（生物化学与分子生物学专业论文）棉花ghwrky3基因的分离及其表达特性分析.pdf

符号说明 a b a ：a b s c i s i ca c i d ，脱落酸 6 b a ：6 - b e n z y l a d e n i n e ，6 苄基腺嘌呤 a m p ：a m p i c i l l i n ，氨苄青霉素 b p ：b a s ep a i r ，碱基对 b s a ：b o v i n es e r u ma l b u m i n ，牛血清蛋白 c g o s s y p i i ：c o l l e t o t r i c h u mg o s s y p i i ，炭疽病菌 c a m v 3 5 s ：3 5 sp r o m o t e ro fc a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s ，花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子 c r b ：c a r b e n i c i l l i n ，羧苄青霉素 c t a b ：c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ，十六烷基三乙基溴化铵 d e p c ：d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ，焦碳酸- 7 , 酯 d n a ：d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，脱氧核糖核酸 d n t p ：d e o c y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ，脱氧核糖核苷三磷酸 e c o l i ：e s c h e r i c h i ac o l i ，大肠杆菌 e b ：e t h i d i u mb r o m i d e ，溴化乙锭 e t ：e t h y l e n e 乙烯 e o x y s p o r u mfs p v a s i n f e c t u m ：f u s a r i u mo x y s p o r u m s p v a s i n f e c t u m ，棉花 枯萎病菌 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d g a ：g i b b e r e l l i n ，赤霉素 i - p c r ：i n v e r s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，反向p c r h 2 0 2 ：h y d r o g e np e r o x i d e ，过氧化氢 k a c ：k a l i u ma c e t a t e ，醋酸钾 k a r l ：k a n a m y c i n ，卡那霉素 l b ：l u r i a - b e r t a n im e d i u m ，l b 培养基 m o p s ：3 - ( n - m o r p h p l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i c ，3 一( n 一吗啉代) 丙磺酸 m s ：m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m ，m s 培养基 m e j a ：m e t h y lj a s m o n a t e ，茉莉酸甲酯 n l s ：n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l ，核定位信号序列 37iiii6量至8怵7 1帆y o r f ：o p e nr e a d i n gf r a m e ，开放阅读框 p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应 p v p ：p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ，聚乙烯吡咯烷酮 r i f ：r i f a m p i c i n ，利福平 r s o l a n i ：r h i z o c t o n i as o l a n i ，棉花立枯菌 r n a s ea ：r i b o n u c l e a s ea ，核糖核酸酶a r t - p c r ：r e v e r s et r a n s c r i p t a t i v ep c r ，反转录p c r s a ：s a l i c y l i ca c i d ，水杨酸 t r i s ：t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ，三羟甲基氨基甲烷 y e p ：y e a s te x t r a c ta n dp e p t o n em e d i u m ，y e p 培养基 a - n a a ：a - n a p t h a l e n ea c e t i ca c i d ，仅萘乙酸 j a ：j a s m o m ca c i d ，茉莉酸 e t ：e t h y l e n e ，乙烯 r o s ：r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，活性氧 s a r ：s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e ，系统获得抗性 h r ：h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，过敏反应 p c d ：p r o g r a m m e de e l ld e a t h ，程序性细胞死亡 p r ：p a t h o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i n ，病程相关蛋白 2 目录 摘要1 a b s t r a c t 3 1 引言5 1 1 病原相关分子模式激发的免疫反应( p t i ) 5 1 2 效应蛋白激发的免疫反应( e t i ) 6 1 3 植物激素与植物抗病反应7 1 3 1 水杨酸、茉莉酸与乙烯7 1 3 2 脱落酸8 1 3 - 3 其它一些与抗病相关的激素9 1 4 转录因子10 1 4 1w r k y 转录因子的发现及其起源l o 1 4 2w r k y 转录因子的结构特点1 1 1 4 3w r k y 转录因子的结合序列1 3 1 4 4w r k y 转录因子的分类1 4 1 4 5w r k y 转录因子的生物学功能1 4 1 5 本研究的目的和意义1 7 2 材料与方法1 9 2 1 实验材料19 2 1 1 植物材料。1 9 2 1 2 植物材料培养与处理1 9 2 1 3 菌株与质粒19 2 1 4 酶与各种生化试剂2 0 2 1 5p c r 引物2 0 2 2 实验方法2 1 2 2 1r n a 提取。21 2 2 2e d n a 第一链的合成2 3 2 2 3e d n a 回收纯化与加尾。2 3 2 2 4c d n a 全长序列的获得2 4 2 2 5 植物总d n a 的提取与纯化2 7 2 2 6 基因组d n a 的获得和启动子的分离2 9 2 2 7 目的片段的回收3 0 2 2 8 目的片段与克隆载体的连接一3 1 2 2 9 大肠杆菌感受态细胞制备31 2 2 1 0 大肠杆菌感受态细胞的转化3 1 2 2 1 1 质粒d n a 的提取3 2 2 2 1 2 对重组质粒的鉴定3 4 2 2 1 3 半定量r t - p c r 检测目的基因的表达3 5 2 2 1 4 植物表达载体的构建与转化3 6 2 2 1 5 农杆菌介导转化烟草4 0 2 2 1 6 转基因植物的鉴定4 1 2 2 1 7 主要的序列分析软件4 l 3 结果与分析4 3 3 1 棉花g h w r k y 3 基因的克隆4 3 3 1 1 棉花r n a 的提取及反转录4 3 3 1 2g h w r k y 3 中间片段的分离4 3 3 1 3g h w r k y 35 片段的分离4 4 3 1 4g 矗强乃3 片段的分离。4 4 3 1 5g hw r k y 3 全长c d n a 的分离4 4 3 2 僦聊乃的序列分析4 5 3 2 1 鳓聊乃的全长c d n a 序列分析4 5 i l 3 2 2g h w r k y 3 编码蛋白序列分析4 7 3 2 3g h w r k y 3 基因组序列分析5 0 3 3g h w 砌 ；幽 ：h - m ；卜四；一、l 一彳鬲、p t d d p 暴 谚裂 ( 乃吣9 c ) 一t r i g g e r e d 登竺： ：! ! ：! ! ! 芝：墨。 - l o w * 州旧一侧嬲耋圳一r c 一l 图1 1 植物与病原菌共同进化形成p 1 r i 、e t i ( 引自c h i s h o l me ta 1 ，2 0 0 6 ) f i g 1 一lm o d e lf o rt h ee v o l u t i o no f b a c t e r i a li np l a n t s 6 山东农业大学硕七学位论文 1 3 植物激素与植物抗病反应 植物体能够产生多种植物激素，这些植物激素常以信号分子的形式作 用于植物细胞，从而在植物的生长发育和抗逆反应中发挥重要的作用。过 去对介导抗病反应的信号分子的研究主要集中在水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ， s a ) 、茉莉酸( j a s m o n a t e s ，j a ) 和乙烯( e t h y l e n e ，e t ) 上。最近许多研 究表明，生长素( a u x i n s ) 、赤霉素( g i b b e r e l l i n , g a ) ，脱落酸( a b s c i s i c a c i d ，a b a ) 、细胞分裂素( c y t o k i n i n s ，c k ) 等在植物抗病信号转导途径中 同样发挥了重要的作用。 1 3 1 水杨酸、茉莉酸与乙烯 s a 、j a 、e t 是植物体抗病信号途径中的三种关键的信号分子，它们是 植物抗病过程中起主要作用的植物激素( g l a z e b r o o k , 2 0 0 5 ；l o r e n z oa n d s o l a n o ，2 0 0 5 ；b r o e k a e r te ta 1 ，2 0 0 6 ；l o a k ea n dg r a n t ，2 0 0 7 ；b a l b ia n dd e v o t o ， 2 0 0 8 ) 。s a 作为一种信号分子无论是在局部抗性还是系统获得性抗性中都 发挥了重要作用，它主要介导活体营养型病菌激发的抗病反应( g r a n ta n d l a m b ，2 0 0 6 ) 。研究表明，植物在受病原菌侵染后，其感染部位s a 含量上 升，同时一些抗病相关蛋白( p r ) 也被诱导表达，提高了植物的广谱抗性； 而外源s a 同样可以诱导植物增强对病原物的抗性，产生s a r ( d o r e y e ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。s a 在抗病反应中的重要作用最直接的证据来自于对n a h g ( s a l i c y l a t eh y d r o x y l a s eg e n e ) 转基因植物的研究，n a h g 编码水杨酸羟化 酶，可以将s a 降解成儿茶酚。在转讹h g 的植物中，病菌侵染不能激活擞j 基因表达，也不诱导产生s a r ，转基因植株抗病性降低( m e t r a u xe ta 1 1 9 9 0 ) 。 j a 参与了植物体多种生物学过程，如种子萌发、根的生长、茎的形成、 叶的衰老、气孔的张开、果实的成熟等( u e d ae ta 1 ，1 9 8 0 ；w e i d h a s ee ta 1 ， 1 9 8 7 ；r a j e n d r ae ta 1 ，2 0 0 9 ) ；而e t 是一种气体性的植物激素，同样在植物 的多种生物学过程中发挥作用，如种子萌发、开花、叶片的衰老、根的结 瘤等( j o h n s o na n de c k e r , 1 9 9 8 ) ；除此之外，j a 、e t 在植物的抗病反应中 也起了重要作用( l o r e n z oa n ds o l a n o ，2 0 0 5 ；w a s t e m a c k , 2 0 0 7 ) 。与s a 相 反，j a 、e t 一般介导坏死营养型病菌、昆虫侵害及伤所激发的抗病反应， 7 毫毽鼍耄瓠 棉花g h w r k y 3 基冈的分离及】t 表达特性分析 植物防御素删2 是该途径的标志。一般来讲j a 、e t 与s a 所介导的抗病 反应是相互拮抗的，但是也有研究发现它们介导的信号途径之间存在协同 效应( s c h e n ke ta 1 ，2 0 0 0 ；k u n k e la n db r o o k s ，2 0 0 2 ；b e c k e r sa n ds p o e l ，2 0 0 6 ； m u re ta 1 2 0 0 6 ) 。许多研究发现，受病原菌侵染的植物，其感染部位或 者是受损组织j a 浓度升高，外源j a 也可以使植物体表达抗病相关蛋白 ( l o r e n z oa n ds o l a n o ，2 0 0 5 ；w a s t e r n a c k ，2 0 0 7 ) 。接种病原菌的拟南芥中，其 j a 、e t 含量均升高，且积累p d f ，2 ，并产生对病原菌的抗性( p e n n i n c k xe t a 1 1 9 9 8 ) 。外源j a 、e t 处理拟南芥也能使p d f l 2 的表达量升高，并产生 s a r 。j a 、e t 虽然也是诱导产生s a r 的信号分子，但与s a 诱导产生的s a r 信号途径不同，是不依赖于s a 的( d o n g , 1 9 9 6 ) 。 1 3 2 脱落酸 a b a 涉及了植物的生长发育的多种过程，包括种子萌发、胚胎成熟、 叶片衰老、气孔关闭，此外在植物对非生物胁迫的适应中尤其是在渗透胁 迫中发挥着关键作用( a s s m a n na n dw a n g ，2 0 0 1 ；m a c r o b b i e ，1 9 9 8 ； h i m m e l b a c he ta 1 ，1 9 9 8 ；l o p e z - m o l i n ae ta 1 ，1 9 9 8 ；c h i n n u s a m ye ta 1 ， 2 0 0 8 ) 。最近研究表明，a b a 在抵抗病原菌侵染和昆虫侵害过程中也发挥 了重要作用( c h i n n u s a m ye ta 1 ，2 0 0 8 ；r a j e n d r ae ta 1 ，2 0 0 9 ) 。一般来说， a b a 在各种坏死营养型病菌和活体营养性病菌引起的抗病反应中起负调 控作用。例如接种疫霉( p h y t o p h t h o r a ) 的大豆中，只在感病植株中监测 n a b a 浓度升高( c a h i l l e ta 1 ，1 9 8 9 ) 。但a b a 在抗病反应中也能起到正 调控作用，例如a b a 促进气孔关闭，关闭的气孔进而抵制了细菌的侵染 ( m e l o t t oe ta 1 2 0 0 6 ) 。a b a 在抗病信号途径中的作用相当复杂，它起到 的作用常依赖于不同个体的病原菌与寄主之间的相互作用。越来越多的研 究表明，a b a 在植物抗病过程是通过影响胼胝质的沉积、产生r o s 、调节 抗性基因的表达来发挥作用的( r a j e n d r ae ta 1 ，2 0 0 9 ；x i n ge ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 t o n 等认为在病原菌入侵的早期，a b a 在植物防卫反应中起正调控作用； 在之后的病原菌增殖过程中，a b a 则抑制了防卫反应。在病原菌侵染后期， s a 和j a 介导的防卫反应占主导地位，但如果在早期的防卫反应中能够有效 的抑制病原菌的入侵，就不需要激活s a 和j a 介导信号途径( t o ne ta 1 ， a b r a s s i c i c o l a 的敏感性增高，这可能是由于影响了s a 和j a e t 信号途径而 发挥作用的( r a j e n d r ae ta 1 ，2 0 0 9 ；r o b e r t s e i l a n i a n t ze ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 在拟南芥和水稻中，生长素应答基因g h 3 在参与了抗逆反应，在水稻 中，g h 3 8 基因过表达提高了水稻对白叶枯病菌的抗性，而且这种抗性是 不依赖于s a 和j a 信号途径的( d i n ge ta 1 ，2 0 0 8 ) 。一些受生长素诱导的基 因在s a r 反应中被抑制，也就说s a r 可以能够使生长素诱导的基因表达量 下调( w a n ge ta 1 ，2 0 0 7 ) 。研究表明许多病原菌侵染植物体后，影响了生 长素的平衡，同时也改变了一些生长素应答途径中基因的表达模式；生长 素是许多激素信号途径的重要成分，这些信号途径往往是参与对活体营养 型和坏死营养型病原菌的抗性调节( t h i l m o n ye ta 1 ，2 0 0 6 ；n a v a r r oe ta 1 ， 2 0 0 6 ；r a j e n d r ae ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 有研究表明，某些病原菌侵染植物时，影响了多种与细胞分裂素合成、 降解有关的基因的表达( s i e m e n se ta 1 ，2 0 0 6 ) ，并且c k 参与了一些r 基因 介导的抗病反应( i g a r ie ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 p t i 和e t i 是植物体具有的先天免疫系统，它们在植物抵抗病原物的侵 染中同时发挥着重要作用，由p t i 和e t i 激发的植物体抗病反应主要是由植 物激素以信号分子的形式调节的。在这些信号分子介导的抗病反应中，需 9 龟毪鼍 棉花g h w r k y 3 摹冈的分离及j 表达特性分析 要进行大量的转录调控。 1 4 转录因子 通过转录因子而进行的转录调控，在植物体应对外界环境变化和生长 发育过程中发挥了重要的作用。转录因子又成为反式作用因子，是能够直 接或间接的结合在各种顺式作用元件的核心序列上，从而调控靶蛋白转录 效率的蛋白质因子。d n a 结合区和转录调控区是转录因子含有的两个重 要功能结构域( s h c w e c h h e i m e ra n db e v n a , 1 9 9 8 ) 。d n a 结合区是转录因 子识别顺式作用元件相互作用并与之结合的氨基酸序列，常见的d n a 结 合区结构域包括螺旋转折螺旋、锌指结构、碱性亮氨酸拉链、碱性螺旋 环螺旋等。转录调控区通常依赖于d n a 结合结构域以外的3 0 1 0 0 个氨 基酸残基激活或者抑制靶蛋白的表达。 高等植物中存在着大量的转录因子，它们参与了植物的胁迫应答反应 及植物生长发育过程。在模式植物拟南芥中，编码转录因子的基因数量达 到了1 8 2 7 个，而在以籼稻基因组数据为基础分析的水稻转录因子基因中， 其数量超过了2 4 6 2 个，而且这些数据只是对一些主要的转录因子家族进行 分析得到的，数据尚不完全( 吴坤路，2 0 0 9 ) 。这些众多的转录因子通常 以转录因子超家族的形式存在。w r k y 就是一类转录因子超家族。利用遗 传学与分子生物学的方法，许多w r k y 转录因子的生物学功能已经被阐 明，研究表明，w r k y 转录因子超家族在植物的胁迫应答反应及植物生长 发育过程中都发挥着重要的作用。 1 4 1w r k y 转录因子的发现及其起源 有关w r k y 的最初的两篇报道，分别是i s h i g u r o 和n a k a m u r a 从甘薯 ( s w e e tp o t a t o ) 中得到的s p f l ，及r u s h t o n 从a l p h a 中得到的a b f l 、 a b f 2 ，当时对其命名尚不明确( i s h i g u r oa n dn a k a m u r a , 19 9 4 ；r u s h t o ne ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。随后r u s h t o n 等人又西芹( p e t r o s e l i n u mc r i s p u m ) 中分离得到了 w r k y l ，w r k y 2 ，w r k y 3 ，从此将此类转录因子命名为w r k y ( r u s h t o n e t a l 1 9 9 6 ) 。 w r k y 转录因子超家族是主要存在于植物中，至今为止尚未在高等动 物、真菌及细菌中发现w r k y 类转录因子的存在。而在原生动物、黏菌中 1 0 卜一 l 山东农业人学硕上学位论文 发现了w r k y 类转录因子的存在( p a ne ta 1 ，2 0 0 9 ；u l k e ra n ds o m s s i c h ，2 0 0 4 ； z h a n ga n dw a n g , 2 0 0 5 ) 。基于对e s t 数据库的分析发现，在绿藻 c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i 中只有一个w r k y 基因存在，而在地衣 p h y s c o m i t r e l l a p a t e n s 有1 2 个w r k y 基因，在高等植物拟南芥和水稻中分 别鉴定出了7 4 个和1 0 9 个w r k y 成员，这些表明了w r k y 的古老起源及在 进化过程中的大量扩增( u l k e ra n ds o m s s i c h , 2 0 0 4 ) 。到目前为止，发现的 存在于黏菌d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m 和原生动物g i a r d i al a m b f i a 中的 w r k y 类基因都含有两个w r k y 结构域，都属于第1 类成员，这暗示了第1 类w r k y 基因可能是w r k y 存在的最古老的形式。更重要的是，这些发现 表明了w r k y 基因起源于1 5 2 亿年前的真核生物中( u l k e ra n ds o m s s i c h ， 2 0 0 4 ) 。 1 4 2w r k y 转录因子的结构特点 所有w r k y 转录因子都含有被称为w r k y 结构域的d n a 结合域， w r k y 基因因此而得名。w r k y 结构域大约含有6 0 个氨基酸残基，除了 n 末端较为保守的w r k y g q k 外，在羧基端还存在一个典型的锌指结构。 锌指结构的类型有两种，分别为c x 0 5 c x 2 2 2 3 h x 1 h 和 c x 7 c x 2 3 h x 1 一c ( e u l g e me ta 1 ，2 0 0 0 ) 。在绝大多数的w r k y 蛋白中， w r k y 结构域的n 末端都为w r k y g q k 氨基酸序列，但也有少数的 w r k y 蛋白中的w r k y 序列被w r r y 、w s k y 、w k r y 、州y 或者 w k k y 所取代，而g q k 序列被g k k 、g h k 、g e k 所取代( x i e e ta 1 ，2 0 0 5 ； u l k e ra n ds o m s s i c h , 2 0 0 4 ) 。 w r k y 结构域由一个四链的伊折叠组成，一个与锌原子互作的c y s h i s 残基它的一端，而w r k y g q k 则位于伊折叠的n 末端，并且它通过甘氨 酸残基与伊折叠的中间部分结合，w r k y 蛋白质利用这种结构与d n a 分 子的大沟结合从而与d n a 分子相互作用( y a m a s a k ie ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 l，l 棉花g h w r k y 3 基冈的分离及其表达特性分析 a b 1 载磊：毛， 障障阱 + 章熟：。，。a 缝瓣0 m 渤酝一。各一 4 0 0 4 1 04 2 04 3 04 4 04 5 04 6 04 7 0 w r k y 4 c3 9 7i i v 0 t t s e v d l l d d g ，r = j “j g q j v 。g n p y p f ：s ：一_ c t 一- - t p g c - 料e ? a t d p i c a w t t u e g 磁- n h d l p a a k w r 髓3 一c4 0 3 工i 竹s e v d l d g 强w 王_ g q j v ：g n p y p r ：1 一- - - j * - c t t p p c g 住；耳t 强m p k a w t t 疆g 联嗍a a 壬己 w r k y 2 一c4 7 5w v q 孵s d v d i l d d g 豫w i t y g q 形g n p n p i s 曩k c t a p g 怩 日，瑶- - a s h i ) l l ( s v i r r i e g i c - x - d v p a a r w r k y 2 5 一c3 1 6v w q t i s d i d v l i d g ? r “_ t ? g q ：v v f t n 骶s 。! f t c t f q g j ：g v k 旧，e ：二s a a d e r a v l t t t e g r q n h d i p r a l 繇k y 2 81 5 0v s f m r k s e v d h l e d g r h ：k i g q i ，a j ；疆s p y p ? , s y y ? c t 一一- t q k c n v f 孓y e ：s f q d p t v v i t t j e g q j 讲h p i p r n l w r 芄y 81 7 1v s n 仃m 1 ，d h l 阢l g ? r p ：曼奠y g o ! a s p y p r s y y r c t t o k o n 骄： 景，e ：s y q d p ”n ，i t t ! 芭s q h i t i p ! p 口浓 w r k y i - c2 9 5i w h t o t l f d i v n d g ? r h ip - i g q 引? ：g s p y p e s ：+ y f c s s p g c p v k m ，。e i s s t 甩l i 竹j e g 照d h d m p p g r w r 髓4 n2 1 7r s p ：。n v d k p a d d g 献? g q k o v 话s e f p r s y y 蔓c t n p g c p v k ? x ? e ：i s l - d g q v t e i i y k g q - i n h e p p q n t w r 甜3 n2 3 8h r s o p q n a d k p a d d g y n k k k l g q k q i k g s d f p r s ! ? z c t - h p a c p v k ；e q s l - d g q v t e i i ：k c - q f 2 q h e l p q k r 徘料2 一n2 6 1r r g d s m a g g a p a e d g 淄滓k y g q k l ；t ：g s e y p v s i f k c t 一- n p n c o v 啊k e ? s r - e g h i t e i i ? k g ；蠛n h l k p p p n w r k y 2 5 一n1 5 4i k i p a y m v s r n s 赋y g w i j ：y g q f o v 淞黜p r s y f k c t 一- - y p v s _ 3 ：i e t a s - d g q i t e i i k g g h i n 4 p k p e f t 姬t k n n9 9e g n s p f i r e 玎，m e d g n 和罩i c ： g q f l j 鼍g n e f 、肛s ：，y i c t r - h p n c k a k k q l e - s a - g c - q v v d t w f g e h d h p k p u 婚 w r j 程4 01 3 4y k _ f 出搐矽h i l w 双) g y q k e k y g q n 仃：，d n p s p i a ? ? 蔓c a c a p s c s v k i - c ；q 7 s v e d q s 一v a t y e g e 丑州p m p s o i w r k y 63 0 0v s v r a r s e a p m i s d g c q f t ：。p t ： g q ：m a ：国印c p z a i y 翻珊一一a t g c p v p z q q ：a 姬d r s i l i t t e g n h k e 4 p l p p a a w r 敬1 41 9 6a 麟s r s s g e w p s d l f ：a w r t c - q k p i ? g s p f p r g h f c s s - - s k g c s a r k q 厄s r t d p n m l v 工t 1 1 ：s e h n h p w p i q r w e 掰72 6 9v p a v s s 烈a d i p s d e ；s w e ? , y g q p i 隅s p h p k 斛y k c s s - 一v r g c p 般飙e 强l d d a 眦i w e g d 删a i i ，l e t ；“5 8 9 6e n w 如d s p d p i y y d g y l ；k k y g q k s i k s n h q l sf y k c s y n i ( d 麟? e a h m e q 一：i k d n p p v y r 竹j f g 蹦t ：k t e h n l k ；：j ，t9 2 、莉喁诧o 渊g s i d d g x c k i k ：g o 惩i h g s k n p 嗡 , i y i c t l i r f t o d c l a v 硷。o t d p s l f e v k ? l 甜t 删i t s p k i i ? 171 0 1r i a p g a g v d r t l d d g s k f , k y g q i l g a x f p p g i j = c t y r k s q g c e a t y q , q - s d e n q m l l e i s 7 r g i h s c s q a a n v 麓f 蔓y j1 4 6r i s p f a g l e g p q d d v ? s k ：t t f c - q ；t d i l g a k f p e s y y e c r h r s t q n c w a t k q ；q i s d g d a t v f g v t y r g t h t c s q a i t r ： ； - 图i - 2 拟南芥w r k y 结构域序列比对( 引i 刍y a n m s a k ic t a l ，2 0 0 5 ) f i g 1 - 2t h ec o m p a r i s o no f p r i m a r ys e q u e n c e so f a r a b i d o p s i sw r k y d o m a i n w r k y 结构域的另一个特点是其对应的编码区中含有一个内含子，且 位置高度保守，根据内含子插入位置的不同分为两种类型：一种是r 型内 含子，其剪切位点在w r k y g q k 序列后的、通常是第9 个氨基酸r 密码子 a g * g 的两个g g 之间，另一种内含子是v 型内含子，其剪切位点在编码缬 氨酸v 的位点前，由于v 在锌指纹区域内，即为c 2 h 2 的第二个半胱氨酸c 残 基后的第6 个氨基酸，因在v 之前的氨基酸有几种变化，而v 几乎不变，因 此称为v 型内含子( w ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。但是在第1 类w r k y 蛋白的氨基端 w r k y 结构域内囚a a t w r k y 5 3 、6 2 、6 5 和a t w r k y l 9 、4 4 的羧基端w r k y 结 构域内，还有o s w r k y 3 、8 、2 0 、5 3 、5 5 、6 5 、6 6 、7 3 、7 5 、8 1 和甜的w r k y 结构域内没有发现内含子的存在。保守内含子的存在意义尚不清楚，可能 是参与了转录后的加工过程，而部分内含子的缺失可能是由于内含子的逆 转或者是成熟的m r n a 反转录后与含有内含子的等位基因发生了同源重组 1 2 山东农业大学硕上学位论文 ( e u l g e me ta 1 ，2 0 0 0 ；w ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 w r k y 结构域是w r k y 转录因子行使其生物学功能所必需的，它的主 要功能是与d n a 结合。在第1 类w r k y 转录因子中，羧基端的w r k y 结构 域负责与d n a 靶序列结合，其氨基端的w r k y 结构域不能单独的与d n a 结合，但它可能参与了w r k y 与d n a 相互作用的过程，并提高了w r k y 与靶序列的亲和力和特异性( e u l g e me ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 除了具备最典型的w r k y 结构域和锌指结构以外，w r k y 转录因子还 都具有核定位信号序歹u n l s ( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l s ) ，部分w r k y 转录 因子成员还具有其它的一些结构域，如亮氨酸拉链( 1 e u c i n ez i p p e r s ) ，可使 蛋白二聚化；脯氨酸富含区( p r o l i n e r i c hr e g i o n s ) 、丝氨酸苏氨酸富含区 ( s e r i n e t h r e o n i n e r i c hr e g i o n s ) 、谷氨酰胺富含区( g l u t a m i n e r i c hr e g i o n s ) ， 这些结构域一般都与转录激活活性有关( e u l g e me ta 1 2 0 0 0 ) 。 1 4 3w r k y 转录因子的结合序列 到目前为止研究过的w r k y 结构域都能够与一个称为w - b o x 的顺式作 用元件相互作用。w - b o x 的碱基序列为( t ) ( t ) t g a c ( c t ) ，其中t g a c 为它的核心序列。w - b o x 是w r k y 转录因子与d n a 结合所必需的最短的序 列，凝胶电泳迁移实验证明如果w - b o x 中的核心序列t g a c 中的任意一个 核苷酸被替换，w r k y 转录因子与它的结合能力就会迅速下降或完全消 失，说明这种作用是特异的，研究还发现w - b o x 与w r k y 的结合需要金属 离子的参与，用金属络合剂如e t d a 或1 ，1 0 0 p h e n a t h r o l i n e 处理可阻断其结 合，最有可能的金属离子是锌离子，这与w r k y 蛋白中含有锌指结构是一 致的( d ua n dc h e n , 2 0 0 0 ；m a e oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。除核心序列外，w - b o x 的侧 翼序列同样影响了与w r k y 蛋白结合的偏爱性，如a t w r k y 6 和a t w r k y l l 更倾向于与w - b o x 的5 端为g 的序列，而a t w r k y 2 6 ，a t w r k y 3 8 ，a t w r k y 4 3 则更倾向于侧翼碱基为t ，c 或者a 的序列( r u s h t o ne ta 1 ，2 0 1 0 ) 。用生物 信息学与功能研究的方法研究发现，w - b o x 存在于多种与植物抗逆性相关 的基因的启动子中( r u s h t o ne ta 1 ，2 0 1 0 ) 。 除了w - b o x 夕t ，w r k y 转录因子还与其它一些顺式作用元件相结合，如 水稻伙 纷k 3 能够与p r e 4 ( t g c g c t t ) 相结合( c a ie ta 1 ，2 0 0 8 ) 。大麦 棉花g h w r k y 3 基因的分离及其表达特性分析 胁，佩k y 4 6 能够与糖应答元件s u r e ( t a a a g a t t a c t a a t a g g a a ) 相结 合，也能够与w - b o x 结合，而烟草n t w r k y l 2 只能与s u r e 1 i k e 元件结合不 能与w - b o x 相结合( m a n g e l s e ne ta 1 ，2 0 0 8 ；s u ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 1 4 4w r k y 转录因子的分类 w r k y 转录因子基于其含有的w r k y 结构域的数目和锌指结构的类型 分为三类：第1 类w r k y 转录因子含有两个w r k y 结构域，其锌指结构类 型为c x 4 - 5 - c x 2 2 - 2 3 h x 1 h ；第1 i 类w r k y 转录因子只含有1 个w r k y 结构 域，其锌指结构也为c x 4 5 c x 2 2 - 2 3 h x 1 h 型；第1 i i 类w r k y 转录因子也 只含有一个w r k y 结构域，但其锌指结构类型为c x 7 c x 2 3 h x 1 c 。其中 第1 i 类根据氨基酸序列又进一步分为五亚类即：i i a ，l i b ，i i e ，l i d 和i i e ( e u l g e me ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 根据对原生动物蓝氏贾第鞭毛虫、黏菌、衣藻、拟南芥和水稻中的 w r k y 蛋白进行系统发生树分析，z h a n g 和w a n g 将第1 i 类w r k y 转录因子 又分为三个亚组即：2 _ a + 2 一b ，2 _ c 和2 _ d + 2 - e ( z h a n ga n d w a n g ，2 0 0 5 ) 。 1 4 5w r k y 转录因子的生物学功能 运用遗传学及分子生物学的方法，分析鉴定了多种w r k y 基因表达模 式及其功能，发现w r k y 在植物体的多种生物学过程中发挥着作用。 1 4 5 1w r k y 转录因子与生物胁迫 许多研究表明，w r k y 参与了植物体的多种生物学过程，但它在抗病 过程中的作用尤为突出。w r