（分析化学专业论文）在线富集技术在防腐剂检测中的应用及双峰现象研究.pdf

摘要 摘要 毛细管电泳作为一种经典电泳技术与微柱分离有机结合的新兴的分离技术，自从问 世以来，就以它的高效快速等优点得到广大分析工作者的青睐。但是，长期以来，检测 灵敏度不够高成为阻碍该项技术进一步扩展其应用范围的主要问题，在线富集技术在一 定程度上解决了这个难题；另一个困扰该项技术发展的问题是双峰现象，它会给出错误 信息。全文共分四章，分别介绍了毛细管电泳和在线富集技术的发展概况、在线富集技 术的应用和双峰现象的研究。 第一章：介绍了毛细管电泳的基础理论和在线富集技术的发展状况及毛细管电泳中 的双峰现象。 第二章：采用在线富集s w e e p i n g 技术建立了胶束电动色谱法测定化妆品中防腐剂 水杨酸含量的方法，考察了缓冲溶液p h 值、s d s 浓度、进样时间和样品基体组成对富集 效果的影响。结果表明：在电泳缓冲溶液为1 5m m o l l 磷酸盐+ 3 0m m o l l 十二烷基 硫酸钠( p h = 7 o o ) ，紫外检测波长2 1 4 n m ，分离电压1 8k v 时，富集倍数可达7 0 0 倍以上。 本方法不需复杂的样品预处理，操作简单、快速，成本低，在快速分离与检测方面有很 好的应用前景。 第三章：建立了在线富集胶束电动色谱法测定饮料及酱油中的防腐剂苯甲酸的方 法。考察了样品预处理、背景缓冲溶液p h 值、s d s 浓度、进样时削对苯甲酸富集效果 的影响。在最佳分析条件下，苯甲酸的检测灵敏度可提高1 5 0 倍。本方法减少了样品处 理的繁琐过程，操作简单，成本低，大大缩短了分析周期，弥补了毛细管电泳测定微量 组分的不足。 第四章：研究了苯甲酸、对氨基苯甲酸、水杨酸在十二烷基硫酸钠为准固定相的胶 束电动毛细管色谱中的双峰现象。实验中分别考查了背景缓冲液p h 、缓冲剂浓度、s d s 浓度、进样时间、电泳操作电压等因素对苯甲酸、对氨基苯甲酸、水杨酸三种样品的双 峰的影响。结果表明，在缓冲液p h 为1 0 4 0 、缓冲剂浓度为5 0m m o l l 时三种样品出现 明显的双峰：随着进样时间，s d s 浓度、电压的变化，三种样品的双峰峰面积变化呈现 出一定的规律性。在实验中为了得到e 确的谱图信息，应尽量避免双峰的出现。 关键词：毛细管电泳；防腐剂；在线富集技术；双峰 a b s t r a c t a sac l a s s i c a l e l e c t r o p h o r e s i st e c h n i q u e t h a tw a sc o m b i n e dw i t hm i c r o - c o l u m n s e p a r a t i o n ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa t t r a c t e dm o s to ft h ea n a l y t i c a lr e s e a r c h e r sb e c a u s eo fi t s c e l e r i t y a n d h i g hp e r f o r m a n c e a f t e r a p p e a r i n g h o w e v e r , c e i sr e s t r a i n e d b y l o w c o n c e n t r a t i o ns e n s i t i v i t y , i naw a yo n l i n ec o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e si sss a t i s f a c t o r ym e t h o d t h a tc o u l dd i s c u s st h i sq u e s t i o n ；t h eo t h e rq u e s t i o ni st h ed o u b l ep e a kp h e n o m e n o n ，w h i c h m a y b eg i v es o m ew r o n gc h r o m a t o g r a p h yi n f o r m a t i o n i nt h i st h e s i s ，t h e r ea r ef o u rc h a p t e r s ， t h ed e v e l o p m e n to fc ea n do nl i n ec o n c e n t r a t i o n t h ea p p l i c a t i o no fo n - l i n ec o n c e n t r a t i o n t e c h n i q u e sa n dt h ed o u b l ep e a kp h e n o m e n o n c h a p t e ro n e ：i ti sa ni n t r o d u c t i o no ft h eb a s i ct h e o r yo fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n d o i l l i n ec o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u ea n dt h ed o u b l ep e a kp h e n o m e n o n c h a p t e rt w o ：d e t e r m i n i n gm e t h o do ft r a c es a l i c y l i ca c i di nc o s m e t i cw a se s t a b l i s h e db y am i c e l l ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i so n l i n es w e e p i n gc o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e t h ee f f e c to f p h i nb a c k g r o u n ds o l u t i o n ，t h ec o n c e n t r a t i o no fs d s ，i n j e c t i o nt i m e ，w a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t s h o w nt h a tt h es a m p l ew a sa n a l y z e dw i t h15 m m o l lp h o s p h a t e + 3 0 m m o l ls d s ( p h = 7 0 0 1 a st h er u n n i n gb u f f e ru vd e t e c t o r , w a v e l e n g t h2 1 4 r i m ；r u nv o l t a g e18 k v t h i sc o n d i t i o n a l l o w e du pt o7 0 0 一f o l dc o n c e n t r a t i o no ft h es a l i c y l i ca c i d t h er e s u l t ss h o w i n gt h a tt h e m e t h o di sp r e c i s e ，s i m p l ea n dc o s t - e f f e c t i v e c h a p t e rt h r e e ：an e wm i c e l l ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sm e t h o dw i t ho n l i n es w e e p i n g c o n c e n t r a t i o nf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r e s e r v a t i v e si nt h ef o o d s t h ee f f e c to fp hi n b a c k g r o u n ds o l u t i o n ，t h ec o n c e n t r a t i o no fs d s ，蜘e c t i o nt i m e ，w a si n v e s t i g a t e d u n d e rt h e o p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h es a m p l ed i r e c t l yi n j e c t e di n t ot h ec o l u m na f t e ri tw a ss i m p l ep r e t r e a t e d ， t h i sc o n d i t i o na l l o w e du pt oi5 0 - f o l dc o n c e n t r a t i o no f t h eb e n z o i ca c i d t h er e s u l t ss h o w st h a t t h em e t h o dc o u l db es u c c e s s f u l l yt od e t e m f i n a t et h et r a c ei nt h er e a ls a m p l e c h a p t e rf o u r ：t h ed o u b l ep e a kp h e n o m e n o n i nm i c e l l a re l e c t r o k i n e t i c c a p i l l a r y c h r o m a t o g r a p h yw a ss t u d i e dw i t hs o d i u md o d e c y l s u l f a t ea st h ep s e u d os t a t i o n a r yp h a s e t h e e f f e c to fp hv a l u e 、t h ec o n c e n t r a t i o no fh 3 8 0 3 、s d sc o n c e n t r a t i o n 、i n j e c t i o nt i m ea n d t 1 a b s t r a c t o p e r a t i o nv o l t a g eo nt h ed o u b l ep e a ko f b e n z o i ca c i d 、p - a m i n o b e n z o i ca c i da n ds a l i c y l i ca c i d w e r ei n v e s t i g a t e d n ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h ed o u b l ep e a kp h e n o m e n aa p p e a r e d o b v i o u s l yi nb u f f e rw i t hp ho f1 0 4 0 t h e r ew e r ec e r t a i nr u l e sb e t w e e nt h ec h a n g e so f t h e p h e n o m e n aa n dt h ef a c t o r st h a tw e r ei n j e c f i o nt i m e ，c o n c e n t r a t i o no fs d sa n dv o l t a g e i n o r d e rt og e tt h et r u ec h r o m a t o g r a p h yi n f o r m a t i o n ，w em u s ta v o i dt h ed o u b l ep e a kp h e n o m e n a k e yw o r d s ：h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；o n l i n ec o n c e n t r a t i o n ； p r e s e r v a t i v e s ；t h ed o u b l ep e a kp h e n o m e n o n 1 1 1 河北大学研究生学位论文存档材料 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河 北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 专业： 导师签 岁 。 签名： 0 阻 2 丛：5 ：上 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的 全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 专业： 导师签 獬：j 阻 w 吐，j 河北大学学位办公室制 川年箩月j 日 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 毛细管电泳的发展历程 毛细管电泳( c e ) 是以毛细管为分离通道，以高压电场为驱动力，依组分间淌度、 分子大小、等电点、分配行为等方面的差异而实现分离的一种液相分析分离技术，和传 统电泳相比，它的最大优点是克服了由两段电压引起的介质离予流的焦耳热，极大的改 善了分离效果。毛细管电泳的历史可以追溯到六十年代中期或者更早，1 9 6 7 年，h j e r t 6 n 首先提出可将高电场作用于细孔径管进行自由溶液区带电泳分离，他采用内径为3 m m 、 内壁涂有甲基纤维素的石英毛细管对金属离子进行了分离，显然，他所用的分离模式就 是毛细管区带电泳( c z e ) ，只不过管的内径比现在的毛细管要粗许多。他的工作可视 作毛细管电泳时代的开端。1 9 7 4 年，v i r t a n e n 2 1 进一步提出采用内径为2 0 0 - - - 5 0 0 m 的毛 细管进行分离，由于所用电场小于5 k v m ，所获得的效率并不高。p r e t o r i u s 等人口j 于同 年阐明了电渗流( e o f ) 可象泵一样驱动液体流过毛细管。1 9 7 9 年，m i k k e r s 等人f 4 】利 用2 0 0 9 m 内径的聚四氟乙烯毛细管对1 6 种有机酸进行分离，获得了小于1 0 9 i n 板高的 高柱效，但检测器不灵敏，由于样品负载量大导致峰形不对称。 1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a c s 等人 5 l 使用7 5 r m a 内径的毛细管分离了一组用丹磺酰 氯衍生的氨基酸，并采用荧光检测，首次获得了超过4 x1 0 5 塔板数的超高柱效，充分 展示了毛细管电泳的巨大潜力，他们还从理论上发现，毛细管电泳柱效与电场强度成正 比，与分子扩散系数成反比，他们的工作在分离科学界引起了轰动，成为毛细管电泳发 展史上的里程碑。1 9 8 4 年，t e r a b e 等人【6 1 将超过临界浓度的离子表面活性剂引入c e 缓 冲液，形成由离子胶束构成的准固定相，建立了c e 中可对中性组分进行分离的胶束电 动色谱模式( m e k c ，m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h y ) 。胶束电动色谱模式的提 出，使毛细管电泳的应用范围从带电离子扩展到中性物质，使毛细管电泳成为一种“全 能”的分析仪器。 2 0 世纪8 0 年代开始，毛细管电泳技术发展迅猛，c e 的几种主要分离模式先后建立， 1 9 8 3 年，h j e r t 6 n 7 1 将聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶分别引入毛细管建立了毛细管凝胶电 泳( c g e ) 模式：1 9 8 7 年，h j e r t 6 n 1 8 l 等建立了毛细管等速电泳( c i t p ) ：毛细管电色谱 1 同北大学理学硕士学位论文 ( c e c ) 起源于七十年代，但直到1 9 8 1 年j o r g e n s o n 和l u k a e s 的开创性工作才受到人 们的重视。随着毛细管电泳技术和理论的目益完善，毛细管电泳仪的制作工艺也日渐成 熟，1 9 8 8 年第一台毛细管电泳商品仪器正式投入市场，这在很大程度上加速了毛细管电 泳技术的发展，目前，毛细管电泳的方法发展是多方面的，新建立了阵列毛鲴管电泳 ( a c e ) 、亲和毛细管电泳( a c e ) 和芯片毛细管电泳( c c e ) 等模式，毛细管电泳和 其他分析仪器的联用技术也是目前的研究热点之一，c e 正处于全面稳定的发展时期 1 2 毛细管电泳的原理 1 2 1 毛细管电泳基本理论 毛细管电泳通常使用的是内径为2 5 一】0 0 p m 的弹性( 聚酰亚胺) 涂层熔融石英管， 石英管表面的硅羟基盟( s i 0 h ) 在碱性和弱酸性条件下，可解离为s i o 一，因此， 在大多数操作条件下，石英毛细管表面将带有负电荷。由于静电引力，s i o 一将把电解 质溶液巾的阳离子吸引到管壁附近，并在一定距离内形成阳离子相对过剩的扩散双电 层。在外电场的作用下，带正电荷的溶液表面即扩散层的阳离子向阴极移动。由于这些 阳离子实际上是溶剂化的( 水化的) ，它们将带着毛细管中的液体一起向阴极移动，这 就是毛细管电泳中的电渗现象。在电渗力驱动下毛细管中整个液体的流动叫毛细管电泳 中的电渗流( e o f ) 。它是c e 分离中重要的影响因素之一。衡量e o f 大小的指标为电 渗淌度。，其表达式为： u = 翌 e 0 n 式中8 和q 分别为溶液的介电常数和粘滞系数，。为管壁相对于无穷远处的电势。 电渗流是c e 中推动流体前进的驱动力，电渗速度在毛细管横截面上几乎处处相等，它 使整个流体像一个塞予一样以均匀的速度向前运动，这种流形克服了机械泵推动液流产 生的抛物面流形所造成的区带加宽，是c e 高效的重要原因。 带电粒子在直流电场的作用下会在介质中发生定向移动，这就是电泳。介质中的粒 子受到电场力和介质阻力的共同作用，在达到平衡时即做匀速运动。带电粒子在单位场 强作用下的运动速度称为它的淌度，用，表示。在无限稀释溶液中测得的( 球形) 粒 子淌度为绝对淌度，可由表示为：u 品 子淌度为绝对淌度，可由表示为：u u p 2 o u u = 一一 。9 3t 1 ( 1 2 ) 式中( o 为离子在无限稀释时的电动电势。在实际溶液中，离子的淌度般要小于 它的绝对淌度。在毛细管电泳中，样品分子的迁移是电泳淌度和电渗流淌度( “。f ) 的 综合表现，这时的淌度称为表观淌度( p a p p ) 。表观淌度可以直接从毛细管电泳的测量结 果求得，表示为： 上d 厶 “”2 i 万 ( 1 3 ) 这里l d 是毛细管从进样口到检测器的距离，t r 是离子通过这段距离所用的时间， k 是柱的总长，v 是电压。物质问淌度的差异是毛细管电泳分离的重要基础。 粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流( e o f ) 两种速度的矢量和。 正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出，中性粒子的电泳流速度为“零”，故其 迁移速度相当于电渗流速度，负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一 般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，分离后的出峰次序为：正离子 中 性分子 负离子，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。溶液的p h 影响着管壁定 域电荷的数量和离子的解离程度，故对电泳淌度和电渗淌度的大小有重要影响，控制溶 液p h 通常都是使用对p h 具有一定缓冲能力的缓冲溶液来实现的。此外，缓冲液中盐 类离子、添加剂的浓度和种类都有不周程度的影响，它们都是分离条件优化时要考虑的 因素。添加剂的种类和浓度可能会改变c e 的分离模式以及可分离的物质种类，例如， 缓冲液中表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度后分离模式即成为m e c c ；在缓冲液中加 入手性拆分剂，如b 环糊精，可对某些手性对映体进行分离；将缓冲液改为以有机溶剂 为主，则c e 成为非水毛细管电泳( n a c e ) 等等。 1 2 2 胶束电动色谱的基本理论 胶束电动色谱( m e k c ) 是以胶束为假固定相的一种电动色谱，表面活性剂分子在 达到临界胶束浓度后，其疏水链会依疏水相互作用结合在一起，形成胶束相。当毛细管 中的缓冲液含有胶束时，在外加电场的作用下，胶束会在电泳和电渗的共同作用下以较 3 河北大学理学硕士学位论文 慢的速度向检测端运动。混合物中的组分则会在液相和胶束相之间发生分配，同时在电 泳和电渗的作用下向检测端运动，物质不仅可以由于淌度差异而分离，同时又可基于在 水相和胶束相之间的分配系数不同而得以分离。由于存在着分配和电泳两种作用，中性 组分和带电组分都可得到分离。自从m e k c 这种新型的毛细管电泳模式问世后，很快 得到了迅速的推广，大大拓宽了毛细管电泳方法的应用范围。 在m e k c 中的迁移时间t r 可表达为【7 4 】： f 。：# ( 1 4 ) 月2 酉鼯 u 创 k - ：足坚： 一cmc)kv(c(15)mc m c ) = 足产2 c 一 ( 1 5 ) 世= 蔓( 1 6 ) 巳 式中k 为容量因子，t o 为水相的迁移时间，k 。为胶束相的迁移时间。k 为溶质在胶 束相和水相的分配系数，v m c 和v a q 分别为胶束相和水相的体积，c m c 为溶质在胶束 相中的浓度，c a q 为溶质在水相中的浓度。 由于毛细管电泳在功能和结果显示上与一般色谱技术颇为相似，因此毛细管电泳的 分离效率一般也用塔板高度或塔板数来表示，理论塔板数肌溶质的迁移时间( 靠) 和 相邻峰分离度( 如) 可分别由下列公式求出： r 、_ 竺盟旦三埤 ( 1 7 ) h 2 f i 百万百币i 耵 u n = 5 5 4 ( w t 。) 2( 1 8 ) 盯：生( 1 9 ) k i 式中n 为理论塔板数，a 为分离因子，k 一，k ：分别为溶质l 和2 的容量因子。增加表 面活性剂的浓度，k 呈线性递增。f 加。为迁移时间窗口的宽度，是一个重要的参数。 较小的，矽。使迁移窗口变宽，因而有较高的分离度。改变缓冲液浓度可提高如。或减少 t o 。a 是分离度中最重要的一项，通过改变胶束的种类或修饰水相，可以改变溶质分子 在胶束准固定向和水溶液相之间分配因子，控制a 值。因此为取得良好分离度，可通过 选择胶束的种类和浓度，改变缓冲液的种类、组分、p h 值、离子强度和添加有机改性 第1 苹绪论 e ! = ! e | 目! ! e e e e e ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 自! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 目e ! ! ! ! ! 目| ! s - i i | 目| ! ! ! ! 自! ! 自! ! ! ! ! ! ! ! ! 暑 剂等来进行优化，提高选择性和分离度。 1 3 毛细管电泳的特点及应用 1 3 1 毛细管电泳的主要特点 毛细管电泳和高效液相色谱一样，同是液相分析分离技术，它们可以互为补充，但 无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势，与h p l c 相比，毛细管电泳柱效更高，可达到1 0 5 1 0 6 理论塔板数米，故也称为高效毛细管电泳， 分离速度更快，几十秒至几十分钟完成，同时，它的运行几乎不消耗溶剂，而样品用量 仅为h p l c 的几百分之一，仅为纳升级；毛细管电泳没有高压泵输液系统，因此仪器成 本更低，可以通过改变操作模式和缓冲液成分，毛细管电泳有很大的选择性，可以根据 不同的分子性质对极广泛的分离对象进行有效的分离，而f i p l c 要消耗许多价格昂贵的 色谱柱和流动相。因此，可以把毛细管电泳的特点可以概括为“高效、低耗、快速、广 泛”几个词。 1 3 2 毛细管电泳的应用 由于毛细管电泳的分离模式多样化，毛细管内壁的修饰方法及运动的缓冲液中的添 加剂的不同，以及检测技术的发展，使毛细管电泳的应用非常广泛：将各种高效液相色 谱的柱制备技术移植到毛细管电泳中，就产生了毛细管电色谱9 。1 1 1 ，它可用来分离、检 测土壤及水中的多环芳烃；分离多种阴离子和阳离子；获得不同价态或形态的无机离子 的信息。毛细管电泳的另一个重要应用是在药物及临床方面( 1 2 _ ” ，已成为研究中的不可 缺少的手段，它可用于几百种药物中的主要成分、所含杂质的定性和定量分析，在临床 渗断中，可用于检测药物及其在体内的代谢过程的研究。在生命科学中，毛细管电泳技 术更显示出它的优越性，因而应用更广【1 6 _ 1 9 ，它可用来测定d n a 的各种形式及d n a 序列。用毛细管胶束电动色谱可以分离碱基，核苷酸等。毛细管电泳在生物大分子蛋白 质和肽的研究中应用十分广泛，它可用来检测纯度，如可以检测多肽链上的单个氨基酸 的差异；若与质谱连用，可以推断蛋白质的结构。采用最新技术，甚至可以检测单细胞、 单分子，如监测钠离子和钾离子在胚胎组织膜内外的传送，单细胞的检测为在分子水平 上研究细胞的行为提供了极为重要的工具，而单分子的检测为在单分子水平上开展动力 学研究艮示了广阔的前景，由于目前有多种手性选择剂可以选择使用，因此具有高分离 能力的毛细管电泳在手性分离【2 0 中极为重要，将合适的手性选择剂加入缓冲液中，其分 e 河北大学理学硕士学位论文 离效率优于高效液相色谱法 1 4 毛细管电泳的局限性及提高检测灵敏度的主要方法 毛细管电泳采用毛细管作为分离通道而获得高柱效，然而，由于毛细管的管径极小， 一般内径为2 5 1 0 0 n ，采用的又是柱上检测方案，当使用最常用的紫外检测手段时， 吸收光程很短，而且毛细管电泳的进样量很少，故浓度响应灵敏性较低，浓度检出限较 高是其主要缺点之一，使得该技术在应用于痕量分析时受到一定限制。因此，对毛细管 电泳的检测技术相应的提出了较高的要求，如何增加检测的灵敏度，同时又不造成明显 的区带展宽，一直是c e 技术发展中的一个至关重要的问题。近年来发展起来的方法有： 发展高灵敏度的检测器，设计特殊类型的检测池，利用扩展室增加检测光程，引入离线 富集技术和在线富集披术等。 1 4 1 发展高灵敏度的检测器，增大检测光程和离线富集技术 发展高灵敏度的检测器是提高检测灵敏度的有效方法。激光诱导荧光检测器1 2 1 , 2 2 ( 1 a s e r - i n d u c e d f l u o r e s c e n c e ，l i f ) 是目前检测灵敏度最高的检测器。它的检测能力至少 比紫外检测器高三个数量级 2 3 】，可达1 0 。2 1 0 。6 m o l l ，特殊的激光诱导荧光检测器可达 到单分子水平检测。近年来，根据不同的检测目的和样品的不同特性发展了纤维光学检 测器f 2 4 、热导光电检测器和三种电化学检测器f 2 5 0 6 ：电导检测、电位检测和安培检测， 后者最为常用，为微体积环境中的电活性物质的检测提供了高灵敏度的测定方法，检测 限可达ug l 的数量级。对于没有发色团的物质，人们引入了间接检测，衍生化检测以 及间接荧光检测口7 珈1 的检测器。但所有这些检测器价格昂贵，使用受到限制，紫外检测器 仍是目前应用最为广泛的检测手段。 扩展检测光程可使毛细管电泳的检测限降低2 1 0 倍口1 ，3 2 1 。人1 f 1 f l 成气泡状、袖状、 以及z 型的检测池来改变毛细管窗口的形状，但是这种方法最大的缺点是制作过程复 杂，成批量生产受到限制，并且毛细管内径的改变或连接易使样品谱带展宽，重现性不 好，检测灵敏度的提高倍数不是太大，不容易获得推广。 与其它分析方法一样，毛细管电泳可以利用离线富集技术提高灵敏度。离线富集技 术又称预富集技术，样品在进样前进行浓缩，使浓度较低的样品可以在紫外光学检测器 检测到，同时可以消除实际样品中的基体干扰。常用的方法有，传统的液液萃取、固 相萃取( s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 3 3 】、膜富集【3 4 、超临界流体萃取、微反应浓缩、 6 第1 章绪论 经典柱色谱、化学沉淀等方法或将上述方法连用以提高检测灵敏度。然而这些操作较为 繁琐，加大了分析时间，在预富集过程中可能导致样品丢失或引入杂质、富集倍数不是 很高，限制了它在毛细管电泳中的应用。 1 4 2 在线富集技术 近年来，在线富集技术成为提高检测灵敏度方面的研究热点，在线富集技术与其他 富集技术相比，具有较高的检测灵敏性、实用性和可操作性而具有广阔的应用前景，越 来越受到人们的重视。在线富集技术主要包括等速电泳( i s o t a c h o p h o r e s i s ，i t p ) ，s t a c k i n g 富集技术和s w e e p i n g 富集技术等。 1 4 2 1 等速电泳聚焦浓缩 等速电泳( i t p ) ，也称“移动边界”电泳技术，是电流通过不连续电解质系统而引 起的电泳。5 3 6 1 。样品区带介于前导电解质( t e ，l e a d i n ge l e c t r o l y t e ) 和终末电解质( t e ， t e r m i n a t i n ge l e c t r o l y t e ) 之间，毛细管两端加上电压后，电位梯度的扩散使所有离子最终 以同一速度运动，即为等速电泳。样品离子按其淌度和电离度的大小，得到相互联结而 不重叠的梯形带，在同时施加与电渗流反方向的流体动力压力，压缩样品区带进行富集。 根据k o h l r a u s c h 公式，i t p 浓缩效应可表达为： 吒= c l t 。0 。+ 。) k 0 。+ 。) 】= 吒k ， ( 1 1 0 ) c a 为样品浓度，c l 为前导离子浓度，k 为比例因子，通常为o 2 0 9 ，表示i t p 富 集能力。样品经过i t p ，浓度可达前导离子浓度量级，可显著改进浓度检出限 37 1 。由于 c i t p 起区带层叠收缩作用，其分离度并不理想，配以c z e ，将发挥各自的特长。i t p c z e 有两种模式，一种是i t p 过程在内径较大的毛细管中完成，再输入小内径的毛细管进行 c z e 分离 3 8 , 3 9 。这种偶合系统可增加样品注入量，但需要增加设备，增加了控制难度。 第二种是c i t p c z e 在同一根毛细管中进行富集和分离，这种方法比较简单，便于自动 化。 等速电泳作为c z e 的一种浓缩技术，它是采用特殊的装置将浓缩的样品充入到毛 细管中，限制了其广泛的应用：另外等电聚焦只能用于带电离子的分析，对于中性物质 等电聚焦无能为力。 1 4 2 2 在线s t a c k i n g 富集技术 s t a c k i n g 富集技术最初用于c z e 方式中带电离子的富集检测f 4 0 】，在m e k c 方式中 7 河北大学理学硕士学位论文 它的应用范围得到了进一步扩展 5 0 j 。s t a c k i n g 富集技术实际上就是一种电堆积过程， 根据电堆积原理，要求样品溶液有比背景缓冲液更高的电阻，当毛细管两端加上高电压 以后，样品带将获得更高的电场强度，样品离子在样品带中的迂移速度将会比在背景缓 冲液带中的迁移速度快，当样品离子迁移到样品带与背景缓冲液带的界面时，会由于背 景缓冲液带的低电场强度的作用而突然放慢迁移速度，样品离子在样品带和背景缓冲液 带交界处发生堆积而得到富集。s t a c k i n g 富集技术要求样品带的电阻大于背景带的电阻， 为了加强高场区，有些研究者在样品塞之前注入一个水塞，使被测离子堆积子水和缓冲 液的界面处。从理论上来说，样品带和背景带的电导率比值越大，富集效果就越好，实 际分析工作中还要考虑电渗等因素的变化对富集效果的影响。这种方法能提供1 0 倍到 1 0 0 0 倍的样品富集 5 1 - 5 3 1 。 场放大进样( f a i ) f 5 4 1 最早由m i k k e r 提出，f a i 作为样品柱上浓缩技术，有人 5 5 1 称此 为柱头富集。其基本原理与在线s t a c k i n g 技术相同，不过它是在电动进样过程中实现的。 它是采用电迁移进样将溶解于稀释后的载体电解质溶液中的样品加入到充有高浓度缓 冲液的毛细管中。在电迁移进样时，进样口端的电场强度大大高于毛细管内部的电场强 度，这就是场放大进样【5 6 1 。进样口端样品离子在高电场强度下迁移速度大大加快，样品 负离子的迁移方向与电渗流的方向相反不能进入毛细管中，而样品正离子的迁移方向与 电渗流的方向相同，进入毛细管之后在低电场强度下骤然放慢迁移速度，结果导致样品正 离子在柱上富集浓缩。场放大进样的堆积效率可用下式表示1 57 j ： c 2 c 1 = 1 e i 0 2 e 2 ) e l 和拉1 分别式样品区的电场强度和离子有效淌度。e 2 和2 是缓冲液区的相应参 数。提高样品堆积效率的方法已有广泛的报道 s s 4 q 。一般在进样前以流体动力进样法引 入一小段水柱，加压后该区场强比电泳时高几百倍，使带电物质快速迁移入毛细管，在水柱 和背景电解质交界处堆积。这种方法不需增加设备，富集效果好，灵敏度可提高1 0 0 0 倍，最低检测浓度可达1 0 一m o l l 。 在线s t a c k i n g 富集技术和场放大进样技术一般用于带电离子的分析；如果将这项技 术于胶束电动色谱结合，可以富集中性物质。s t a c k i n g 富集技术有很多种形式，比如普 通s t a c k i n g 富集方式( n s m ，n o r m a ls t a c k i n gm o d e ) 、大体积进样方式( l v s s ，l a r g e v o l u m ns a m p l es t a c k i n g ) 、反向电极s t a c k i n g 富集方式( r e p s m ，r e v e r s e de l e c t r o d e 第1 章绪论 p o l a r i t ys a c k i n gm o d e ) 、反向胶束s t a c k i n g 富集方式( s r m m ，s t a c k i n gw i t hr e v e r s e m i g r a t i o nm i c e l l e s ) 、前导水柱- 反向胶束s t a c k i n g 富集方式( s r w , s t a c k i n gu s i n gr e v e r s e m i g r a t i o nm i c e l l e sa n d aw a t e rp l u g ) 、场放大进样方式( f e s i ，f i e l de n h a n c e ds a m p l e i n j e c t i o n ) 、反向胶束一场放大进样方式( f e s i r m m ) 等，可以满足各种物质的分析要求。 由于不同的方式采用不同的富集方法，故有不同的富集倍数。 1 4 2 3 在线s w e e p i n g 富集技术 s w e e p i n g 富集技术是一种最初应用于m e k c 中的毛细管电泳富集方式，在前面已 经讨论了m e k c 不仅可以用于带电离子的分离，还可以用于中性物质的分离分析。在 线s w e e p i n g 富集技术同样可以同时用于带电离子和中性分子的富集，大大拓宽了在线 富集的应用范围。这种技术在1 9 9 7 年首先由g i l g e s 等提出【6 2 1 ，它的基本原理是样品带 不含胶束，而背景缓冲溶液含有胶束。施加电压后，当胶束定向移动穿过样品带时，由 于样品与胶束的相互作用，样品会随着胶束一起移动，使样品带压缩从而实现富集f 6 3 ，矧。 在线s w e e p i n g 富集技术中，最早用s d s 作为背景胶束相，由于s d s 带负电，在电场中 向正极移动，当s d s 穿过不含胶束的样品带时，由于样品与胶束的相互作用，样品会随 着s d s 一起向正极移动，使样品带压缩从而实现富集。 在均匀电场中，在线s w e e p i n g 技术富集后样品带的宽度f s 。可以由下列方程表示： 1 w i j w 去( 1 1 2 q 是开始时样品带长度，是样品带充满胶束相后样品的容量因子，通常可以假设 等于背景带的容量因子。从式( 1 - 3 ) 可以看出s w e e p i n g 富集技术的富集因子只与分配 因子和进样长度有关，由于样品对胶束相有几乎无限的亲和力或者说样品的容量因子无 穷大，因此从理论上说s w e e p i n g 富集技术的富集因子是无限的。实际上富集因子受到 各种因素的影响，比如毛细管柱长，毛细管电泳仪的最高电压等。当没有电渗流存在时， 在保证富集后的区带有合适的分离度的前提下，最长也只能从进样端到检测器窗1 2 1 的 长度：此外，目前所有的毛细管电泳仪所能适用的最高电压是3 0 k v ，这也限制了 s w e e p i n g 富集技术应用于浓度更低的溶液。当有电渗流存在时，由于样品带的整体移动， ，。会更变得更短。 在非匀强电场中，如果样品带的电场强度低于背景带的电场强度，7 s 。也能用方 程( 1 3 ) 表示，理论上，由于背景带中的胶束相的s t a c k i n g 富集作用产生更高浓度的胶束 河北大学理学硕士学位论文 相进入样品带，从而使容量因子更高，但是实际应用中这么做不会对s w e e p i n g 富集技 术产生富集因子的提高。如果样品带的电场强度高于背景带的电场强度，富集作用是 s w e e p i n g 富集作用和s t a c k i n g 富集作用的综合作用，分析物质首先由于s w e e p i n g 富集 作用产生第一次富集，经过第一次富集后的区带到达电场强度不同的界面时，区带又由 于s t a c k i n g 富集作用发生第二次富集，因而产生更好的富集效果岬i 。 s w e e p i n g 富集技术和s t a c k i n g 富集技术相比，其优势在于：在线s w e e p i n g 技术不 要求样品带有比背景带更低的电导，只要样品带不含胶束而背景带含有胶束富集就能发 生；在线s w e e p i n g 技术的富集效果比在线s t a c k i n g 技术更高，5 0 0 0 倍的富集倍数已有 报道f 6 3 1 ：s w e e p i n g 富集技术无论电渗流存在与否陋6 7 1 或分析物质是否是离子状态，都 能发生富集，所以s w e e p i n g 富集技术不仅可以用于带电离子的分析，同时可用于中性 样品的分析，这使得s w e e p i n g 富集技术成为一种全能的方法而受到普遍的欢迎。一些 有机改性剂像乙醇、乙腈的加入由于增加了样品的溶解度或者调整了缓冲液的p h 值进 而提高了s w e e p i n g 富集技术的富集效果。可见，在线s w e e p i n g 技术是一项很有发展前 景的m e k c 在线富集技术1 6 8 。”。 1 5 毛细管电泳中的双峰现象 毛细管电泳的富集技术可以很好的改善该项技术的灵敏度，从而使毛细管电泳更好 的应用于分析分离科学，但在毛细管电泳技术中还存在着另外一个问题，它会给毛细管 电泳的定性分析带来困难，那就是双峰现象。 在毛细管电泳的分离过程中，有时可以观察到这样一种实验现象，某组分在出峰后， 后面又出了附加的峰弘硼，对此现象不同的研究者给出了不同的解释。a n d e r s s o n d 等 研究了i m i z a d o l ec r e a t i n i n e2 - a m i n o p y r i m i d i n e 溶解在水中与不同缓冲液作用时双峰现 象，发现当采用异性电荷的缓冲液时有双峰出现，而采用同性电荷的缓冲液时可以避免 这一现象；r e v i l l a 等认为造成这种现象的原因有两个方面，一是样品与缓冲液之间的 作用的结果，二可能是产物中有副产物存在；而r e v i l l a 的观点是样品与缓冲液中的硼 酸赫生成了某种络合物而导致双峰甚至三峰的出现的。g i l 等在用以s d s 作为胶束相的 m e k c 模式分离甲基黄酮苷类化合物时发现，如果在样品或缓冲液中有甲醇存在，这 些增水性的黄酮类会出现双峰或三峰现象，即一种组分对应两个或三个峰，二极管矩阵 检测器的紫外光谱显示了这些峰的一致性：当用乙腈代替甲醇时，这种现象消失，如果 1 0 第1 章绪论 用含乙腈的缓冲液溶解样品可以获得峰形锐利的单峰。他们所用的缓冲液p h 是8 0 。 他们对此的解释是，组分在进入到缓冲液区域时会由于其很强的憎水性而发生沉淀，由 此产生了双峰现象。 e r m a k o v 等m 对c z e 中双峰现象进行了研究，指出在分离人工配制的被分析物溶 液时，如果样品浓度很高，经常会出现上述情况，即使样品中只有一种被测物也是如此。 他们的研究发现，这两种现象之间存在着一定关系。当前一现象的峰出现后，如果能够 分离足够时间，可以看到在后面会出现后一现象的峰；这两个峰的前一个是拖尾峰，后 一个是前伸峰，两峰之间的基线高于两峰之外的基线。这个完整的现象用管壁吸附和存 在杂质是不能解释的。他们对此的解释是，在适当的缓冲液中，组分区带在分离过程中 被背景电解质溶液逐渐穿透，溶液的p h 使组分的电离情况发生改变，一部分仍为带电 离子，另一部分成为不带电的成份，这样，一个组分的峰就被分裂为两个，对吡啶在乙 酸