（植物学专业论文）中国明对虾双功能分子β13葡聚糖结合蛋白脂蛋白的研究.pdf

摘要 摘要 本文首次研究了中国明对虾p g b p h d l 基因的相关内容，对理解p g b p h d l 的发生、作用和调控机制，提高营养利用率，研究对虾病害防治有重要的 理论意义。 通过同源克隆方法，成功的克隆出中国明对虾1 3 g b p h d l 部分e d n a 序列， 发现与凡纳滨对虾的p g b p h d le d n a 序列有高达9 3 的同源性。 运用r t - p c r 方法对中国明对虾p g b p h d l 的组织表达和发育阶段的表达 情况进行了研究，结果表明：中国明对虾的p g b p h d l 在肝胰腺、血细胞和肠 中表达，且在肝胰腺中的合成量最高；此种蛋白在中国明对虾的整个发育时期 都有表达，证实中国明对虾p g b p h d l 基因为组成型。 利用半定量r t p c r 法对中国明对虾p g b p h d l 的营养相关作用进行了研 究，发现在饲喂后2 h ，此蛋白基因表达量达到最高，2 4 h 达到最低，4 8 h 、7 2 h 、 1 2 0 h 都有小幅度增加，并且，高脂饲料饲喂组p g b p h d l 相对表达量比对照组 稍高，验证了中国明对虾p g b p h d l 参与对虾体内脂质运输。 利用荧光定量p c r 研究了白斑病毒刺激后中国明对虾p g b p h d l 表达差 异，结果发现，刺激后蛋白相对表达量升高，6 h 时达到最高( p 矿 g b l a y 2 4 9 8 5 8 11l i t o p e n a e u sv a n n a m e ih i g hd e n s i t y l i p o p r o t e i n 1 ，3 - b e t a d - g l u c a n b i n d i n g p r o t e i np r e c u r s o r ，m r n a ，c o m p l e t ec d s l e n g t h = 6 3 7 9 s c o r e = 5 7 9b i t s ( 31 3 ) ，e x p e c t = 4 e - 1 6 2 i d e n t i t i e s = 3 6 8 3 9 5 ( 9 3 ) ，g a p s = 2 3 9 5 ( o ) s t r a n d = p l u s p l u s 0 u e r y i s b j c t2 4 4 2 q u e r y6 1 s b j c t2 5 0 2 q u e r y1 2 1 s b j c t 2 5 6 2 q u e r y1 8 0 s b j c t2 6 2 1 c t t t a g c c a t c c a 从c c g 从a a t c t a t c t c a r g t t g c c a a g 丌i g g t c g c t c a c 从t c6 0 l i li | i i i | f | if | | i i i c t t t a g c c a t c c a m c c g a 、a a t c t a t c t c a g c t g t t g c c 从g t t t g g t c g c t c a g 从t c2 5 0 1 c t t c a t t a a t g c c a a g t g g a a c c g 从g t g a t g g t t l a a a c c c t t g a a g g a a a a a t a g a1 2 0 li i ii ll i i | i | | l c t t c a t c 从t g c t a a g t g g 从c c g 从g t g a t g g t t t t g a t a c t c t t g 从g g a a a t a t a g a2 5 61 a g c c a a g t c g a g a t t c c t t g g a g a t a t t t t t a - t c a a c g t c a g g t a c g a c a t g t c c 从t a 17 9 l i | l i | i l i | | i i g g c c 从g t c t a g a t t c c l v r g g a g a t t t t c t 从t c 从c g t c a g g t a c g a c a t g t c c a a t a2 6 2 0 t t g c a a t g i 明c a t g c t g 从g t t g a c t a t t c 咐a a c g a c g a t g g a t ( 焉t g a t a a a a a a g 2 3 9 | | li i ii t t g c a g a t g c t c a t g c t g a a g t t g a t t a t t t a a g a a c g a c a a c a g a t g g t g a t a a g a a g g 2 6 8 0 第2 章中国明对虾p g b p h d l 部分c d n a 序列的克隆和进化分析 q u e r y2 4 0 s b j c t2 6 8 1 q u e r y 3 0 0 s b j c t 2 7 4 1 q u e r y3 6 0 s b j e t2 8 0 1 h a t t c a a a c t a 从c t g g a c t a g g a 从t c t a c t g a t g a c c a t c t t g a a a a t g a 从t g a t c t2 9 9 ii | | | | i a a t t t a a g c t a a a c t g g a c t a g g a 从t c c a c t g a t g a c c a t c t t g a a a a t g a 从t g g t c t2 7 4 0 t t g a c t c c 从c t t t g a g a c c c t g t c a c a t g c a c g t g c a t a t g c c a a t g c t g a g t a t g g t a3 5 9 ! l l ：1 | t t g a c t c c a a c t t t g a g a c c c t g t c a c a t g c c c g t g c a t a t g c c , 姐t g c t g a c t a t g g t g2 8 0 0 g c a a t t t c 舢姐t t g t t a t c t g g g t t g g a t t g g g a t3 9 4 | | i g c a t t t t c a a a t t g t t a t c t g g g t t g g a t t g g g a t2 8 3 5 第3 章中国明对虾1 3 g a p h d l 基冈表达特征的初步研究 第3 章 中国明对虾p g b p h d l 基因表达特征的初步研究 甲壳动物的b 1 ，3 葡聚糖结合蛋白基因表达位点近年来也成为研究的重点。 目前报道的多种甲壳动物d 1 ，3 葡聚糖结合蛋白基因在血细胞和肝胰腺表达，也 有报道只肝胰腺或血细胞表达，某些等足类b 1 ，3 葡聚糖结合蛋白基因在脂肪体 表达。但是血细胞和肝胰腺各自所起的作用，以及p l ，3 葡聚糖结合蛋白合成的 模式还有待深入研究。 脂类是虾蟹类的重要营养物质，由于其不溶于水的特性，有特殊的载体对 于它们运输到其它组织中是非常必要的。1 3 g b p h d l 作为一种高密度脂蛋白， 它在体内脂质运输中起重要作用。而且1 3 g b p h d l 还是一种重要的免疫识别蛋 白，在免疫应答中起重要作用。中国明对虾d g b p h d l 在哪几种组织中表达以 及从对虾哪个发育阶段开始表达，至今未有报道。因此，研究其表达部位以及 表达的发育阶段，对于研究其作用路线以及作用机制是非常重要的。 本实验提取中国明对虾成熟虾各组织( 包括肝胰腺、血细胞、鳃、肠、心、 肌肉等) 以及发育各阶段( 包括无节幼体、蚤状幼体、糠虾、仔虾、幼虾、成 虾) 肝胰腺总r n a ，r t p c r 扩增b g b p h d lc d n a 的一个片段检钡j j t g b p h d l 基因在各组织和各发育阶段的表达。 3 1 材料和方法 3 1 1 材料与试剂 实验用成熟中国明对虾于2 0 0 7 年8 月购于山东省青岛市小港水产品市场。解 剖肝胰腺、肌肉、鳃、肠、心脏等组织，分装后迅速投入液氮，转到7 0 c 保存 备用。用2 5 m l 注射器从对虾第一腹节基部腹血窦取虾血，4 c ，8 0 0 9 离- i 二, 1 0 m i n ， 血细胞用r n ag u a r d 保存，后转到7 0 。c 保存备用。2 0 0 8 年3 月开始从海阳对虾养 殖场采样( 包括无节幼体、蚤状幼体、糠虾、仔虾、幼虾、成虾) ，幼虾之前用 r n ag u a r d 保存整个虾体，之后保存肝胰腺组织，转到7 0 保存备用。 抗凝剂配方： n a c l k c l 4 5 0 r n m o l 1 0m m o l 第3 章中国明对虾i b g b p h d l 基冈表达特征的初步研究 e d t a - n a 2 ( 乙二胺四乙酸二钠) 1 0m m o l h e p e ( 4 羟乙基哌嗪丙磺酸) 10m m o l 用d e p c 水配置，p h 值调至7 4 。 其它试剂同表2 1 3 1 2 方法 3 1 2 1 引物设计 目的基因引物同2 1 2 1 。此外根据g e n b a n k 登录的对虾d a c t i nc d n a 序列 ( a f 3 0 0 7 0 5 1 ) 设计一对引物a c t i n f ( 5 a g t a g c c g c c c t g g t t g t a g a c 3 ) 和 a c t i n r ( 5 t t c t c c a t g t c g t c c c a g t 3 。) ，扩增内标基因d - a c t i n 片段，大d x 2 4 0 b p 。 3 1 2 2 各组织及不同发育阶段肝胰腺总r n a 的提取 用u n i z o l r e a g e n t 试剂分别提取成熟虾肝胰腺、肌肉、鳃、肠、心脏、血 细胞等组织总r n a ，方法同2 1 2 2 。用同样方法提取中国明对虾发育各阶段( 无 节幼体、蚤状幼体、糠虾、仔虾、幼虾、成虾) 总r n a ，幼虾和成虾提取肝胰腺 总i a ，其它阶段直接提取整只虾的总r n a 。 1 琼脂糖凝胶电泳检测r n a 的完整性。 3 1 2 3i 玎p c r 以各组织各发育阶段总r n a 为模板，反转录得到各组织的第一链c d n a 。反 转录体系及条件同2 1 2 3 。p c r 反应体系2 5 i t l ： 超纯水15 ，7 5 1 , t l c d n a l g l 1 0 b u f f e r 2 5 9 l m g c l 2 ( 2 5 m m ) 1 5 9 l d n t p ( 2 5 m m )2 9 l t a qd n a 聚合酶( 2 5 u g l ) 0 2 5 9 l i b g b p f ( 1 0 m m ) l “l 3 g b p r ( i o m m )1 l 或a c t i n f ( 10mm)l1 t l actinr(10mm)lgl p c r 反应条件同2 1 2 3 塑! 童主堕竖翌墅匹! ! ：! 旦! 墨塑鲞垄堑笙塑塑堂竺墨 1o 琼脂糖凝胶电泳检测p c r 结果。 3 2 结果 3 2 1p g b p - h d l 基因的组织表达 从成熟虾的各组织( 肝胰腺、肌肉、鳃、肠、心脏、血细胞) 分别提取了总 r n a ，琼脂糖凝胶电泳证实r n a 完整性较高，可以作为反转录的模板。 以各组织c d n a 为模板进行p c r 反应。10 琼脂糖凝胶电泳显示各组织均 扩增2 4 0 b p 左右的d n a 片段，亮度基本相同，与预期的内标基 郡- a c t i n 片段大小 一致。在肝胰腺、血细胞和肠中还扩增得到1 条3 9 4 b p 左右的亮带( 图31 ) ，其它 组织部没有这条带，其大小和第一章扩增的b g b p h d le d n a 片段一致。这说明 中国明对虾的b g b p h d l m r n a 在成熟虾的肝胰腺、血细胞和肠中都有表达而 在其它组织( 肌肉、鳃、心脏等) 不表达，肝胰腺、血细胞和肠都是b g b p h d l 的表达位点。 图31b g b p h d l 组织表选琼脂糖l u 泳囤 f i g u r e3l t h ce l e c t r o p h o r e t i cr c s u h so f r t - p c ro f t h ed o b 卜h d ls e g m e n ta n d t h e b - a c t i n s e g m e n t f r o m t h es h r i m p t i s s u e st o t a l r n a i - 6 和a f 分别为b g b p - h d l 和l l - a c t i n 在中国明对虾肝胰腺、血细胞、心脏、鳃、肌 肉、肠中的表达。 m 为分子质量标准( d l 2 0 0 0 ) 。i 3 g b p - h d l 和, b 吨c t i n 片段大小分别为3 9 4 b p 、2 4 0 b p 。 t h e r ea r et h eh e p a t o p a n c r e a _ b l o o dc o 巾u w l e ，h e a r t ，g i l l ，m u s c l ea n di n t e s t i n eo f t h es h r i m p i nr u m f r o mit 0 6a n d a t o r mi st h em a r k e r ( d l 2 0 0 0 ) 芦g b p - h d la n db - a c t i ns e g m e n ti sa b o u t3 9 4 b pa n d2 4 0 b p r e s p e c t i v e l y 第3 章中固明对虾b g b p h d l 基冈表达特征的扔步研究 3 2 2 不同发育阶段 i g b p - h d l 基因的表选 从中国明对虾不同发育阶段( 无节幼体、蚤状幼体、糠虾、仔虾、幼虾、成 虾) 分别提取了总r n a ，琼脂糖凝胶电泳证实r n a 完整性较高，可以作为反转 录的模扳。 以不同发育阶段c d n a 为模板进行p c r 反应。1 o 琼脂楮凝胶电泳显示， 发育各阶段均扩增到2 4 0 b p 和3 9 4 b p 左右的d n a 片段f 图3 2 l ，亮度基本相同， 预期的内标基因b a c t i n 和8 g b p h d l 片段大小一致。这说明中国明对虾 b g b p h d lm r n a 从无节幼体开始就有表达。一直持续表达到成虾时期。 国3 2 不同发育阶段b o b p o h d l 表达琼脂糖电泳结果 f i g u r e3 2 t h ee l e c t r o p h o r e t i cr e s u l t s o f r t _ p c ro f t h e 8 g b 卜h d ls e g m e n t a n d t h eb - a c t i n s e g m e n t f r o mh e p a t o p a n c r e a s 。t o t a l r n ao f d i f f e r e n ts t a g e s m 是分子质量标准( d 2 0 0 0 ) ，h i j 6 分别为无节幼体、蚤状幼体、糠虾、仔虾、幼虾和 成虾，1 3 0 b p h d l 和 l a c t i n 片段分别为3 蛳p 和2 4 0 b p 。 t h e r ea l e t h e n ，z ，m ，rj ，a i n t u m f r o m l t 0 6m i s t h e m a r k e r ( d l 2 0 0 0 ) b g b p h d l a n db t 孔t ms e g m e n t i sa b o u t3 9 4 b da n d2 4 0 b pr e s p e c t i v e l y 3 3 讨论 用r t p c r 研究基因的表达，其操作简便时间短，所需要的样品量少。本 实验以中国明对虾b g b p - h d l 特异引物p g b p f ( c t t t a g c c a t c c a a a c c g ) 和1 3 g b p r ( a 1 c c a a l c m c c c a g a ) 分别作为正向和反向引物以中国明 对虾不同组织c d n a 为模板，b a c l i n 作为内标用r t - p c r 方法研究了中国明对虾 不同组织的b g b p h d l 表达情况。结果显示，在所检测的中国明对虾的各个组织 r 肝胰腺、血细胞、心脏、鳃、肌肉、肠) 中，只有肝胰腺、血细胞和肠中有表 达，且在肝胰腺中表达丰度最高，说明肝胰腺、血细胞和肠是中国明对虾 第3 章中国明对虾1 3 g b p h d l 基因表达特征的初步研究 p g b p h d l 的表达部位。本实验首次检测到肠是i b g b p h d l 的表达部位，这可能 与其参与脂类运输作用有关。 关于甲壳动物b 1 ，3 葡聚糖结合蛋白基因表达部位的研究已有不少报道， y e p i z p l a s c e n c i a 3 8 】用抗h d l 和1 3 g b p 的抗体及r n a 反转录法均在凡纳滨对虾肝 胰腺中检测至i j l 3 g b p h d l 的存在。后来在不同虾中陆续检测到p g b p 的表达部位 还包括：血细胞、鳃、肌肉和附肢。利用原位杂交技术进一步检测，发现肝胰 腺f 细胞是p g b p h d l 的主要表达位点，在神经中枢细胞有微量表达，而在皮层 神经胶质和轴突纤维中无表达1 39 1 。有的研究者认为b g b p 在血细胞中的表达量最 丰富，而有的学者却认为肝胰腺才是b g b p 最主要的表达部位。不同研究者得到 的结果不同，这种差异可能与种群不同或动物所处阶段不同有关，当然也可能 与动物完整性以及是否有内源性诱导有关，如三碘甲状腺原氨酸可促进大鼠肝 脏高密度脂蛋白的载脂蛋白m r n a 合成，s t e a l 等1 4 0 j 的研究表明，糖皮质激素可 升高大鼠肝脏高密度脂蛋白的载脂蛋白m r n a 。d g b p 的表达量也有可能受动物 体内外一些因素的调控，调控因素及具体的作用机制有待于我们进一步的研究。 本实验还运用r t p c r 法首次研究了1 3 g b p h d l 在中国明对虾不同发育阶段 ( 无节幼体、蚤状幼体、糠虾、仔虾、幼虾和成虾) 的表达情况，结果显示，在 所检测的中国明对虾不同发育时期b g b p h d l 均有表达，说明p g b p h d l 是甲壳 动物免疫及营养体系中一个非常重要且必需的组成成分，在各个发育时期扮演 着帮助机体抵御外来为生物入侵和运输脂类的角色。同时进一步证实中国明对 虾d g b p h d l 基因为组成性表达。 2 7 第4 章饥饿及食物组成对中国明对虾p g b p h d l 基冈表达的影响 第4 章饥饿及食物组成对中国明对虾l i g b p h d l 基因表 达的影响 早期，p 1 ，3 葡聚糖结合蛋白作为一种免疫应答蛋白被研究者重视，其免疫 应答的机制和具体作用已经被详细的研究过。近来，当研究者发现d 1 ，3 葡聚糖 结合蛋白也是一种高密度脂蛋白时，其在营养物质运输中的作用被充分关注。 目前，在脊椎动物和昆虫中已有关于血清中高密度脂蛋白含量和脂类含量 相互关系的报道，结果说明高密度脂蛋白能够结合脂质，参与脂类运输。m a d a e 2 4 】 等用半定量r t p c r 法对饲喂后不同时间段以及饲喂不同脂肪含量饲料的凡纳 滨对虾p g b p h d l 表达量进行了研究，结果显示，饥饿抑制1 3 g b p h d l 的表达， 饲料组成不同对其表达无显著影响，具体的作用机制还不清楚。 本实验运用半定量r t p c r 法对饲喂后不同时间段以及摄食不同脂类含量 饲料的中国明对虾体内i s g b p h d l 表达量进行了测定，较全面的研究了饥饿条 件以及脂类含量对i s g b p h d l 表达的影响，进而验证其在脂类运输中的作用。 4 1 材料与方法 4 1 1 材料与试剂 成熟中国明对虾于2 0 0 8 年6 月购于山东省青岛市小港水产品市场，暂养于水 族楼1 0 吨通气海水池中，每天上午换水一次，投喂普通配合饲料一周后进行饥 饿刺激，最后一次喂食后，分别在2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、1 2 0 h 取样，每个时间段 取6 只，解剖肝胰腺，分装后迅速投入液氮，转到7 0 保存备用。 成熟中国明对虾于2 0 0 8 年7 月购于山东省即墨市对虾养殖场，养于水族楼1 0 吨通气海水池中，每天上午换水一次，投喂普通配合饲料。一周后，随机分为 两组：一组投喂高脂饲料；一组继续投喂普通饲料，作为对照组。三周后，在 最后一次投喂2 h 后取样，每组取6 只，解剖肝胰腺，分装后迅速投入液氮，转到 7 0 。c 保存备用。 试剂同表2 1 。 普通饲料配方见表4 1 ，脂类总含量约为2 。 高脂饲料配方：l k g 普通饲料中加入3 5 7 1 5 9 鱼油，鱼油终含量约为3 0 0 。 2 8 第4 章饥饿及食物组成对中国明对虾b g b p h d l 基因表达的影响 总脂肪含量约为4 5 。 表4 1 普通饲料配方 t a b l e4 1c o m p o s i t i o no fc o m m e r c i a ls h r i m pf e e d s 4 1 2 方法 4 1 2 1 引物设计 引物同3 2 2 1 4 1 2 2 肝胰腺总r n a 的提取 用u n i z o l r e a g e m 试剂分别提取饲喂后不同时间段以及饲喂不同饲料的中 国明对虾肝胰腺总r n a ，方法同2 1 2 2 。 4 1 2 3 半定量r t p c r 条件的优化d 1 4 6 】 ( 1 ) b g b p h d l 、1 3 - a c t i n 基因异管扩增指数期循环数的确定 p c r 循环参数为9 4 ，2 r a i n ；9 4 ，3 0 s ；5 5 ，4 5 s ；7 2 ，4 5 s ；7 2 ，1 0 m i n 。分别在2 22 42 62 8 3 03 23 43 6 循环时取出一管p c r 产 物。将产物进行1 琼脂糖凝胶电泳，电泳结束于凝胶成像系统分析条带的相对 浓度值。 ( 2 ) p g b p h d l 、1 3 - a c t i n 基因异管扩增退火温度的确定 退火温度设立5 2 、5 3 、5 4 、5 5 、5 6 、5 7 6 个梯度，其余条 2 9 第4 章饥饿及食物组成对中国明对虾e g bp i h d l 基田表达的影响 件不变。将产物进行1 琼脂糖凝胶电泳，电泳结束于凝胶成像系统分析条带的 相对浓度值。 ( 3 ) d g b p h d l 、p - a c t i n 基因异管扩增m g “浓度的确定 m g “浓度分别设为12 5 、l5 0 、l7 5 、20 0 、22 5 、25 0 、27 5 、30 0 m m o l l 其余反应体系同2232 的( 2 ) ，超纯水的母相对于m 9 2 。的互进行调整，0 体积 2 5 , u l 。然后按照( i ) 确；t 的循环数，( 2 ) 确定的堪火温度进 ? p c r 。将产物进 行1 琼脂糖；射拄电泳，电泳结束十凝胶成像系统分析条带的相对浓度值。 41 2 4 半定量r t p c r 紫外法检测r n a 含量及纯度，并计算r n a 浓度，将提取的。营, r n a 定量， r n a 浓度= o d 2 6 0 稀释度2 5 ( u g u 1 ) ，使每管反应的模板为30 “g 。r t 合成 c d n a 第一链。反转录的体系和条件同2l23 。p c r 反应条件除循环数、m 9 2 + 浓度、退火温度为4i2 3 确定的外，其它条件及反应体系同2l23 。 412 5p c r 产物电泳和分析 p c r 产物进行1 琼脂糖凝胶电泳后，用g e l d o c 凝胶成像系统成像，并用图 像分析处理系统q u a n t i t yo n e 对电泳结果进行分析。数据用s p s s l 00 软件统计处 理。 4 2 结果 4 2 1 肝胰腺总r n a 的提取 由豳4i 可见，从对虾肝胰腺提取的r n a 在电泳中可见清晰的2 8 s 、1 8 s 和5 s 三条带表明r n a 完整性较好。经紫外检测，所有样品的o d 2 ，o d 2 均在 18 ，2 1 之h j 表明r n a 样品纯度较好达到了后续实骑的需要。 2 8 s r r n a 】8s r r n a 5s r r n a 图41 肝胰腺总r n 琼脂塘屯泳图 f i g u r e 4 1t h ee l e c t r o p h o r e t i cr e s u l t s o fs h r i m ph e p a t o p a n c r e a s t o t a l r n a 3 0 第4 章饥饿及食物纽成对中国明对虾b g b p h d l 基田表达的影响 4 2 2 半定量r t - p c r 优化后的条件 ( 1 ) 3 g b p - h d l 、0 - a c t i n 基因异管扩增指数期循环数的摸索 电泳结果和各条带相对光密度值分析结果如图42 、43 所示，当p c r 进行 到2 0 个循环时二者都还没有显示条带，但2 2 个循月= 以后开始出现梯度变化。 b a c t i n 基因的p c r 扩增指数期在3 2 个循环时均已经完成。为了保证实验样本在 指数期内测定，选择3 1 个循环为本实验检测b g b p - h d l 时p c r 扩增的循环数。 酗4 2 不同循环数r b p - h d l 和辟a c t i np c r 产物屯泳结果 f i g u r e 4 2 t h ee l e c t r o p h o r e t i cr e s u l t s o f t h e l 3 g b p - h d ls e g m e n ta n d t h e p - a c t i ns e g l t t e f l o f d i f f e m n l p c rc y e l e s 1 和9 - 1 6 分别为b - a c l i n 和b o b p h d l 基因分别在3 6 、3 4 、3 2 、3 0 、2 8 、2 6 ，2 4 、2 2 个循环时的p c r 产物电泳结果。 m 为分子量标准( i ) 2 0 0 0 ) ，分子量从犬到小依次为5 0 0 0 b p 、3 0 0 0 b p ，2 0 0 0 b p 、1 0 0 0 b p 、 7 5 0 b p 、5 0 0 b o 、2 5 0 b p 、1 0 0 b p t h e r ea me l e e t r o p h o r e t i cr e s u l t so f b g b p - h d ls e g m e n ta n d 争a c t i ns e g m e n ti nl u r nf r o ml t o8a n d9 t o l 6 0 f 3 6 、3 4 、3 2 ，3 0 、2 8 、2 6 、2 4 、2 2c y c l e sr e s p e c t i v e l y m i s t h e m a r k e r ( d l 2 0 0 0 ) t h es e g m e n t i s5 0 0 0 b p 、3 0 0 0 b p 、2 0 0 0 b p 、 0 0 0 b p 、7 5 0 b p 、 5 0 0 b p 、2 5 0 b p 、】0 0 b d i nr u m f r o mb i g t os m a l l 图4 3 不同循环数fb o b p - h d l 和l k a c t l np c r 产物的相对浓度 “g u 刚3 r e 。“0 n c e m 眦”n s d 。i 麓r 。e n 阳t p b p c r 。h c y d l c l e 辩sg m c m a n d “。脚m 哪c n 讹 3 】 姗珊 瑚蜘 。；hv*i；ste2 苎! 兰塑壁堡堡塑塑些翌! 堕堕盟堑唑! ! ：! 旦! 墨堕查堕盟墅堕 m 21 3 g b p h d l 、1 3 - a c t i n 基因异管扩增退火温度的确定 如同4 4 、4 5 所示当i 睦火温度为5 5 。c 时，i l g b p - h d l 扩增产物相对浓度达 到 硅商之后开始下降，p a c t i n 扩增产物在设定温度范用内扩增产物量髓温度升 南l m 增多，为了两个基因同时扩增本实验采片3 的退火温度为5 5 。 翻4 4 不同退火温度下p g b p - h d l 帛】) - a c t l np e r 产物电泳纬果 f i g u r e 4 4 t h ee l e c t r o p h o r e t i cr e s u l t so f t h eb g b p - h d ls e g m e n t a n d t h e 争a e t i ns e g m e n t u n d e r d i f f e r e n t a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e i - 6 和7 1 2 分圳为b - a e t i n 和b g b p - h d l 基闭在退火温度分别5 8 、5 7 、5 6 、5 s 、5 4 、5 3 5 2 时i l = lp c r 产物电淳结粜。 t h e r ea r ee l e c t r o p h o r e d cr e s u l t so f l 3 0 b p - h d ls e g m e n ta n d ! b - a c t i ns e g m e n t i n t u r n f r o m t o6a n d7 t 0 1 2u n d e ra r l n e a l i n g t e m p e r a t u r e so f5 8 、5 7 、5 6 、5 5 、5 4 、5 3 、5 2 cr e s p e c t i v e l y 5 25 3 5 45 55 65 75 8 退火温度 o b p h d l g - a c t i n 幽4 5 小删越火温度rb g b p h d l 和b a c t i np c r 产物的相对浓度 9 l s ”45 “”“。“裟嚣裟：罐戮姜：怒“陋“。”“ f 3 11 3 g b p h d l 、1 3 - a c t i n 基因异管扩增m g 斗浓度的确定 m f + 是d n a 聚合酶的辅助困予，其浓度高低直接影响口n a 聚合酶的活 咖 姗 咖 湖 o ee。zi) 鹫最专车霍嚣tu 第4 章饥饿及食物组成对中国明对虾b 6 b p h d l 基田表选的影响 性。m 9 2 + 浓度太低影响扩增效率，浓度太高则影响p c r 特异性。b l n 46 、4 7 i i 见，m 9 2 + 终浓度为15 0 m m o i ，l 时两种基因扩增效果最佳，条带亮度最高。 豳4 6 不同m f + 浓度fp g b p h d l lb - a e t i np c r 产物电泳结果 f i g u r e4 6 t h ee l e c t r o p h o r e t i er e s u l t so f t h e 妒b p - i - i d ls e g m e n ta n d t ep a c l i ns e g m e n t w i t h d i f f e r e n lm 一+ c o n c e n t r a t i o n s 1 - 8 和】9 - 1 6 分别为肛a c t i n 和b g b p h d l 基冈在m g ”浓度分别为30 0 、27 5 、25 0 、22 5 、 20 0 ，17 5 、i5 0 、l2 5 m m o l l 时的p c r 产物l b 泳结果。 t h e r ea r ee l e c t r o p h o r e t i cr e s u l t so fj 3 g b p h d ls e g m e n ta n db a c t i ns e g m e n t i n l l l r n f r o mi t o8a n d9 t 0 1 6 w i t h m g ”c o n c e n t r a t i o n so f 30 0 、27 5 、2 5 0 、22 5 、20 0 、17 5 、l5 0 、i2 5 m m o l ，l r e s p e c t i v e l y m 9 2 + * ( 目47 小同m 9 2 + 浓应j - 1 3 g b p h d l g lb _ a c t i np c r 产物的相对浓度 “8 ”“7 耻1 a “v ec o n c e n ”a n 。n 5 0 n h e 躲苍+ - h d l s e g m e n t d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n 删“邮砌嘲m e n “m f 、1hz一一掣w嚣堇；s导色(1 第4 章饥峨及食物组成对中国明对虾 3 g b p - h d l 基冈表选的影响 4 2 3 半定量r t p c r 结果 42 31 饥娥刺激组的半定量r t - p c r 结果 酬4 8 饲喂后5 个时阃段b 6 bp _ h d l 和b - a c t i n p c r 产物电泳结果 f i g u r e 48 t h ee l e c t m p h o r e t i cr e s u l t s o f t h ep g b p h d ls e g m e n ta n d t h eb - a c l ms e g m e l f i t i n d i f f e r e m l i m e sa f t e r 南e d i n g 第4 章饥饿及食物组成对中国明对虾b g b p h d l 基嘲表达的影响 a 、b 、c 、d 、e 分别为饲喂后2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、i2 0 h b o b p h d l # i 3 a c g np c r 产物 电泳结果 1 6 乖1 7 1 2 分别为饲喂后5 个时间段6 个样品i i ( p g b p h d l 和b a c t i n 的扩增结果 a 、b 、c 、d 、ea mt h ee l e c t r o p h o r e t i cr e s u l t so f 2 h 、2 4 h 、4 8 h 7 2 h 、1 2 0 hr e s p e c t i v e l y t h ee l e c t r o p h o r e t i er e s u l t so f 3 g b p h d ls e g m e n ta n d b - a c t i ns e g m e n ta r e i n t u r n f r o m i t o6a n d 7 1 0 1 2 山图49 可见， 3 g b p - h d l m r n a h f i 、r _ 在2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、i 2 0 h 各组之削 差异极显著( p 0 0 5 ) 。说明两种饲料中脂类含量的 差异对1 3 g b p - h d l 表达的影响并不显著。 4 3 讨论 半定量r t p c r 是目前研究基因转录水平的有效手段，可用来检测基因表达 及其变化状况，并可进行定量分析，即使模板浓度较低也能检测到，这就为用非 常少量的r n a 分析提供了可能。虽然此法只能测定m r n a 的相对含量，但在比 较模型组和对照组样品之间特异m r n a 的表达差异时足以说明问题。用r t p c r 对基因表达进行定量，最关键的是要优化实验条件。其中r n a 的纯度、完整性， 栎q b m 9 2 + 的浓度，退火温度和循环数的多少，无不直接与p c r 产物的荧光强度 能否充分反映模板的量，即基因表达情况密切相关。所以需要反复摸索，不断 优化实验条件，最终才能建立一个理想的反映体系，得到一个准确可靠的实验 结果。 通过半定量r t p c r 方法，我们所得到的数据显示，在喂食后2 h ，当血淋巴 中脂质含量升高时，中国明对虾i b g b p h d lm r n a 表达量也相对较高，2 4 h 当对 虾处于没有食物的饥饿状态时，相应的1 3 g b p h d lm r n a 表达量达到最低。4 8 h 、 7 2 h 和1 2 0 h 时又有小幅度回升，可能是肝胰腺中储存的脂质被运输到其它组织。 由此可知，i b g b p h d l 可能参与对虾体内脂质运输。 本实验设立的饥饿过程与其蜕皮时经历的饥饿过程类似。对虾一生要经历 5 0 多次蜕皮，由于蜕皮期间没有硬的外壳来摄取食物，对虾要经历3 4 天短暂的 饥饿时期【4 7 1 。因此，对虾及其它甲壳类动物可能形成了一种短暂且快速利用或 转移能量的机制。对虾肝胰腺是消化酶及血浆脂蛋白主要的合成器官，包括所 有脂蛋白，尽管到目前为止只有1 3 g b p h d l 被证实过【4 8 】。饥饿对凡纳滨对虾 i g b p h d l 表达的影响要比对胰岛素的影响更大更快【4 9 1 ，这可能与这两种蛋白的 第4 章饥饿及食物组成对中国明对虾1 3 g b p h d l 基因表达的影响 分泌过程和作用有关。 不同动物对饥饿的反应不同。饥饿能促进小鼠肝脏中一些蛋n m r n a 的表达 【5 0 1 。饥饿刺激下，小鼠中一些编码代谢蛋白、胁迫应答蛋白和载脂蛋白b 1 0 0 的 m r n a 水平升高了6 倍多。相反，在无脊椎动物中，即使很近的物种问脂蛋白对 食物和饥饿的表达反应也不同。例如，埃及斑蚊( a e d e sa e g y p t i ) 吸血后促进载 脂蛋白的表达1 5 i j 而冈比亚疟蚊似n o p h e l e sg a m b i a e ) 的载脂蛋白却没有明显变 化1 5 引。短暂的饥饿后，中国明对虾1 3 g b p h d l m r n a 水平下降，说明基因表达受 到抑制调节。 。 食物中的脂类是对虾主要的能量来源，脂类在其生长发育的很多重要过程 中起作用，如蜕皮和繁殖。食物经肝胰腺分泌的消化酶消化后，通过肠道吸收 并运送到特定的细胞储藏或利用【3 5 , 5 4 , 5 5 1 。对虾肝胰腺分泌的蛋白酶因食物中蛋白 的含量和类型而异，曾有数据显示，饲料中鱼粉的含量不同会影响胰蛋白酶的 活性和m r n a 的水平1 5 6 , 5 7 1 。饲料中脂类含量不同看来也会影响1 3 0 b p h d l 的 m r n a 的表达。 由于脂类含量在两组饲料中差异不是很大，可能导致1 3 g b p h d lm r n a 的表 达差异不大。饲料中蛋白与脂类的配比，也会影响脂蛋白的合成，这种比例达 到一定程度后，可能对脂蛋白合成的影响变化也会不明显。当然，在不同物种 和不同组织中表达量也可能不同。在真鲷内脏脂肪组织中，饥饿能使脂蛋白酯 酶的m r n a 表达明显下降，与饥饿前食物中脂类含量无关【5 引。相反，饥饿能刺 激低脂饲料组的鱼肝脏低密度脂蛋白的表达，却对高脂饲料组脂蛋白酯酶的表 达无影响【5 9 1 。尽管胆固醇和不饱和脂肪酸是对虾生长中必需的营养元素，但对 虾可能对脂类没有一个确定的需求量1 6 0 1 ，所以商业饲料中脂类含量从6 到7 5 不等。实验中用到的饲料中脂类含量较低( 2 4 5 ) ，与普通商业饲料中的含 量差别并不是很大，可能也是1 3 0 b p h d l 表达量之间差异很小的原因之一。可能， 要对1 3 g b p h d l 的表达量产生较大影响，要求的脂类含量更高。 总之，本实验验i 正 j 1 3 g b p h d l 参与对虾体内脂质运输，具体的运输机制、 运输路线目前很不清楚。1 3