aa p t a m e r sa g a i n s tt h r o m b i n ( a ) s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h et w os i t e so i l t h r o m b i nt h a ti n t e r a c tw i t ha p t a m e r s ( b ) t h e15 - m c ra p t a m e rw i t hag - q u a d r u p l e xs t r u c t u r e t a r g e t i n gt h ef i b r i n o g e n r e c o g n i t i o ne x o s i t e f 4 5 】( c ) a p t a m e rw i t ha l la d d i t i o n a ld u p l e xr e g i o n t a r g e t i n gt h ef i b r i n o g e n - r e c o g n i t i o ne x o s i t e 7 7 1 ( d ) a p t a m e rt a r g e t i n g t h eh e p a r i n b i n d i n g e x o s i t e 7 钔 1 1 4 核酸适配体的优点 与抗体相比，核酸适配体有诸多无可比拟的优点【2 引。适配体是体外筛选得到 的，原则上可以根据需要来筛选任何目标物的适配体。而抗体具有种类有限，不 易修饰，容易失活，及制备依赖于动物或细胞环境等缺点。 虽然蛋白质的化学功能丰富，但核酸适配体与目标分子的高度亲和性完全可 以与抗体的这些性质相媲美。就亲和性而言，由n e x s t a r 药物公司和科罗拉多 大学筛选的前一百种蛋白质的适配体，7 5 以上与其配体的离解常数小于l n m ，而多数抗体的离解常数在1 到1 0n m 之间【8 2 1 。2 一荧光嘧啶修饰过的r n a 适配体与其目标物一由1 6 5 个氨基酸构成的血管内皮生长因子( v 】三g f ) 的离解 常数为4 9p m 7 8 】；而另一篇报道关于人角化细胞生长因子与其适配体的离解常 6 多住 扩gi一一七拳 一 第1 章绪论 数低达o 3p m t 2 引。j i a n g 等人【7 9 】以免疫球蛋白e ( i g e ) 及其d n a 适配体为模 型体系，用原子力显微镜研究了二者的相互作用力，并将i g e 和核酸适配体的 相互作用与i g e 和抗体的相互作用进行了比较，发现核酸适配体与蛋白质的作 用力与抗体抗原的作用力相当，甚至强于抗体抗原的作用力。 适配体对其目标物具有非常高的选择性。血小板衍生生长因子( p d g f ) b 链的d n a 适配体对于其同型二聚体( p d g f b b ) 的选择性比对从链高约 3 7 0 倍【5 l 】。虽然茶碱( t h e o p h y l l i n e ) 和咖啡因( c a f f e i n e ) 在分子结构上仅差一 个甲基，但是茶碱的核酸适配体对茶碱结合的亲和力比对咖啡因的高l o ，0 0 0 倍 【4 1 1 。l 一精氨酸的适配体结合d 一精氨酸后，亲和力下降1 2 ，0 0 0 倍 8 0 】。很多研究 表明适配体与抗体检测同一目标物时，适配体与抗体的效果相当或者更优 8 1 - 8 4 】。 适配体在试管中分离得到，可以批量化学合成，而抗体的生产要求在动物或 细胞环境内。相比之下，适配体的成本相对低廉，更适合大多数应用。分子大小 方面，大多数哺乳动物抗体的基本结构是一个由四条多肽链( 二硫键连接的两条 重链和二条轻链) 组成的糖基化蛋白，其分子量约1 5 0 ，0 0 0d a ；而大多数适配 体的组成少于1 0 0 个核苷，分子量小于3 3 ，0 0 0d a ，比抗体的结构小得多。例 如，凝血酶的适配体仅由1 5 个核苷组成【3 5 】。适配体尤其是d n a 适配体，比 抗体要稳定得多。d n a 适配体的性质是可逆的，经过热变性、复性多个循环后， 几乎不会丧失结合能力，而抗体变性后通常不能恢复之前的性质。对核苷可以进 行化学修饰或者连接，修饰后可增加适配体在生物环境中的稳定性。在目标物的 存在下，适配体容易形成三级结构，有利于防止核酸酶的水解攻击【3 6 1 。 适配体在信号传导方面优于抗体。多数基于抗体的检测方法亦可由适配体成 功替代。此外，由于核酸结构的可预测性和可裁剪性，适配体适用于许多独特的 信号检测方法中。还可根据需要，通过化学合成，在任何选择的位置上修饰化学 基团。 综上所述，不论是在制备，对目标物的结合性和选择性，还是在分子结构及 性质方面，核酸适配体都与抗体相当或者更有优势，因此适配体在应用方面的前 景将非常广阔。 1 1 5 核酸适配体的应用 核酸适配体的出现，使人们认识到核酸不仅是遗传信息的存储和转运载体， 而且可作为生物功能分子应用到多个领域。由于与配体具有高度亲和力，核酸 适配体是理想的传感器的识别元件，在生物传感器领域将有很广阔的应用前景， 特别是在分析化学方面的应用逐渐成为人们关注的焦点，许多相应的分析检测 方法应运而生【7 1 。 7 第1 章绪论 核酸适配体在不同条件下可以反复变性、复性以及与配件相互作用后构 型会发生变化，这些特点表明它能应用于自组装化学，成为分子开关、分子机 器等。s m o l k e 课题组报道了模块化的、具有广泛适用性的、基于r n a 的配 体控制的基因凋节平台p ”，称之为核酶开关。核酶开关由适配体序列构成的传 感区( s e n s o r d o m a m ) 和锤头状核酶构成的激励区( a c t u a t o rd o m a i n ) 两个模块 组成。实验过程中通过模块区域之间的分子链置换( s t r a n d - d i s p l a c e m e n t ) 和 双螺旋区滑移( h e l i x s l i p p i n g ) 的信息转导机制，实现效应分子( 茶碱、黄苷等) 对基因调节平台的调节控制。图14 是荼碱分子通过裂螺旋区滑移信息转导机 制实现对核酶开关的调控。 矿 p 。 世 ，一0童：， 避琶：；擎 f i g u r e i r e g a l m o 叮p r o i m r f i e so f t h e h e l i x - s l i p ；m g i