（分析化学专业论文）小分子化合物与dna的相互作用及壳聚糖的电化学研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r l s t h e s i s 中文摘要 d n a 是生物体中重要的一类生物大分子，对生命遗传密码的翻译、转录、复 制起着非常重要的作用。而d n a 与识别分子的相互作用研究成为生命科学研究中 的热门领域之一。电化学法和光谱法两种研究技术的有机结合对于深刻理解d n a 与识别分子相互作用的机理具有重要意义。壳聚糖( c t s ) 是一种天然碱性高分子多 糖，其特殊的分子结构使得壳聚糖对许多离子、有机物、生物分子等具有离子交换、 螯合、吸附等作用，被广泛应用于化学领域。然而目前对于c t s 含量测定的报道较 少，而用电化学方法直接测定c t s 未见报道。本文利用电化学，紫外可见光谱和 荧光光谱法研究了几种小分子化合物与d n a 的相互作用机理。并对壳聚糖的电化 学行为进行了研究。论文主要包括了以下几个方面： ( 1 ) 利用电化学，紫外一可见光谱法研究了c t 五m b c u ( i i ) 络合物与鱼精子 d n 舢s d n a ) 的相互作用及其机理，提出了两者之间的相互作用是通过 c t z a m b ，c u ( 1 1 1 与d n a 外部的磷酸基团发生静电作用实现的。两者形成新的化合 物，从而使得络合物的峰电流降低，峰电流在一定范围内与d n a 的浓度成线性关 系。利用该方法进行了d n a 含量测定，线性范围为3 o 1 0 1 7 o 1 0 6 空m l ，检 出限为1 o 1 0 7 咖l 。 ( 2 ) 利用电化学，紫外可见光谱，荧光光谱法研究了b z 与鱼精予d n a ( h s d n a l 的相互作用及其机理，提出了两者之间的相互作用是通过b z 部分插入d n a 双螺 旋中实现的。两者形成新的化合物，从而使得b z 的峰电流降低，峰电流在一定范 围内与d n a 的浓度成线性关系。利用该方法进行了d n a 含量测定，线性范围为 7 o l c r 8 6 o x l 0 。6 m l ，检出限为3 o 1 0 8g ，m l 。 ( 3 ) 研究了壳聚糖( c t s ) 在o 0 5 m 0 1 l 邻苯二甲酸氢钾( k h p ) 缓冲溶液( p h 2 5 ) 中的电化学行为、最佳测定条件及其电极反应机理。实验证实了c t s 在 p 缓冲 液中的降解和c t s 降解产物在m 舡) e 上的氧化还原。将该方法用于真实样品中壳 聚糖的定量测定，线性范围为5 ox1 0 _ 1 1 5 1 0 _ 5g m l ，检出限为1 o 1 0 - 7 9 m l 。 关键词：电化学，紫外- 可见光谱，荧光光谱，c t z a m b c u ( i i ) 络合物，联苯 胺( b z ) ，鱼精子d n a ( h s d n a ) ，壳聚糖( c t s ) 硕士学住论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t d n ai sal 【i n do fk e yb i 0 1 0 西cl a r g em o l e c u l e ，a n di tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei n1 i f e g e n e t i cc o d e i n t e 印r e t a t i o n ，t t a n s c r i p t i o na i l dc 叩y t h er e s e a r c ha b o u tt l l ei n t e r a c t i o no f d n aw i t hd i s t i n g u i s h i n gm o l e c u l e si st h cp o p 丘e l do fl i f cs d e n c e t 1 l ec o m b i n a t i o no f e l e c t r o c h e m i s t r ya n ds p e c t r a ls t u d i e si si m p o n a n tt ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s mo ft h e i n 把r a c t i o o fd n aw i t hs m a j im o l e c u l a rc o m p l e x e s c h n o s a n ( c i s ) i so n eo ft h en a t u r a l p o l y m e r s ，a n di t ss p e c i a ls t n l c t u r em a k ei td e m o n s t r a t eu n i q u ec x c h a n g e ，c h e l a t i o na i l d a d s o r p t i o na b i l i t i e st o w a r d sm a l l ym e t a lc a t i o n s ，o r g a l l i cs u b s t a n c e sa n ds oo n ，w h i c h a l l o wj tt ob ew i d e l yu s e di nc h e m j s l f y n ef e p o n sa b o u tt h ed e e 瑚j n a l j o no fc 1 sa f e f e w ，a n dm o s t l yf o c u so ns p e c t r o p h o t o m e t r y h 0 w e v e r ，ar e p o na b o u tu s i n gt h ed i r e c t l y e l e c t r o c h e m i c a ld c t e n n i n a t i o nh a sn o tb e e ns e e n i nt h i st h e s i s ，t h em e c h a n i s mo fs o m e k i n d so fs m a nm o l e c u l a rc o m p l e x e sw i t hd n aw a ss t u d i e db ye l e c t r o c h e m i s t f y ，u v _ v i s s p e c t m p h o t o m e t r ya n dn u o r e s c e n c es p e c t r o p h o t o m e t r y ，柚dt h em e t h o d sw e r ea p p l i e dt o t h ea n a l y s i s a n db e s i d e s ，w ec a 盯i e do u tt h es t u d yo ft h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so f c h i t o s a i l ( c 耶) ，w h i c hw a su s e dt od e t e m i n et h ec t si ns 锄p l e s n l em a i nc o n t e n t sa r e l i s t e da sf o l l o w s ： ( 1 ) w es t u d i e dt h ei n t e r a c t i o no ft h ec t z a m b c u ( i i ) c o m p l e xw i t hd n ab yt h e e l e c t r o c h e m i s t r ya n du v - v i ss p e c t r a lm e t h o d s ，a n ds u g g e s t e dt h a tc t z a m b c u ( i i ) c o u l di n t e r a c tw i t hp h o s p h a t eg r o u p so u t s i d eo fd n a b ye l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n t h e f o 瑚a t i o no ft h ec r z a m b - c u ( 1 i ) - d n ac o m p l e xr e s u l t si nt h ed e c r c a s ei np e a kc u r r e n t ， a i l dt h ed e c r e a s eo fp e a kc u h e n ti sl 协e a rw i t hd n ac o n c e n t r a t i o nj nt h er a n g ef r o m3 0 1 0 _ t o7 0 1 0 由咖la n d t h e d e t e c t i o n l i m i t i s l 0 1 0 一m l ( 2 ) w e s t i l d i e dt h ei m e r a c t i o o fb zw i t hd n a b yt h ee l e c t r o c h e m i s t r ya n du v v i s s p e c t r aa i i dn u o r e s c e n c es p e c t r am c t h o d s ，柚ds u g g e s t e dt h a tb zc o u l dj i l t e r a c tw i t h d n a b yp a r t i a li n t e r c a l a t i o nm o d c t h ef o f i l l a t i o no ft h eb z d n ac o m p l e xr e s u l t si nt l l c d e c r c a s ei np e a kc u r r e n t ，柚dt h ed e c r e 弱e0 fp e a kc u r r e n “sl i n e a rw i t hd n a c o n c c n t r a n 0 i nt h er a i l g e 矗d m7 o 1 0 岱t o6 o 1 0 曲g ，m la n dt h ed e t e c t i o nl h i “s 3 0 1 0 。8 9 m l ( 3 ) w es t u d i e dt h ed e c t f o c h e m i c a lb e h a v i o r so fc h j t o s a n ( c t s ) i nao 0 5m o l 几 p o t a s s i u mh y d r o g e n _ p h i h a l a t eb u f f e rs o l 砸0 n ( p h2 5 ) t h ec h a r a c i e r i s t i c sa i l dt h e 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s m e c h a i l i s mo ft h ed e c t r o d er e a c t i o nw e r ea l s oi n v e s t 蟾a t e d ，孤dt l l i sm e t h o dw a sa p p l i e d t od e t e m i n et t l ec o n t e n to fc t si nt h es a m p l e s t h ep e a kc u e n ti sl i n e a rw i t ht h e c o n c e n t r a t i o no f ( 可s 打o m5 0 1 0 - 7t o1 5 1o _ 5 咖i a n dt h ed e t e c t i o nl i m i ti s1 o 1 0 7 m l k e y w o r d s ： e l e c t r o c h e m i s t r y u v _ v i s s p e c i i o p h o t o m e t r y ， f 1 u o r e s c e n c e s p e c t r o p h o t o m e t r y c t 必m b c u ( i i )c o m p l e x ，b e n z i d i n e ( b z ) ，h e r r i n gs p e 珊 d n a ( h s d n a ) ，c h i t o s a n ( c r s ) 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的 成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作 品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的 法律结果由本人承担。 论文作者签名：王丽柴 日期：2 0 口f 年f 月7 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解华中师范大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中师 范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制平段保存和汇编本学位论文。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名：王丽菜 日期：2 口喏年占月7 日 导师签名：渺钒 日期：哪年月，日 本人已经认真阅读“c a u s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提 交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。旦重迨 塞埕銮厦澄厦! 目圭生i 目= 生；目三生蕉壹。 论文作者签名：王丽棠 日期：2 卯f 年f 月7 日 导师签名：矿易气但 醐州刚7 日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第一章绪论 1 1d n a 与小分子化合物相互作用的研究意义 d n a 是储存和传递信息的分子，是组成染色体的主要成分，它包含了遗传信 息，并参与这些信息在细胞内的表达，其基本功能是作为遗传信息的载体，为生物 遗传信息复制以及基因信息的转录提供模板，从而促成代谢过程并控制这过程。 由于d n a 介入了生物的生长、发育和繁殖等正常生命活动，并与致癌等生命的异 常情况也密切相关。因此研究d n a 结构与功能的关系，将有助于人们从分子水平 上了解生命现象的本质。d n a 的研究对于重组的筛选，基因分析，染色体的基因 定位，以及各种异常的遗传病、传染病，及肿瘤、癌症等的诊断、医治有重要意义。 同时，人们为了能够从基因水平理解某些疾病的发病机理，并通过分子设计来寻找 有效的治疗药物，d n a 往往是药物设计时很重要的作用靶之一。 d n a 的研究是生命科学及其相关科学领域极其重要的研究内容之一。9 0 年代 以来，d n a 与其靶向分子( 以d n a 作为作用靶点的分子) 相互作用的研究已经成 为化学和生命科学热门研究课题之一。目前有关d n a 的研究已涉及d n a 的电子特 性及生物学特性、d n a 与其它分子的相互作用、基因：毒片、d n a 材料等方面。而 d n a 与其它分子相互作用的研究，对于了解生命过程中这种相互作用对生命活动 的影响及对生命体内的调节、控制作用，认识某些分子对d n a 体内复制和转录的 影响，以及由此引起的物种性状的变异，深刻理解化学核酸酶的作用机理，从而指 导高度专性的d n a 人工核酸酶的合成，研究以d n a 为靶的抗癌、抗菌药物作用 的机理及指导新药合成和建立药物筛选新方法、分子识别分析以及基因传感器杂交 指示剂的筛选等方面具有重要的理论意义和实用价值。 1 2d n a 与小分子化合物相互作用的研究基础 1 2 1d n a 的结构和组成 脱氧核糖核酸( d n a ) 是生物的基本遗传物质，它是一种由脱氧核糖核苷单磷 酸通过3 ，5 磷酸二酯键连结而成的多聚核苷酸，其基本的化学组成是：戊糖( b d 2 脱氧核糖) 、磷酸和碱基。生物遗传物质就储存在d n a 分子中四种碱基腺嘌呤( a ) 、 鸟嘌呤r g l 、胞嘧啶( c ) 和胸腺嘧啶( t ) 的核苷酸序列( 即d n a 一级结构) 中。 d n a 籍两条多聚脱氧核苷酸链上方向相反的互补碱基( a - t 和g c ) 之间的氢键作 用而形成有规律的d n a 双螺旋二级结构。四种疏水性的碱基位于螺旋的内侧，带 负电荷的、亲水性的磷酸基与脱氧核糖单位处于外侧。相邻碱基对平面之间间隔处 于v a nd e rw a a l s 距离内，因此碱基平面上分布的p 电子云系统之间的吸引力、碱 基上永久性偶极间的作用力和诱导偶极的相互作用等分子间作用力使碱基之间存 在堆积作用。 由于d n a 是一种柔性的生物分子，这使得d n a 双螺旋可采用不同得构象， 如a ，b ，c ，d ，z 等形式。d n a 采用哪种构象，很大程度上取决于环境条件，如 盐得种类，相对湿度等。b 型是大多数天然d n a 的存在形式，其结构特点是两条 呈反平行的多核营酸链围绕同一螺旋轴旋绕而形成右手双螺旋，每十个碱基对旋转 一圈形成一个螺旋结构，螺距3 4 n m ，螺距直径2 肿。d n a 不同构象所具有的特征 使得小分子配合物来识别d n a 的二级结构成为可能。d n a 二级结构是生命遗传信 息得以传递的基础，也是目前d n a 传感器、基因芯片以及d n a 作为生物材料应用 的基础。d n a 分子在双螺旋结构的基础上再通过超螺旋形成各种拓扑结构，即d n a 三级结构，甚至还出现四链的d n a 结构【1 3 】。d n a 结构的稳定性主要来源于三种 力：一是互补碱基对之间的氢键；二是碱基堆积力，由芳香碱基上的p 电子之间的 相互作用产生，是比较主要的力；三是来自于磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子 之间的静电作用力。 图1 d n a 一级结构上 的一个小片段 图2 d n a 的双螺旋结构 1 2 2d n a 与小分子化合物相互作用的基本方式 小分子与d n a 的结合区位于碱基、磷酸骨架以及戊糖环部分。d n a 由平行堆 积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条脱氧核苷酸链形成的大沟、小沟组成分 子的识别位点，作用方式主要有三种：非共价键结合、共价键结合和剪切作用。 1 2 2 1 非共价键结合 d n a 与小分子间的非共价键结合是可逆的，包括静电结合、嵌插结合和沟槽 结合三种模式【”。 ( 1 ) 静电结合，即分子通过非特异性的相互作用结合于带负电荷的d n a 双螺旋 外部，没有选择性【5 l 。通常认为这种作用模式在作为药物的应用上价值不大。但也 并非完全如此，例如，p y p 金属卟啉带正电的侧链与d n a 磷酸骨架的静电结合 对它能嵌入结合在g c 碱基对之间起了必不可少的稳定作用。 ( 2 ) 嵌插结合，即在碱基对之间嵌入平面的或几乎平面的芳香环系统。嵌插结 合的作用力来自芳还的离域p 体系与碱基的p 体系之间的p p 相互作用及疏水相互 作用。这是药物分子与d n a 发生作用的最重要的形式之一【6 j 。基于小分子的结构 不同，嵌插作用又可以分为单链嵌插和双链嵌插作用。一些经典的嵌入剂主要是平 面的带正电的芳香族小分子，由于其分子体积小，具有一定的平面性可以嵌入到 d n a 的双螺旋碱基对之间。非经典的嵌入剂主要有两类：一类是双嵌入剂，它是 两个嵌插环被不同长度的链共价连接起来，相对于一元嵌插剂来说，作为药物的生 物活性往往由于与d n a 的强结合而增强。另一类是带有多个大取代基的嵌插剂。 如果嵌插剂带的取代基太大，或有极性，或带有电荷，则对嵌插剂结合及分解的动 力学都会有影响。通常稠合芳环体系都倾向于结合在g c 富集区【”，而对于一些含 有庞大取代基的分子，如吡啶环取代的卟啉分子在与d n a 作用时，吡啶环取代基 会尽量旋转，以保持与母环的共平面，从而形成良好的堆积形状与d n a 碱基嵌合。 当小分子嵌入d n a 碱基对之间后，有的可以直接抑制埘姐复制与转录的功能；有 的则在经过进一步活化后，使得d n a 断裂受损而影响其功能。 ( 3 ) 沟槽结合，即靶向分子与d n a 的大沟或小沟的碱基对边缘直接发生相互作 用。大分子蛋白质结合于d n a 的大沟槽中，而大多数小分子则是在小沟槽区作用。 小沟槽区内是衄富集斟8 】，小分子通过与胸腺嘧啶碱基c 2 上的羰基氧或腺嘌呤 顿士学位论文 m a s t e r st h e s i s 碱基n 3 上的氮形成氢键与a t 碱基结合。纺锤菌素和h o e c h s t 3 3 2 5 8 两种经典的小 沟结合分子与d n a 切割剂( 如阳离子卟啉) 连接后，可以得到亲和性及对a t 序列 选择性都明显增强的人工核酸酶【9 ”j 。近年来发展起来的反以寡聚核苷酸，因其能 按严格的碱基对互补原则，通过h o o g s t e e n 氢键结合在双螺旋d n a 的大沟中而形 成局部的三螺旋结构，因而可精确识别核酸所携带信息的特异性序列。因此一方面 可通过将一些具有特定功能的活性基团缀接与寡聚核苷酸末端，而得到高度选择性 的人工核酸酶或药物分子原型：另一方面如已知靶分子的核苷酸序列，有可能根据 反义寡核苷酸的碱基序列直接写下抑制物的化学结构，这一点有利于药物分子的合 成。 这三种作用模式并不是相互排斥的，往往许多试剂可以通过多种模式与d n a 结合，有时是一种作用模式结合后诱导另一种模式的结合。如c o ( p h e n ) 3 c 1 2 即可以 通过静电作用与d n a 结合，又可以采取嵌入模式结合到d n a 双螺旋结构中。在沟 结合方面，人们也提出了序列选择性识别、位点专一性识别、形状选择性识别等识 别机理。 静电结合沟槽结合嵌插结合 图3d n a 与小分子作用的三种模式 1 2 2 2 共价键结合 药物分子与d n a 的共价结合主要是同各种碱基的反应，如亲核反应，亲电反 应，加成反应等。主要表现为核酸的烷基化以及d n a 的链间交联、链内交联等， 共价结合的序列识别能力比非共价结合要强得多。例如d u o c 锄y c i n 及其衍生物， 只能在d n a 小沟中对衄富集区识别，分子中活泼的环丙烷与小沟内特定碱基序列 4 中a 的n 3 共价结合后导致该位点脱去嘌呤【1 1 1 2 1 。早期使用的绝大多数抗癌药物具 有使d n a 烷基化的功能，它们对细胞的作用基本上没有选择性，所以临床使用有 严重的毒副作用。 1 2 2 3 剪切作用 d n a 断裂在d n a 修复、转录及突变中是很重要的生物学过程。具有剪切作用 的分子断裂d n a 的位点是由其与d n a 结合的选择性决定的。目前天然的抗生素类 d n a 断裂剂有博莱霉素、针棘霉素等。合成的d n a 断裂剂有邻菲咯啉为配体的弱 酸性金属配合物，它们具备对d n a 结构特异性断裂功能。 1 2 3d n a 与不同种类小分子化合物的相互作用 1 2 3 1 金属配合物 近年来金属配合物与d n a 键合作用之所以引起了人们日益重视，是因为这类 化合物有广泛的应用前景。如可作为d n a 的结构探针、d n a 断裂配基、对d n a 的某些位点的特定性剪切、研究核酸结构和测定核酸序列、d n a 传感器的杂交剂 及抗癌化疗药物等。研究其与d n a 的键合与识别机理成为近十多年来国内外研究 比较活跃的领域之一。 ( 1 ) 铂配合物：自从6 0 年代r o s e n b e r 窟【1 3 j 发现顺二氯二氨合铂( i i ) 的抗癌活 性以来，有关顺铂及其具有类似结构的平面四边形铂配合物的抗癌活性研究一直非 常活跃 1 4 ，1 5 】。目前除顺铂及卡铂已用于临床外，还有几种也已处于临床实验阶段。 大量的研究表明，这类药物的抗癌活性与其能和d n a 链共价结合并导致d n a 结 构变化的能力密切相关【1 6 ，1 。”。 ( 2 ) 金属卟啉配合物：金属卟啉是一类广泛存在于自然界中的生物活性物质。 对铜卟啉的研究表明 1 8 j ，c u b 气e ) 可能主要靠卟啉中带正电荷的吡啶基与d n a 上 带负电荷的磷酸基团通过静电作用结合。c u t m y p 和c u ( n a c n ) 则分别主要通过嵌 入和沟槽作用与d n a 结合。现在，虽然已有很多有关卟啉一d n a 之间相互作用的 研究，但不同结合模式与其生物活性问的关系尚未阐明，因此探讨在生物体内具有 最佳活性的作用模式是十分重要的。 5 ( 3 ) 稀土离子、过渡金属离子及其配合物：一些金属离子，特别是一些过渡金 属离子，它们能与d n a 发生缔合作用，使某些d n a 的结构发生改变【1 9 ，删。f q t a 【2 1 】 等的研究发现，【c o ( n h 3 ) 6 3 + 】等离子的正电荷可以使d n a 集结，浓缩，并进一步 产生沉淀。但如果在溶液中存在n a + ，m 9 2 + 等一价或二价离子时，就可以抑制d n a 的集结。r o d r i g u e z l 2 1 瞎利用循环伏安法和电化学发光方法研究了【o s ( b p y ) 3 “】与小 牛胸腺d n a 之间的作用，发现其氧化形式【o s ( b p y ) 3 “】与d n a 的作用更强烈。我 国在这一方面的研究也较多，扬频【2 2 2 4 】等以c o “、n i 2 + 为中心离子，合成了 【c 0 0 h e n ) 2 d p p z 】3 + 、【c 0 ( b p y ) 2 d p p z 】3 + 、【n i o h e n ) 2 d p p z 】2 + 等配合物，并研究了它们与 小牛胸腺d n a 的相互作用。 1 2 3 2 药物分子 药物分子的药理作用涉及的是药物小分子( 主体) 对生物大分子( 客体) 特定 部位的识别和专一性切割作用。对整个大分子构象产生影响，因而合理、高效的药 物分子设计的基础就是建立在分子识别尤其对生物大分子识别的分析理论上，基因 药物它可直接作用于遗传物质核酸上，因而成为一些疑难病症的特效药物。 蒽环类抗生素是一类研究的比较多的抗癌抗生素。其共同结构特征是含有一个 由3 个共平面的六元环所组成的氢并四醌发色团。阿霉素( a d r i 锄y c i n ，a d m ) 是癌症化疗中所用的最重要的药物之一，对多种人体肿瘤表现出活性。关于阿霉素 的生物活性机理研究迄今由两种观点：一种认为阿霉素直接与d n a 相互作用( 嵌 插结合) 而导致d n a 复制及转录过程的抑制；另一种观点则认为阿霉素能诱导氧 自由基的形成，从而导致对d n a 的切割”】。道诺霉素( d a u n o m y c i n ，d n m ) 是已临床使用的一种抗癌药物，它通过嵌插方式与d n a 结合。它在d s d n a 修饰 电极上的峰电位比在s s d n a 修饰电极上的有明显正移，两者的峰电位相差约 3 4 m v ，这说明道诺霉素与d s d n a 和s s d n a 的相互作用方式有所区别【2 ”。柔红霉 素( d a u n o n l b i c m ，d n r ) ，和阿霉素一样，芳环部分可嵌入d n a 碱基对之间【2 8 1 。 乙撑亚胺类抗生素是一类非常重要的烷化剂，丝裂霉素c ( m i t 响v c i i nc ，m c ) 作为临床上常用的抗肿瘤剂，是这类化合物的代表。研究表明，m c 所具有的抗肿 瘤能力及强细胞毒性均与它和d n a 双链共价交联的能力有关。m c 在与d n a 结合 之前，必须经过还原活化过程，活化后的m c 先与d n a 结合使之单烷基化，然后 产生双烷基化产物。m c 在单烷基化d n a 时具有高度的序列选择性，即有限与5 i c g 和5 g g 序列上的鸟嘌呤结合。丝裂霉素c 的还原以及形成与d n a 的亲核中心共 硕士学位论文 m a s t e r st h e s t s 价反应的机理研究已经证明，这个抗生素紧紧地结合在d n a 的大沟区【2 9 ，矧。 博莱霉素( b l e o m v c i n ，b u ) 在f e 或c u 等具有氧化还原活性的金属离子 与氧同时存在的条件下，对d n a 的单链及双链进行切割1 3 1 ，3 2 j 。h i g i lm o b i l i t yg r o u p ( h m g ) 是一类分子量比较小的酸性非组蛋白质，研究表明h m 0 主要通过沟槽 作用在d n a 小沟区富含a t 碱基的部位结合【。纺锤霉素( n e 仃o p s i n ) 是一种抗 病毒物质，d i c k e r s o n 等已经得到了纺锤霉素结合到d n a 双螺旋结构d ( c g c g 盯c g c g ) 2 的结晶，纺锤霉素结合到d n a 双螺旋的a a l - r 中心，并 取代了游离寡聚核苷酸区域中的水和骨架部分【3 。 此外还有氨茴霉素、茅屋霉素、西伯利亚霉素以及新乳霉素a 和b 偏端霉素 等，均有与d n a 相互作用的相关文献报道【3 5 ，3 矾。z h a n g 等也对其进行了综述f 3 7 ，3 踟。 1 2 3 3 有机染料 染料与核酸反应机理对于了解核酸生物反应历程，临床医学研究及核酸的分析 测定均有重要意义。研究的方法也有很多，其中研究最多的为荧光法，d n a 荧光 很弱不能直接用荧光技术研究d n a 的结构和性质，而须引入荧光探针。染料作为 d n a 分子荧光探针，其与d n a 的作用方式有：嵌插、缔合和共价键型。目前作为 核酸探针的有机染料有几十种，按探针结构分为：菲啶和吖啶染料、吲哚和咪唑染 料、碳菁阳离子染料、苯并呋哺酮( 香豆素) 类等l ”。菲啶和吖啶染料主要包括溴 乙锭、碘丙锭、碘己锭和吖啶橙等【舯 4 ”。溴化乙锭( e b ) 是应用最早和最广的荧光探 针，它被用于抗癌药物的筛选和药物分子与d n a 作用方式研究的灵敏探针【4 2 l 。含 吲哚和咪唑环类荧光探针，常用的这类染料有苯酚基双( 苯并噻唑) 和苯乙氧基 双( 苯并咪唑) 、4 ，6 二脒基一2 一苯基吲哚和4 ，6 ( 三眯唑啉2 ) 一2 苯基吲哚等，其 中双苯并咪唑染料水溶性好，相对无毒性，作为荧光探针，可通过小沟槽键合到 d n a 染色，发射蓝色荧光。碳菁染料是目前d n a 分子荧光探针和染色研究中较新 的一类，具有以下特点：在可见区高的摩尔吸收系数、很低的自身荧光、不与d n a 结合时，量子产率小于o 0 1 、具有一定的水溶性。 1 3 常用研究方法及其特点 1 3 1 紫外一可见吸收光谱 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 紫外可见吸收光谱法( u v - v i s ) 是研究小分子与d n a 相互作用机理的最常用、 方便的方法。由于d n a 分子中含有嘌呤碱基等具有光活性物质，d n a 分子中的碱 基在2 6 0 n m 附近有最大紫外吸收，许多小分子与它结合后，对d n a 或小分子的 吸收光谱会引起变化，这就有利于我们应用紫外可见吸收光谱法来研究小分子与 d n a 的相互作用机理 4 3 l 。许多与d n a 作用的药物也存在紫外可见吸收，药物与 d n a 相互作用后，会引起吸收谱带变宽、红移( 或蓝移) 效应和减色( 或增色) 效应， 尤其是以嵌插方式结合的分子，变化会更大，同时粘度增大，熔点升高，可通过光 谱测量，得到表观稳定常数、结合位点数。在光照作用下，有些分子会切断d n a 的 键，实验可用紫外光谱法进行监测。而我们可根据这些变化现象如吸收光谱的谱带 变宽，红移或蓝移效应和减色或增色效应来判断小分子与d n a 的作用方式。 1 3 2 荧光光谱 我们也可以用荧光光谱研究配合物与d n a 的相互作用。配合物与d n a 插入结 合时，通常引起荧光光度增强，并且增强的幅度与配合物和d n a 的结合程度有关。 同时，配合物的激发态寿命也大大增强。同时其受阴离子猝灭剂的影响也较小。有 些药物分子与d n a 结合后，会使原本荧光很弱的分子荧光强度增大很多。有些药 物与d n a 结合后，会发生荧光淬灭作用。利用这些现象，可用荧光光谱法进行分 析，获得热力学和动力学数据。用e b 作荧光探针，可研究b e n d r i m e r s 的特异性结 合位点【4 4 1 。文献1 4 5 4 6 】利用计算机辅助计算程序进行非线形非共价结合的s c a t c h a r d 方程数据处理并作为判定结合方式的研究。 1 3 3 拉曼光谱 共振拉曼光谱：共振拉曼光谱所需样品浓度低，反映结构信息多，可以通过共 振激发d n a 发色团来研究药物分子与d n a 作用的精确位置。同时共振拉曼光谱的 缺色性可作为区分嵌插和沟内结合的依据。测量配合物与d n a 键合前后的激发态 共振r 锄a n 光谱并结合闪光光解技术，比较相应于不同配体的r 锄a i l 峰的强度相 对变化，可为确定混合配体配合物中哪种配体采取嵌插结合提供一定的证据【5 2 捌】。 表面增强拉曼光谱( s e r s ) ：在银胶载体上，对d n a 与r u ( b p y ) 2 d p p z 相互作用的s e r s 研究表明，配合物同d n a 结合后，并没有出现新的谱峰，只 是大多数特征峰向左或向右移动了2 5 个波数，这说明他们之间并没有形成强的 化学键。d n a 与配合物结合后，振动峰的信噪比变化不大，但是拉曼散射光子数 却由1 0 0 0 0 下降到4 5 0 0 左右，这可能是由于配合物与d n a 发生了嵌入作用， 配合物中的d p p z 配体嵌入d n a 双螺旋结构中，导致配合物与银胶溶液表明部分 脱离，使得银胶溶液的增强效果受到影响【5 “。 1 3 4 质谱法 质谱法( m s ) 在药物分子d n a 加和物的结构分析中发挥独特的作用【5 6 ，5 ”，m s 和m s m s 能灵敏、快速地获得药物分子与d n a 结合位点数，结合区域以及非共 价结合方式，随着软电离技术的发展，l c _ m s 在d n a 及其加和物的分析中应用 越来越多。w a i l g 等【5 9 l 快速检测非共价结合药物与寡核苷酸及它们的相对亲和力， 发现药物d i s t a m y c i n 、h o e c h s t 3 3 2 5 8 、h o e c h s t 3 3 3 4 2 、b e r c n i l 和a c t i n o m v c i nd 1 、 d 2 、d 3 、d 4 、d 5 是典型的小沟结合剂或嵌插剂，小沟结合部位在a t 富集区， a c t i n o m y c i nd 嵌插在g 、c 富集区，而h 2 t m p y p 4 和c u t m p y p 4 则是混合键 和，小沟和嵌插结合均存在。 1 3 5x 一射线衍射技术 x 一射线晶体衍射是研究物质结构最直接的工具之一，被广泛的应用于研究其他 一些类型配合物与d n a 的相互作用，并获得结构方面的详细信息f 印】。x 射线晶体 衍射能提供直接结构信息，但需要提供药物分子与d n a 加和物的晶体。该技术已 广泛用于研究配合物与d n a 的相互作用，并建立了一些令人信服的结合模型 6 l ，矧。 但迄今为止，据我们所知，这一技术还没有用于多吡啶钌等的配合物，因为还没有 获得这类配合物与核苷酸结合的晶体。 1 3 6 核磁共振谱 核磁共振m m r l 谱能够直接提供配合物的d n a 键合的详细信息，用于更深层 次上探测小分子化合物与d n a 的键合机理及作用位点( 如d n a 的大沟、小沟、或 碱基位置的特异性结合等) 。这一技术所提供的信息是上述光谱法等手段所无法获 得的，也是近年来在更深层次上探测小分子化合物与d n a 键合机理所采用的一种 技术【6 3 彤】。在d n a 分子中，不同的糖和糖基构象以特有的排布放置它们的质子， 这在它们相应的c 0 s y 和n o e s y 谱中显示出来。由此可见，二维c o s y 和 n o e s y 技术对确定溶液中的大分子结构是必不可少的工具。相对于x 射线衍射 方法，n m r 波谱学的优点是不需要晶体，能提供液态生理条件下的样品较为详细 的结构信息，可应用于许多生物体系，而且它具有显示体系动力学行为的潜力。但 是n m r 是低灵敏度实验，所需样品浓度高，这是它的局限性。 1 3 7 电化学法 电化学方法作为研究电子转移方面的有力手段，可对光谱测量结果进行有效地 补充，从而更深入的地反映小分子化合物与d n a 相互作用地机理。虽然电化学方 法在一定程度上受分子电活性与否的限制，但对于一些吸收光谱比较弱，或由于其 电子跃迁谱带与d n a 的发生重叠，而无法用诸如紫外可见等方法来研究的分子， 却有可能用直接或间接伏安法方便地进行研究【“，6 7 l ，尤其是对于一些主要通过静电 结合模式与d n a 作用的分子，采用表面电化学方法可获得许多其它方法无法得到 的信息。现在电化学方法已经成为研究小分子物质与d n a 作用的一种重要的方法。 现在常用的电化学方法有以下几种：( 1 ) 循环伏安法( c y c l i cv o l t a m m e t 强c v ) 和线性 扫描伏安法( l i n e a rs w e e pv o l t 锄m e t r y ，l s v ) 【”，6 9 】；( 2 ) 方波伏安法( s q u a r ew a v e v o l t 锄m e t r y ) o7 0 】；( 3 ) 微分脉冲伏安法( d i f f c r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y d p v ) 【7 l 】，该法较 c v 具有更高的灵敏度；( 4 ) 电位溶出分析法( p s a ) 【7 2 j ，该方法能够获得很高的灵敏 度和有效的背景补偿，提高了序列检测能力；( 5 ) 电致化学发光法( e l e c t m c h e m i l u m i n e s c e n c e ，e ( 曲，e c l 优点较多，可以表征相互作用的模式，应用广泛。 1 4 壳聚糖的电化学研究 1 4 1 壳聚糖的结构和组成 1 0 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 壳聚糖( c h i t o s a i l ，c r s ) ，又称甲壳胺，脱乙酰几丁质、聚氨基葡萄糖、可溶性 甲壳素，外观为白色或灰白色，略有珍珠光泽，呈半透明的片状固体，是一种储量 极为丰富的天然碱性高分子多糖，多为虾、蟹甲壳提取物，是由甲壳素( c h i t i n ) 部分 脱乙酰化衍生物【7 4 ，7 5 1 ，化学名称为b ( 1 4 ) 2 氨基2 脱氧d 葡萄糖，其基本组成单 位为d 葡胺糖。壳聚糖结构式如下图所示： 磷擞 图4 壳聚糖的结构式 由结构式可知，壳聚糖分子呈直线状，极性强，易结晶，壳聚糖分子中既有亲 水性和疏水性基团，又有一n h 2 、一o h 等对金属离子有较强配位能力的基团，它 们会形成分子间和分子内氢键，而骨架链问的氢键形成了壳聚糖大分子的二级结 构。壳聚糖因原料不同和制备方法不同，相对分子质量从数十万到数百万不等。壳 聚糖是迄今发现的难一的碱性多糖，不溶于水、碱溶液，可溶于一些有机酸如醋酸、 乳酸、苯甲酸、甲酸等酸溶液中。在酸性溶液中，氨基可与质子相结合，从而使得 壳聚糖带正电荷。壳聚糖化学性质稳定，在密闭的干燥容器内储存三年也不变质； 但遇水会发生分解反应，在高温下也能分解，但速度缓慢。此外，由于具有缩醛结 构，壳聚糖在酸性环境中将发生降解，导致溶液粘度价降低，如果加入甲醇、乙醇、 丙醇等，可延缓其粘度降低，尤其以乙醇的作用明显。但由于壳聚糖分子结构中含 有大量的活性基团，因此可以发生酰化、酯化、醚化、氧化、烷基化、鳌合、接枝 共聚及交联等一系列化学反应，而壳聚糖对许多离子、有机物、生物分子等具有离 子交换、螯台、吸附等作用，因此其被广泛应用于化学领域f 7 6 ，删，而壳聚糖在医药、 农业和污水处理等领域的应用已初见成效1 7 8 j 。 1 4 2 壳聚糖的研究现状 由于壳聚糖结构上的特殊性，而具有离子交换、鳌合、吸附作用，加上本身是 种高分子化合物，不溶于水和大多数有机溶剂而只溶于少数有机弱酸之中，并有 一定的刚性、抗压性，又便于制各各种各样的衍生物【7 9 m 】，因此被用于环境中金属 离子的分析和形态分析【8 3 8 4 1 。并且壳聚糖及其衍生物的修饰电极也被用于电化学分 析陋8 6 1 。由于壳聚糖具有很好的吸附性和成膜性，它被广泛用来回收、分离金属及 非金属物质，用它做修饰剂制备的修饰电极具有较宽的电位窗口，在一些离子的测 定方面效果显著【8 7 埘】。 到目前为止，壳聚糖含量测定仍然主要采取酸水解间接比色法【蚓进行样品分 析，此方法操作烦琐不适合复杂样品微量壳聚糖含量的分析检测。近年来，高贵珍， 焦庆才等人对有机染料与壳聚糖的相互作用进行了研究，建立了壳聚糖定量测定的 分光光度法和荧光分析法【9 “。而电化学方法研究壳聚糖含量测定的报道尚未见 到。本论文第四章就是对壳聚糖的电化学行为进行研究，建立了壳聚糖直接定量测 定的电化学方法。 1 5 本论文研究的主要思想和内容 本文利用电化学，紫外一可见光谱和荧光光谱法研究了几种小分子化合物与 d n a 的相互作用机理，并将其应用于d n a 的分析应用中。并对壳聚糖的电化学行 为进行了研究。论文主要包括了以下几个方面： ( 1 ) 利用电化学，紫外可见光谱法研究了c t 乙蝴b c u ( i i ) 络