基于图像分析的DNA定量分析研究.doc

基于图像分析的DNA定量分析研究【关键词】 DNA摘要：目的运用ICM（Image Cytometer）对图像进行处理和分析，在给出细胞形态学参数的同时对DNA的含量进行定量分析，能有效地协助医生对诸如肿瘤等多种病症做出诊断。方法以武汉大学光谱与成像仪器工程技术研究中心研制的“全自动DNA细胞图像定量分析仪”（DNAICM）为平台，对鸡血红细胞和宫颈脱落细胞进行液基薄层制片，用Feulgen染色法染色，对DNAICM上获取的细胞染色图像进行扣背底算法处理。结果 用冷酸解法对两种细胞进行Feulgen染色后细胞着色较深且均匀；进行扣背底算法处理后的细胞图像的灰度值方差为0.524，比不进行处理时（0.919）要小。 结论冷酸解法更适用于鸡血红细胞和宫颈脱落细胞的Feulgen染色；扣背底算法可以有效地减少视场不匀带来的误差。 关键词：DNAICM； DNA定量分析； 扣背底； 积分光密度； DI直方图； Feulgen染色Research of DNA Quantitative Cytology Based on Image ProcessingAbstract：ObjectiveImage processing and analyzing by use of ICM（Image Cytometer）can be conductive to doctors in tumor diagnoses. MethodsMonolayer of chicken red blood cells and cast-off cervical cells were deposited onto microscopic slides by liquid based sampling preparation. The slides were stained by Feulgen coloration for determination of amount of DNA using an automated DNA imaging cytometer (made by Engineering Research Center of Spectrum & Imaging Instrument, Wuhan University) and cell images obtained were processed by the method of distracting background in image processing.ResultsThe color of two types of cells after cold acidolysis used in Feulgen coloration was deeper and more symmetrical than that after hot acidolysis. The gray scale variance of cell images after disposure of distracting background was smaller than that of no such disposure. ConclusionCold acidolysis was more suitable in Feulgen coloration of chicken red blood cells and castoff cervical cells. Method of distracting background could effectively diminish the asymmetry of the background of cell images.Key words：DNAICM ; DNA quantitative cytology ; Distracting background; Integral optical density; DI table; Feulgen coloration 20世纪90年代初至今，计算机成本的下降以及性能的大幅度改进、CCD技术和图像处理技术的发展，使得ICM技术在癌症早期诊断的细胞DNA定量分析技术中异军突起。其原理是医学病理上常用的细胞切片、印片或涂片，经固定液固定后用Feulgen染色，利用精密透射光学显微镜、窄带干涉滤光片、高精度图像采集系统将细胞DNA的数字化灰度图像摄入计算机，通过图像处理技术对该细胞DNA图像灰度形态进行定量分析，计算出每个细胞的积分光密度（IOD）值，再根据BeerLambert光吸收定律将单个细胞的IOD值与标准定标细胞相比后，换算成细胞DNA的绝对质量并给出被测细胞的倍体分布及细胞周期（即G0/G1期，S期，G2/M期）等参数。医师借助这些参数即可作出诊断。此方法简便、实用而且准确度高，对人体及其它动物肿瘤或癌症的早期病理分析和诊断研究具有重大参考意义。ICM(Image Cytometer)不仅能对极少量的细胞核作DNA含量和倍体分析，而且可同时测量细胞核的形态参数（面积、形态因子、纹理特征等）并通过图像处理技术加以辅助分析。因此ICM及其仪器在国际上逐步在病理诊断学、细胞生物学、组织胚胎学、遗传免疫学等领域得到了越来越广泛的应用，已经成为DNA定量测量，尤其是肿瘤的细胞学诊断的一项快速、客观、有效的重要手段1，2 。近几年来，用DNA倍体分析系统进行宫颈癌及癌前病变的诊断在国外已有大量报道310 。此外，细胞DNA定量分析诊断方法在北美及欧洲已作为一种常规临床检测方法之一 1113。1 材料与方法1.1 材料宫颈脱落细胞样本取自湖北省武汉市肿瘤医院、湖北省黄石市第一医院和山东淄博计划生育研究所，保存于50%的乙醇溶液（细胞保存液）中。鸡血红细胞取自健康公鸡的动脉血，加入0.3%0.4%的柠檬酸钠抗凝剂，保存于50%的乙醇溶液（细胞保存液）中。1.2 方法采用液基薄层制片技术，对制作的玻片进行Feulgen染色，再利用全自动DNA细胞图像定量分析仪完成对细胞图像的采集、处理和DNA定量分析。1.2.1 液基薄层制片 在细胞保存液中加入0.1%DTT消化液放在振荡器上振荡2 h,然后将消化后的细胞悬液离心5 min(800 r/min)，弃上清液后加入50%乙醇分别清洗、离心2次(800 r/min5 min/次)。然后将用保存液稀释的细胞混悬液放入细胞涂片离心机甩片5 min,制成薄层细胞学玻片14 。1.2.2 Feulgen染色 固定液：10%缓冲福尔马林液（pH 7 .4）；酸解液：盐酸，浓度5mol/L；酸解温度：25(与武汉四五月份室内温度基本接近)；酸解时间： 45 min；测量滤色镜波长：560 nm。染色过程： 涂片空气干燥1 h，固定液固定1 h；蒸馏水漂洗10 min；5 mol/L HCl，25酸解45 min，(温控水浴)；蒸馏水漂洗5 min；与Schiff染液反应45 min (25)；蒸馏水漂洗5 min；自来水冲洗15 min (稳水)，常规乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封固15，16 。1.2.3 DNA定量分析 全自动DNA细胞图像定量分析仪的系统构成及分析流程 ：武汉大学光谱与成像仪器工程技术研究中心自主开发的全自动DNA细胞图像定量分析仪硬件系统由Olympus BX41显微镜、恒流源、自动上下片系统、精确位移三维平台(包括载物台、步进电机、三轴原点定位传感器、条码扫描器等)、CCD摄像机、操纵杆、控制器和、计算机等组成（见图1）。软件系统自动聚焦、扫描、图像采集程序(卢国强. ICM分析自动化及应用研究.武汉大学硕士学位论文)，细胞图像数据库、细胞特征库、知识模型库和智能分析处理程序(张燕. 遗传算法和支持向量机在DNA细胞图像分析仪中的应用.武汉大学硕士学位论文)，六大功能模块构成。分析流程如图2所示。图1 全自动DNA细胞图像定量分析仪硬件构成 （略）图2 DNA定量分析的流程（略）扣背底算法 ：为了克服光学传递中的不均匀性，我们采集了一幅空视野作为亮场背底图像，然后在后面采集的细胞图像中除去这个背底图像，用这种方法可以有效地减少视场不匀带来的误差。全局扣背底为测量细胞图像分析仪的光均匀度，在玻片上寻找一个空白位置（染色后的背底，一般还会有少量的杂质）采集一幅背底图像，背底图像的灰度分布不均匀（见图3），其灰度直方图也不是规则的单峰，这是与显微镜的光路系统直接相关的，如果不采用软件系统进行校正，会带来极大的测量误差。均匀度指背景光强的灰度标准差和变异系数（coefficient of variation）。它们描述了背景光的均匀性，要求背景图像的像素点灰度变异系数小于3%。其公式如下：sd=1 MNM i=1N j=1fij(x,y)- f(x,y)21/2 （1）CV=sd f(x,y) 其中sd为图像各个像素灰度的标准差，fij(，y) 为某一个像素点的灰度值（0255）， f(x,y)为图像所有像素灰度的平均值， M，N分别是图像的长和宽。 cv为图像各个像素灰度的变异系数。图3 采集的背底图像 （略） 图4 背底图像分割效果图 （略） 图5 变异系数（略）由图4可见，由于背底图像的灰度分布不均匀，二值化后的图像存在不规则边缘（图中蓝色表示背景中灰度值较小的区域）。图5中，其直方图的第1个峰为某处视场进行扣背底后计算的像素点灰度值变异系数（1.08%），第2个峰为未扣背底计算的变异系数（3.82%），第3个峰为标准规定的变异系数最大值（3%）。扣除局部背底的方法与全局扣背底类似。一般是将细胞的外接矩形扩展2个像素，然后在此范围内计算除了细胞的有效像素之外的所有背景像素的灰度平均值，并以此平均值作为平均背底在细胞的每个有效像素中扣除。扣除算法可以用相除或相减（本DNAICM程序中用相除）。由于鸡血红细胞比宫颈脱落细胞小得多，且有的细胞连接较紧密，采用将细胞的外接矩形扩展2个像素的方法会使外扩区域中包含其他鸡血红细胞的有效像素，从而在计算积分光密度时产生误差，所以采用外扩1个像素的方法。2 结果2.1 冷酸法Feulgen染色后的效果 20倍镜下经45 min酸解的鸡血红细胞在全自动DNA细胞图像定量分析仪中采集的图像如图68所示。由图可见，细胞边缘清晰，着色均匀，效果优于热酸法。图6 原始细胞图像（略） 图7 背底图像（cv=1.62%）（略） 图8 全局扣背底后的图像（略）2.2 20倍镜下鸡血红细胞积分光密度直方图的比较 20倍镜下经45 min酸解的鸡血红细胞（十个视场，共1500个细胞）分别按照下面四种不同的方法进行实验，并比较实验结果（见图9）。结果见表1。由表1可以得出：IOD离散程度全局扣背底加局部扣背底时最小。理想的玻片背底是均匀的，但实际上由于经Feulgen染色后玻片上残留染色物质的分布不均和照明光源的不均匀性，使得玻片背底实际的灰度分布不均匀。如果不扣除这种不均匀性，在玻片不同位置或者是视场的不同位置测得的相同细胞核的灰度值不同，计算出的IOD值也会受影响。而全局扣背底大体上去除了背景的不均匀性造成的影响。再进行一次局部扣被底，把背景不均匀性的影响再次减小，所以此时得到的IOD的主峰紧密程度最好，离散程度最小；IOD方差各不相同，其中全局扣背底比不全局扣背底所得的方差要小。这也是由于全局扣背底大体上去除了背景的不均匀性造成的影响。表1 4种扣背底方法的比较（略）图9 （略）（1）全局扣背底、局部扣背底后的细胞IOD直方图；（2）全局不扣背底、局部扣背底后细胞IOD直方图；（3）全局扣背底、局部扣背底后的细胞IOD直方图；（4）全局不扣底、局部不扣背底后的细胞IOD直方图。坐标系中横坐标表示IOD值，纵坐标表示细胞个数2.3 宫颈脱落细胞DI（DNA Index,DNA指数）直方图、散点图 20倍镜下的正常人体宫颈细胞和发生癌变的人体宫颈细胞（全局扣背底、局部扣背底）DI直方图、散点图的比较（见图10）。图10 （略） （1）、（2）正常人体宫颈细胞直方图和散点图；（3）、（4）发生癌变的人体宫颈细胞直方图和散点图直方图中横坐标表示DI值，纵坐标表示细胞个数；散点图中横坐标表示DI值，纵坐标表示细胞核面积由于宫颈脱落细胞比鸡血红细胞大得多且DNA含量较稳定，所以正常人体细胞IOD直方图中IOD值的离散程度更小（约90%的细胞在主峰的正负10%范围内），DI值的主峰更细，系统测量的结果更精确。由于发生癌变的细胞中DNA含量增加，DI值大于2的细胞个数明显增多，医生可以根据DI值来判断细胞的癌变程度