（生物化学与分子生物学专业论文）酶法生产魔芋葡甘低聚糖研究.pdf

硕士学位论文酶法生产魔芋葡甘低聚糖研究2 0 0 4 年6 月 摘要 目的： 葡甘低聚糖是一种具有多种特殊生理功能的寡聚糖，可以预防肥胖症、糖尿病、龋 齿等多种疾病的发生，减轻人体因摄入过多热量而产生的负担，是新型的功能低聚糖。 本论文运用现代发酵技术及酶工程学原理，利用微生物产酶水解魔芋精粉来制备葡 甘低聚糖。在前期工作的基础上，对自行筛选的一株产高活性葡甘聚糖酶的细菌进行鉴 定，摸索细菌生长和产酶的规律，优化产酶条件，并以摇瓶培养结果为依据，用5l 发 酵放大培养细菌，进一步优化放大发酵条件，此外，对发酵液中的葡甘聚糖酶进行提取 并纯化，探索出一套纯化葡甘聚糖酶的理想方案，建立完整的葡甘低聚糖制备工艺，试 图为工业生产葡甘聚糖酶提供理论依据，为工业化生产葡甘低聚糖提供技术指导。 方法： 首先运用常规方法观察细菌形态，并对2 0 多种生理生化特征进行鉴定，根据伯杰 细菌鉴定手册和常见细菌系统鉴定手册对细菌特征进彳亍检索，为细菌分类到种并 命名。为了了解细菌生长和产酶规律，在摇瓶培养过程中摸索细菌生长的最适培养基及 最佳培养时间，通过正交试验确定摇瓶培养条件的最佳配伍，并在此基础上进行细菌的 放大生产，再次利用正交试验对放大发酵条件进行优化。发酵得到的葡甘聚糖酶经过盐 析、分子筛层析和离子交换层析三个步骤进行分离纯化，纯化后的酶蛋白用聚丙烯酰胺 常规电泳进行纯度鉴定，变性电泳测定其平均分子量，同时对酶作用的最适p h 和最适温 度等特性进行研究，调整酶反应环境，提高酶效。综合试验数据，在其指导下进行葡甘 低聚糖的生产小试，对发酵液的凝聚剂种类和凝聚条件进行研究，同时对粗提酶用于葡 甘低聚糖生产的实际可行性进行模拟，了解粗酶作用比率、时间、温度、p h 等条件，测 定水解产物的总糖含量和还原糖含量，薄板层析法分析产品的寡糖种类，计算原料转化 率和增值率。 结果： 1 通过鉴定，该菌属于芽孢杆菌属，具有耐盐、耐热、液化明胶、水解淀粉、可运 动、好氧兼性厌氧等特点，与芽孢杆菌属中其他种相比较应该是一个新种，目前暂时将 其命名为耐热芽孢杆菌肋c f 盯淞m p r 研。咖m 月s 。 2 口叩珊螂曲p 硎。幽r 册s 产酶的最适培养基为蛋白胨l 、牛肉膏粉0 3 、魔芋精 粉2 、n a c lo 5 、k 2 h p 0 40 2 ，培养条件的最适温度为4 0 ，p h 7 2 ，振荡速度1 2 0 r 瞰1 ，培养时间为2 4h 。该条件下培养的获得的粗酶液平均比活力可达3 8 5 9u m g 。 i j 摘要 3 正交试验分析结果显示，5l 发酵罐培养的最适条件为温度5 0 ，p h6 2 ，发酵 初期搅拌速度为2 0 0r p m ，通气量为4 0l l l ，6h 后变为搅拌速度1 0 0r p 珈，通气量2 0l m ， 得到的最高酶比活力可达4 4 0 3u m g 。肋c f ，船f 船m o 出m h ，生长周期较短，6h 后即进 入对数期，2 6h 后进入稳定期，期间出现二次生长现象。与生物量积累情况相比，所产 酶的活性上升速度更快，直至2 4h 后才开始有明显下降，整个过程中p h 值变化幅度极 小，而溶氧值由于发酵液粘度变化及需氧量变化起落较大。酶蛋白的产量与菌体积累量 密切相关，发酵动力学属于偶联型。 4 盐析浓度在1 4 0 8 0 范围内葡甘聚糖酶的活性较高，将该浓度下沉淀的蛋白质经 s e p h a r o s c6 b 分子筛层析和d e a e 一5 2 离子交换层析分离出达到电泳纯的酶蛋白。纯化倍 数达到6 7 ，酶活回收率为6 7 1 4 。该酶降解魔芋精粉时的j - ( m = 1 0 m 咖l ，= 6 6 7 m 咖l m i n 。s d s p a g e 测定结果表明纯化后的葡甘聚糖酶由三种亚基组成，推断其中可 能含有其他分子量接近的蛋白质或为葡甘聚糖同工酶，结果有待进一步验证。 葡甘聚糖酶在温度为5 0 ，p h 为5 6 5 8 时活力最高。低温对酶活影响不大，4 0 以下酶可在2 0 h 内保持较高活性，而p h 对酶活影响相对显著，在p h5 p h 7 范围内 酶的活力可保持大约l oh 左右，p h8 时则大大降低了酶的活性。金属离子和有机物往往 对酶反应有比较大的影响，对该葡甘聚糖酶来说，z n 2 + 和f e 2 + 对酶的反应有明显的抑制 作用，其他试验的离子和有机物则未见显著的抑制或激活性。 5 在5l 发酵罐上对葡甘低聚糖进行实验性生产的主要工艺为用o 0 5 ( 1 0 0m l ) 氯化钙和o 1 ( 1 0 0m l ) 磷酸氢二钠处理培养2 4h 的发酵液，去除菌体和固体颗粒后在 低温下进行4 0 8 0 浓度的盐析，得到葡甘聚糖粗酶，脱盐后直接与魔芋精粉以l ：3 0 0 ( w ，w ) 的比例混合，5 0 下保温1 0h ，充分水解后4o o or d m 下离心，去除未降解的 魔芋粉，得到葡甘低聚糖浆，最后由喷雾干燥得到低聚糖粉。 经测定葡甘聚糖的转化率为6 6 6 ，糖粉中总糖含量为9 0 1 1 ，还原糖含量为 1 3 0 9 ，薄板层析结果显示糖粉中单糖浓度很低，肋c 珊淞胁刚加西嗍，所产生的葡甘 聚糖酶可能是一种内切酶。小试生产的葡甘低聚糖产品有较好的复溶性，液体透明无异 昧，不需对产品进行脱色和除单糖等特别处理，生产工艺比较简单，所使用的仪器和试 剂成本也较低，生产流程不对环境造成污染，是一个经济效益和社会效益都相当可观的 课题项目。 关键词：魔芋，葡甘聚糖酶，葡甘低聚糖，发酵 硕士学位论文酶法生产魔芋葡甘低秉糖研究2 0 0 4 年6 月 a b s t r a c t o b j e c t s ： t bi 出田t i 分as n - a i n p m d u c 抽gk 曲a c t i v i t yk o n j a cg j u c o m 删a n a s e ，i n v 部d g a t et h e r e g u l a r i t y o fb a c t c r i a l g m w t l l a n d f c 册e n 枷o n ，v e r i 匆 山ec o n d i t i o n so f p r o d u c i n g g i u c o m a l l l l a i l a s e ，p r o b e i i l t ot 1 1 e p l l r m c a t i o n m e t l l o d s 柚dt h ec h a r a c t 甜s t i c so f 9 1 u c o - m 籼a i l a s e ，f o u n d a p r o c e s sp r o d i l c i n gk o n j a co i i g o s a c c h a r i d e m e t h o d s ： n l e 啦a i l lw 嬲i d e n t i 矗e d 、砘t l l 舭c h a r a c t 耐s t i c so f m o 叩ha l l dp h y s i o l o g i c a lb i o c h e m i s n y 觚c 眦m n g t 0b e 曙e yxm n 黜瑾l 可隗t e r m i 舶t 如eb a c t e r i o l o 科a n dd e t e r m i 船f i v em n m n l c b 珊肌d b 伽钯r 蛔，t l l es t r a i nw 晒霉d u p e di n t og e m l so re v e ns p e c i e s b a do ns l l a k en a s k s t h co 州妇u mc u l 眦a n df a 1 i l e n 扭t i o nt i i n cw e r es t i l d i e d 趾dm e i lt h ef e 玎n e n t a t i o nc o n d i t i o i l s w e r ev e r i f i e do n5lf e 珊e m a t o rw 曲t l l eo m l o g o n a le x p e r i m e n t k o 坷a cg l u c o m a n n a n 硒e 娜 s 印a m t e d a n d p u r i 五e dt l l m u g h 砒n i n o l l i 岫s u l p h a t ep r e c i p i 蜥o n ，g e i f i l 虹a 主i o n c h r o m a t o 掣印h y ( s 印h a m s e6 b ) a l l d i o nc x c h 孤g ec h r o m 舢。聊h y ( d 队e - 5 2 ) ，t l l c t l l e p m t e i n 叫母w a s d e t e n n i 舱t c db yp a g e 锄dm cm o l e c u l a rw c i g b tb ys d s p a g e f u r n l e 珊o r e ，m e e 1 1 z y m ec h a r a c t e r i s t i c sw e r ei v e s t i g a t e da b o u t 也eo 州曲岫p h a dt e l 砷馏l t u 锄ds o0 nt o i 】p i m r ee m 净r 丑l ea c t i “t y l r o u g ha d j u s t i n g 廿1 ef c t i o ne 1 1 “r 0 删n 既l t s b a s e do n l e 砒0 v e f e s l l l t s ，m es m a l ls c a i eo fk o s 跚d u c t i o n i ss t i l d i e dm l u m n gm e a g g l u t i n a t o ra i l d 龇c n l d e e n 巧m e sr e a c t i o nc o n d i t i o n s m e 删l e 也ep a r 蛳e t e r so f k o s s p e c 蛐e n ，s u c ha sm es u g a r c o n t e n t sa n dc o i i l p o n e n t s ，t r a i l s f b 肋a l i o ne 伍c i e n c ya 1 1 ds oo n ，a r cd 删n e d r e s u l t s ： a c c o r d i n g t om o r p h 吐t e r i s d c sa n d p h y s i o l o 百c a lb i o c h e i n i s t r ya 1 1 a l y s i s ，血i ss 乜面n i si d e n t 湎e d 船觑甜如c o h n b u et oi t sd e v i a t i o nw i lo t l l e rs p e c i e so f 肋c 讲“sc 6 h n ，t l l i s 删n m a y b e an e w s p e c i e s ，f o ft h e t i m e b e i n g i tw a sn 锄e d 肋c f 盯淞， p r 聊d 砌，d 瑚 o nt h es h a k ef l a s k s ，m eo p t i m 哪c u l t u r ei sp e p t o n e1 ，b e e fe x t r a c to _ 3 ，k o n j a c g l u c o m a i m a i l2 ，n a c lo 5 、k 2 h p 0 4o 2 ，t h eo p t i m mt e m p e r a t u r e4 0 ，p h7 2 ，r o t a t i r 培 v e l o c i t y1 2 0 叩m t h ec n l d ee m 掣m es p e c i f i ca c t i v i 可i sa v e r a g p t o3 8 5 9 u m g t h r o u 曲t l l eo m l o g o n a le x p e r i m e m ，t h eo p t i m 砌m a g i l i f i c a t i o nc o n d i t i o n s o n5l f e m l e n t a _ c o ra r et e m p e r a t u r e5 0 ，p h6 ，a tp m p h 嬲es t i r r i n gv e l o c i t y2 0 0r p m ，r a t i o nr a t e4 0 l m ，m e n a f t e r6 h s t i r r i n gv d o c 毋1 0 0r p m ，a e r a t i o n r a t e2 0m t h c a v e r a g es p e c i f i ca c t i v i t y 摘要 i s4 4 0 3u m g w h e nm o n i t o r e do nl 妯e ，t h eg r o w mo f b a c t e r i ae n t e r e dl o g a r i t l l n l i cp h a s ea f t e r6 ha i l ds 切t i o f l a r yp h 嬲ea 船r2 6h t h ee n z y m es p e c i f i ca c t i v 时d e c r e a s e d 心e r2 4h m 廿l i s c o u r s e ，d oc h a l l g e dl a r g e l yw h i l ep h 啪s s t a b l e i nv i e wo fm ef e l a t i o nb e 仰e e nt h eb a c t e r i a g r o w t l la n d t h ep r o d u c t i o n ，也ef b n e n t a t i o nw a s c o u p l i n gk i n e t i c s ( 孕p u r 讯c a t i o no fk o n j a cg l u c o m a n n a n a s ei n c l u d e sm r c es t e p s ：a 工n m o i l i u ms u l p h a t e p r c c i p i t a t i o 玑g e l f i l t r a t i 咖 c h r o m a t o 舯p h y a 1 1 di o n e x c h a n g ec h m m a t o g r 印h y g l u c o m a n n a n a s ep r c c i p i t a t i o nc o n c e n n 州o ni sa tt h er a n g eo f4 0 8 0 。s e p h a m s e6 ba n d d e a e 一5 2h a v eb e t 时r e s o l v i n gp o w e r a 盘e rt l l et t l r e e s t c pt r e a 衄e m ，p 瓜f i c a t i o nf o l di s6 7 砸t l l6 7 1 4 e i l z y m ea c t i v i t yr e c o v e r y 趾ds i n g l eb a n ds h o w sb yp a g ed e t e m i n a t i o n w h e n s u b s 仃a t ei sk o 玛踮g l u c o m 删a i l ，e n 巧m e h a s 缸o f 6 m g m l m i n 髓d 盖m o f 1 0 m g m l a c c o r d i n g t 0 圮s d s - p a g er e s u l t ，t l l ep 面f i e de n 巧m eh 嬲t h r e es 删t s 锄di t 砸ub e s t u d i e dd e e p l yw b e 山e rt h ee r l 巧m eh a ss i l l g l e p r o t e i i l o ri ti sa n a t h e ri s o e 忧可m e t l l i s 四u c o m 咖a n 勰es h o w sm em a x i m a la c t m t ya tt e l n p e r a t l 职5 0 a n dp h5 6 5 8 w h e n t e ：m p e r a l ：u r ei sb d o w4 0 ，nr 锄血e d9 0 a m i v i 够f o r2 0h o u r s a tt l l er 柚g eo f p h5 7 e n 驷e 剃、r i 毋c a n i e m 痂f o r l o h o u r so rs 0 z n 2 + 趾d f e 2 + 脚e 辨a t i l l l l i b 试o n o n e l l 巧，i n e a d 由m y w h i l e0 t h e rt r i a li o n 锄d o 曙a 血cc o m p o m l d h a v el i t d ee 任b c to n 钺时v t 啦 a f t e rf e m e m e dm a s hw 嬲p r e t 陀a t e db yt i l e m i x t t l r eo fo 0 5 c a c l 2 锄【d0 1 n a 2 h p 0 4 。t h eb a c t e r i a 柚ds o l i dp a r c i c l e sw e r es 印a m t c da n dt h e ns a n e d o u ta t4 0 8 0 u n d e r0 m ec 川d ec i l 巧m ew a sd i a l y z e d 柚dm i ) ( e dk o n j g l u c o m 锄l n 趾a tt h es c a l eo f 1 ：3 0 0i nw a t e r ，m e na c t e dm d e f5 0 f o rl oh o u r s a a s t ，m eh y d r o l y z a t ew 勰s p r a y d r i e dt o m c k o 坷a co l i g o s 砌a r i d ep o w d e l i l lt 1 1 i sc o l l r s e ，k g m 盯e 仃孤s f o m l e dk o s b y6 6 麟t o t a l 嘴a ra n dr e d u c i n gs u g a r c o n 协她a r c9 0 1 1 a i l d 1 3 0 9 r e s p e c t i v e l y 1 1 他i s n o m o n o s a c c h a r i d ei nk o s p o 、v d e r b y1 1 1 i n - l a y e rc h m m 咖g 哪l y - n eo l i g o s a c c h 蕊d ep o 、v d e r h a sg o o dr e s o l u b i l 时a i l d l el i q u i dh 嬲n os m d l 锄dn oc o l 0 l1 1 l i sp m d u c i i l gp r o c e s si s s i m p l ya n de 矗b c t i v e ，m e a n w l l i l ei t1 1 a sc o n s i d c r a b l e e c o n o 1 i ca n d s o i e 够r e s u l t s k e yw o r d s ：彳m d ，p 细砷口珈sk o 面a c ，k o n j a cu c o m a n n a n a s e ，k o 珂a co l i g o s a c c h a r i d c ， 蠡棚e n t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生始闽海囊，研究生签名：嘲蹲、熙， 时间：彩浒年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：司海是 时间：易卯手年月日 导师签名 关聚瓢 时间：少卿绰月日 硕士学位论文酶法生产魔芋葡甘低聚糖研究2 0 0 4 年6 月 第一章功能性低聚糖研究概况 低聚糖( o i i g o s a c c h a r i d e s ) 是由2 1 0 个单糖或其衍生物聚合而成的一种寡聚体化合 物，己知的低聚糖通常是由己糖通过糖苷键连接形成的直链或支链低度聚合物【”。根据 单糖组分的差异可将低聚糖分为两类，由一种单糖结合而成的低聚糖称为均低聚糖 ( h o m 0 0 1 i g os a c c h 矗d e ) ，由两种或两种以上单糖结合而成的低聚糖称为杂低聚糖 ( h c t e r o o l i 9 0s a c c h a r i d e ) ；若根据低聚糖的生物学功能来划分则为功能性低聚糖和普通低 聚糖两大类，蔗糖、乳糖、麦芽糖等属乇普通低聚糖，仅作为供能物质，无促双歧杆菌 生长等特殊生理作用，而功能性低聚糖则是一类人体难以消化的糖类，所以又被称为非 吸收性寡糖( n o n - d i g e s t a b l eo l i g o s a c c h a r i d e ) ，这类低聚糖具有一般糖类的口感，但甜度 和能量只有蔗糖的2 0 7 0 ，它们通常具有多重生理调节机能，有的具有防龋作用，如 帕拉金糖、偶联糖，有的具有抑制肠道腐败细菌梭状荚膜菌生长的作用，如麦芽三糖、 四糖等，有的不仅具有抗龋作用，还能作为双歧因子选择性地被肠道有益菌利用却不被 人体消化吸收，如低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚葡甘聚糖等【2 】， 是一类重要的双歧杆菌促生长因子( b i f i d l l sf ；l c t o r ，b f ) 。 1 1 功能性低聚糖的生理作用 临床研究表明1 2 3 】，功能性低聚糖具有良好的整肠作用，不仅可以促进双歧杆菌的生 长，还可以对机体的某些生理活动进行调节，满足人体对食品营养和感官的需求，更主 要的是增强体质、促使机体向健康态转化，主要的功能与作用有： 促进双歧杆菌等有益菌增殖，抑制肠道腐败细胞，可使肠内腐败产物显著减少； 双歧杆菌等发酵产物中含有醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等促进肠道蠕动的有机物，可 以解除便秘，减少粪便臭味； 有助于血清中低密度脂蛋白( 1 0 wd e n s 时l i p 6 p r o t c i n ，l d l ) 的降低及高密度脂蛋白 ( i l i 曲d e n s i t yl i p o p r o t e i n ，h d b ) 的升高，具有防止心脑血管疾病的功效； 不能被口腔龋齿病原菌突变链球菌利用，可防止蛀牙； 改善人体对食物中钙的吸收： 所含热值低，不会引起血糖的骤然升高； ( 七) 调节人体免疫力，降低癌变发生的机率： 阻止自由基形成，具有良好的抗衰老作用； 具有水溶性膳食纤维的功能； 抗菌，抗炎，抗病毒。 第一章功能性低聚糖研究概况 1 2 功能性低聚糖的研究与应用 1 2 1 在食品工业的研究与应用 由于功能性低聚糖具有一般糖类的口感，其甜度和能量却远远小于一般糖类，而且 具有特殊的生理功能，成为食品业的新宠。国际上已有十多种功能性低聚糖实现了工业 化生产，广泛用于各种保健食品、婴幼儿食品添加剂【4 】，包括饮料、酸奶、冷饮、乳品、 糖果、糕点、面包、果冻果酱、糖浆等等。在这一领域的研究、开发与应用，日本一直 走在世界的前列，过去2 0 年中低聚糖领域的主要成果大部分来自日本，目前其研究规模 和消费市场仍在不断扩大，如日本每年要消费5 0 多万吨用双歧杆菌和乳酸菌发酵的酸奶， 其中大多数产品中添加了低聚糖做成协生型产品【“，在很大程度上克服了活菌制剂的种 种缺陷。此外，日本还积极研究低聚糖的新功能，扩大其应用范围，如日本的凡家制糖 企业联合开展的研究发现，大豆和蜂蜜中含有的低聚糖有改善过敏性皮炎的作用【5 】。日 本明治公司是世界上率先使用转移酶法生产低聚果糖( f m c t o s eo l i g o s a c c h 耐d c s ，f o s ) 的一家制药企业，该公司在研究低聚果糖整肠功能的同时发现它有促进钙和镁等无机盐 吸收的新功划“。继日本之后，欧洲各国对低聚糖的开发热情也在逐渐升温，生产能力 大幅提高，应用范围不断扩展。 我国在该领域的研究和应用始于2 0 世纪9 0 年代，虽然相对起步较晚，但发展很快， 市场需求量逐年增加，功能性低聚糖的研究、开发和应用方兴未艾【4 】。虽然与日本和一 些西方国家相比国内的低聚糖生产起步较晚，但由于政府的扶持、业界和消费者对低聚 糖功能的普遍认可及研究队伍的迅速壮大，低聚糖产业的生产能力在短短几年内就达到 了五万多吨年，遗憾的是由于大部分开发商的趋利心理阻碍了低聚糖生产技术的改进和 产品质量的提高。目前国内投放市场的绝大多数功能性低聚糖产品均属于普通级低聚糖， 即产品干基中仅含有3 0 5 0 的功能性低聚糖成分，如国内市场上的异麦芽低聚糖、大 豆低聚糖、低聚果糖等产品中含有5 0 7 0 的葡萄糖、蔗糖和果糖等普通糖成分，它们 的生理功能并不明显，根本不适合糖尿病人和龋齿患者食用，而纯度达到9 0 以上的高 纯功能性低聚糖尚处于开发阶段，这与日、美、欧的生产状况相去甚远。为了满足国际 市场需求，刺激我国糖业的生产和消费，目前亟待利用科技手段开发出优质、新型的功 能性糖类，提高投入和产出比率。 1 2 2 在饲料工业的研究与应用 饲料添加剂是配合饲料的核心，也是促进畜牧养殖与饲料加工业发展的重要因素。 功能性低聚糖具有提高动物免疫力、减少仔猪腹泻、提高生产性能r 等功效，用量少， 无毒害，无残留，稳定性强。八十年代中后期，日本首先将功能性低聚糖开发为饲料添 硕士学位论文酶法生产魔芋葡甘低聚糖研究2 0 0 4 年6 月 加剂，但由于功能性低聚糖成本较高，目前只有低聚果糖及类似物被美国f d a 和日本厚 生省批准应用于饲料工业，相信随着低聚糖原料的拓展、加工技术的进步、生产成本的 降低，会有更多的低聚糖种类应用于该领域。 1 2 3 在医药领域的研究与应用 低聚糖不仅因其所具有的特殊生理功能在食品和饲料领域被广泛应用，而且可作为 多种药物的前体，在医药领域同样有良好的开发价值与应用前景。虽然有关这方面的研 究与技术还很不成熟，但受重视的程度正日益提高。目前已经开发成功或j 下在开发的低 聚糖类药物种类有【1 0 1 ：药物导向载体单克隆抗体的抗原；抗炎的低聚糖药物； 抗感染的低聚糖药物；防治胃溃疡药物：抗病毒药物；抗肿瘤药物；抗类风 湿性关节炎药物；器官移植用药物。 1 3 葡甘低聚糖的研究与应用 葡甘低聚糖是由葡萄糖和甘露糖组成的杂聚寡糖，最初从酵母的细胞壁中提取获得 【1 1 】，后来陆续在其它微生物和植物等不同材料中发现。不同来源的葡甘低聚糖其结构不 尽相同，这些结构上的差异对其功能产生了哪些影响? 尚待进一步研究揭示。魔芋植物 所含的葡甘聚糖是b d 葡萄糖与b d 甘露糖以l ：1 5 的比例、通过b 1 4 糖苷键联结形 成的杂多糖【1 2 】，控制魔芋葡甘聚糖非彻底降解可获得不同聚合度的魔芋葡甘低聚糖 ( k 0 坷a co l i g o s a c c h a r i d e ，k o s ) ，此种低聚糖兼具多种特殊生理功能，尤其是对双歧杆菌的 促生长作用更为突出【l ”。 1 3 1 葡甘低聚糖的功能 近年来的研究发现葡甘低聚糖除了具有功能性低聚糖的共同生理作用之外，还具有 清除自由基、增强机体抗氧化性的能力【1 4 1 。因其具有极其显著的降脂作用f 1 5 】，还可以作 为高血脂糖尿病的辅助治疗产品【16 j 。同时葡甘低聚糖能够减少肠内氨的生成和吸收，减 轻肝脏对血氨的解毒负担【1 7 1 。由于葡甘低聚糖是微生物细胞壁的主要组分，因此它还有 一个极具特色的生物学功能：吸附病原菌【3 】( 见表1 1 ) 。 表1 1 葡甘低聚糖截取病原菌的效果川 ：塑：! ：! ! 蛙曼兰熊壁垡墅蛐2 11 1 纽! 塑! ! 女! 盟韭塑! p e i ! ge ! 遵粤鐾彗! ! 鲤鲢! 磐! 三! 细菌属试验菌抹数截取菌株数截取率( ) g 魍曼盟焦地鱼曼璺蝗煎型盟坠坐坠笪鱼堕p i 盟g 随璺塑i 型n 些垒盟! 盟巳乜i 丝堂 大肠杆菌( 西幽e 曲妇c d 田 1 185 44 5 8 沙门氏肠炎杆菌 441 0 0 沙| j 氏伤寒杆菌( 砌p f 口卯蜘 646 6 7 沙f 氏鼠伤寒杆菌蛔o ”p j j 口坼卉砌 m ) 1 343 0 8 摩干氏变形菌 l ll l1 0 0 肺炎杆菌( 尸 p 1 0 6 删w ) 1 6 1 59 3 8 柠檬酸转化杆菌属( c 咖6 把r ) 3 63 61 0 0 锯杆菌属 1 21 21 0 0 产生单胞菌属 1 7 57 1 4 4 第一章功能性低聚糖研究概况 1 3 2 葡甘聚糖的结构与性质 魔芋葡甘低聚糖由魔芋葡甘聚糖降解制备，而葡甘聚糖是魔芋块茎中含有的重要多 糖成分。魔芋( 爿脚d 伊 d p 矗d 雎螂k o n j a c ) ，又名蔺翦，是一种生长在海拔2 5 0 2 5 0 0 米的 山间多年生草本植物，可分为葡甘聚糖型和淀粉型两大类，葡甘聚糖型魔芋的球形变态 茎中葡甘聚糖的含量占其干物质质量的4 5 6 5 左右。我国现栽培的主要是花魔芋和云 南白魔芋两个品种，云南白魔芋葡甘聚糖含量高但产量较低，栽培面积较小，在全国大 部分地区栽培的花魔芋产量高，葡甘聚糖含量则比云南白魔芋低。中国是世界上盛产魔 芋的国家之一，魔芋的主要种植区分布在四川、云南、贵州、广西、湖南西南部和湖北 西部等广大低山至二高山地区。上世纪八十年代以来，政府开始加大对魔芋种植业的扶 持力度，建成了许多初具规模的魔芋种植基地，魔芋加工业也如雨后春笋般涌现，同时 还成立了若干个研究性的学术团体，在理论上和实践上引导魔芋产业健康的发展，因此 我国在葡甘低聚糖的研究与开发方面具有资源上的相对优势及技术上的强大后盾。 1 3 2 1 魔芋葡甘聚糖的结构 魔芋葡甘聚糖( k o n j a c 目u c 0 咖咖釉，k g m ) 是仁- d 一葡萄糖与陋- 甘露糖按2 ：3 或 l ：1 6 的摩尔比通过弘l ，4 糖苷键结合的复合多糖，在主链上的甘露糖基c 3 位上，存在 着利用b 1 ，3 键连接的支链，不过支链度较低，且长度较短【1 8 1 。 n g 1 一lt h e m o i 神u h rs t 瑚c t u mo fk g m 1 3 2 2 葡甘聚糖的理化性质 纯魔芋葡甘聚糖为白色粉来状固体，是一种非离子型水溶性高分子多糖，具有极强 的吸水能力，溶于水中便形成高粘度的溶液，是目前已知的分子量最大、粘度最高的膳 食纤维【1 9 l ，不溶于丙酮、氯仿等有机溶剂。此外，魔芋葡甘聚糖还具有凝胶性、抗菌性、 可食性、低热值等多种特性。 魔芋葡甘聚糖的比旋度【】d 2 6 = 2 7 5 。( c = 1 2 7 m 咖lh 2 0 ) ，红外光谱在4 0 0 0 4 0 0 c m 。1 区间扫描时具有多糖的特征吸收，在8 1 0c m o 和8 7 0c m d 处有吸光值说明其中含有 甘露糖，8 1 9c m - 1 处有吸光值说明糖苷键的连接方式主要为b 一键口0 1 。 硕士学位论文酶法生产魔芋葡甘低聚糖研究2 0 0 4 年6 月 i 3 3 葡甘低聚糖的制备 国内外对葡甘低聚糖的研究主要还停留在实验室阶段，只有少量葡甘低聚糖出现在 国外市场上，国内基本无此类商品。目前实验室及生产中获得葡甘低聚糖的方法主要有 p j ：从天然原料中提取：利用转移酶、水解酶催化的糖基转移反应合成；天然多 糖的酶水解；天然多糖的酸水解；人工化学合成。 由于天然原料中低聚糖含量极低，而且提取工艺较为繁琐，收率很低，所以从天然 原料中提取得不偿失；酸水解法生产低聚糖的过程具有不稳定性，产物中寡糖的种类非 常复杂，副产物多，不易得到特定的低聚糖，产品纯度也较低：而化学合成方法复杂， 副反应多，成本太高，还仅限于对低聚糖功能的研究工作中使用，离工业化生产距离较 远。与以上方法比较，酶法生产转化率高，通过对产葡甘聚糖酶微生物的筛选、育种， 适宜规模化生产，利用发酵技术控制微生物的代谢还可以一定程度的减少副产物的生成， 简化提取工艺，因此工业上主要还是采用酶转移法或酶水解法来生产低聚糖。 酶在动、植物和微生物细胞中普遍存在，具有极佳的催化活性，可显著提高反应速 度1 1 0 6 l 1 0 2 0 倍【2 ”。最初，人们从动、植物组织中提取酶，自1 8 9 4 年日本高峰利 用米曲霉制备高峰淀粉酶( t 酞e d i a - s t 嬲e ) 以来，利用发酵法生产并提取微生物产生的各 种酶已是当今发酵工业的重要组成部分】。与动、植物来源的酶相比，微生物酶既易于 进行大规模生产，又便于改进工艺，提高产量。 国外对葡甘聚糖酶的研究与开发最积极也最有成效的要首推日本，不过目前大部分 的研究报道是关于葡甘聚糖酶的类似酶甘露聚糖酶( m u r 船嬲e ) ，对葡甘聚糖酶的 报道相对较少。尽管两种酶的作用位点不同，但都可以将魔芋葡甘聚糖降解为低聚糖， 因此甘露聚糖酶的研究在理论上可以为葡甘聚糖酶的研究提供参考。1 9 8 2 年，t j a 。f a k i 和 m 黜t 蛐i k 甜。等从嗜水气单胞菌印f 2 5 中获得一种甘露聚糖酶，酶蛋白的平均分子量 为6 4k u ，p 15 9 ，最适作用p h6 o ，作用温度在4 5 以下田】：1 9 9 7 年，ym a t s u u r a 等发 现人体消化道内的厌氧菌可以产生水解魔芋葡甘聚糖的酶【2 4 1 ，并从人体中将产酶菌分离 出来对酶进行了研究，结果表明该酶是一种由单肽链构成的蛋白，分子量大约为5 0 5 3 k u ，最适作用p h7 8 【2 5 】；1 9 9 8 年，nk a t a o k a 和y t o j ( i w a 等从土壤中分离出的梭状芽 孢杆菌l t _ 5 a 可以产生活性较高的甘露聚糖酶【2 6 j ；2 0 0 2 年，n o r t hc a m l i n as t a t e u i l i v e r s i t y 也曾在研究中发现一种非专一性内切酶，可作用于葡聚糖，也可水解甘露聚糖 。 近年来国内对水解葡甘聚糖的酶的研究正不断升温，形成了科研单位与企业联手， 科技为生产领路的局面，共同促进魔芋产业的发展。其中中国科学院微生物研究所从枯 草芽孢杆菌b m 9 6 0 2 中提取出了一种中性的甘露聚糖酶，平均分子量为3 5k u ，p i 4 5 ， 6 第一章功能性低聚糖研究概况 最适p h5 8 ，最适作用温度为5 0 1 2 8 】；中科院成都生物研究所香红星等从土壤中分离筛 选得到的舶c 川螂妒m 5 0 高产菌株产生的甘露聚糖酶是一种液化型内切酶，酶解最适温度 为4 0 ，作用p h5 0 7 0 1 3 】；中南林学院邓立宏等利用黑曲霉发酵降解魔芋精粉制备葡 甘低聚糖1 2 0 】，但酶活性相比同类产品明显较低；华南理工大学的祁黎和李光吉等对一种 b 甘露聚糖酶进行了研究，发现该酶在5 0 左右，p h9 4 附近，乙醇含量低于5 的水 介质中具有较高的活力，而在p h7 0 以下，或温度低于3 0 ，或加入2 0 乙醇的条件下 均基本上失活，在此研究基面上还探讨了8 一甘露聚糖酶催化k g m 降解反应的规律，通 过调节反应条件制备了一系列分子量不同的降解样品，并确定工k g m 的分子量与特性粘 度之间的关系，使酶催化k g m 的可控降解成为可能，从而为深入研究k g m 及其衍生物 的结构与性能，扩展其应用领域奠定了良好的理论和实验基础；湖北工学院生物工程系 的李庆国、干信、邹群等通过甘露聚糖酶水解魔芋精粉得到葡甘低聚糖，酶解的最适作 用条件为p h 4 6 ，温度4 5 ，时间2 h ，酶用量为每l o g 精粉5 0 0 u ：华中农业大学的张 庆迎等利用纤维素酶制备葡甘低聚糖，酶作用条件为4 0 ，p h 5 【2 9 】。 综上可见，酶法生产低聚糖产品是目前产业化的趋势，获得高活性酶制剂也是研究 工作重点攻克的难题之一。 1 4 葡甘低聚糖产业的现状及发展前景 1 4 1 产业发展前景 从功能性低聚糖产业的总体来看，去年国外低聚糖的年销售额近5 亿美元，其中仅 日本的低聚糖年产量就接近4 万吨，销售额近1 8 亿美元，而利用低聚糖为原料开发的终 端产品市场销售额则高达数百亿美元。在美国，a l k c h 公司采用化学合成法生产的低聚 糖产品市场售价为每克9 8 美元，经济效益是相当可观的。 葡甘低聚糖是近年来世界上一些发达国家研究的诸多功能性低聚糖中十分重要的一 种，除了可作为保健食品或饲料添加剂等的原料外，在医疗保健领域也有着广阔的需求 空间，到2 0 0 0 年仅在美国就有3 7 亿美元的低聚糖药物市场，具有特殊功能的葡甘低聚 糖及其衍生物对于动物营养和生产性能的促进作用从某些方面来说不亚于抗生素，而且 为绿色产品，有望成为抗生素的替代产品，可见葡甘低聚糖产品具有良好的发展前景和 巨大的市场潜力。 近年来，由于我国消费者通过各种渠道逐渐认识了功能性低聚糖的特殊作用，使得 低聚糖产品的消费有所增长，同时功能性低聚糖应用领域的不断拓展无疑为打开低聚糖 市场推波助澜。 下游产业的发展离不开上游技术的支持。我国作为葡甘低聚糖原料魔芋的主产地， 硕士学位论文酶法生产魔芋葡甘低聚糖研究2 0 0 4 年6 月 7 在资源方面具有很大优势，四川、云南、贵州、湖北西部等自然条件适宜、种植基础好 的地区建立了不少魔芋种植基地或魔芋工业科技园，初步形成了规模化生产，而且魔芋 协会等多家学术研究团体致力于发展魔芋事业，为魔芋资源的开发和生产出谋划策，不 仅提高了农产品的科技含量，也满足并优化了葡甘低聚糖产业的原料需求。 表1 2 近年来国内寡糖市场规模和未来预测i l ” t h b 1 - 2t h ed o m e s 6 c o i i g o s a c c h a r i d e sm a r k e t s c a l ei r e ty e a na n df o r e c a s t o l 产量，万吨 y i e i d a e t l m o u s d t o n 1 1 21 4 31 8 4 销售额，亿元 s a l e ss c 鲥e ，h u d r c d m i l l i o n 3 8 64 8 56 4 2 2 8 2 2 9 3 2 3 3 6 2 5 6 4 2 2 1 尽管我国低聚糖产业在十多年的发展中还存在很多不足，如缺乏对低聚糖功能的认 识与深度开发；应用面窄；生产工艺、水平和设备远远落后于日本等；生产厂家多，但 规模普遍偏小，研发能力偏弱；总体科研力量尚显薄弱分散删等。但是在我国正式加入 世界贸易组织( w t d ) 后，低聚糖产业不可避免的进入国际化竞争，在政府的引导下和 日益激烈的市场竞争中，我国低聚糖这一“朝阳”产业势必取得长足发展。 1 4 2 产业现状 葡甘聚糖来源丰富，自然界中分布广泛，价格便宜并适于综合开发与利用，为葡甘 低聚糖生产提供了充足的原料和低价的成本，同时有利于低聚糖生产厂家的扩大再发展。 目前生产中常用甘露聚糖酶来水解魔芋精粉，图1 2 是酶法生产低聚糖的一般程序。 b 一甘露聚糖酶一 i i 一酶解一_ 过滤_ 脱色、脱盐 浓缩 i 魔葶精粉一1 叫陲茵叫产品 图1 2 酶法生产葡甘低聚糖的方法 f 吨1 2t h ep m c e 鲒o f p d q c i n g k o s b 了e n 碍m e 酶法生产中所使用的高活性酶是决定葡甘低聚糖能否开发成功的关键因素之一。国 内有一些科研院所正在积极开展对高活性葡甘聚糖酶的筛选和研究工作，还有不少单位 在进行甘露聚糖酶的开发，鉴于两种酶有相似性，所以甘露聚糖酶的研究成果可以作为 黧| i 瑚向 麓 瑚删 瓣 哟| 吾 瑚年瑚年哟年 嗍州 鬻 第一章功能性低聚糖研究概况 葡甘聚糖酶研究工作的理论指导。 南开大学杨文博等探索了利用b 甘露聚糖酶水解植物胶生产甘露寡糖的条件，这项 研究为工业酶法生产葡甘低聚糖提供了基本的工艺参数1 3 0 1 ；无锡轻工大学金丰秋和