（生物化学与分子生物学专业论文）转基因玉米和大豆及产品的定性pcr检测.pdf

摘要 自1 9 9 4 年第一例转基因产品( 番茄) 在美国批准上市以来，消费者对转基因产品的安全臼益 关注，时常提出对转基因产品的知情权和选择权等要求。因此，已有包括欧盟国家在内的4 0 余个 国家、地区制定了有关转基因生物及其产品标识管理的法律、法规。我国国务院于2 0 0 1 年5 月2 3 日颁布的农业转基因生物安全管理条例规定实施转基因生物标识管理制度。转基因作物及产 品中转基因成分的检测是标识管理的重要技术支撑，也是转基因植物安全性检测的一项有用技 未。 本文主要针对我国在实际检测中存在的技术问题，研究建立了针对国际上已批准应用的部分 玉米和大豆转化体的定性p c r 检测方法取得如下主要进展： 1 、根据产品加工工艺及特性，研究提出了转基因玉米及加工产品d n a 提取方法：参与开发 丁一系列从产品原材料、固体产品、液体产品和油脂类产品中提取d n a 的方法，分别为g m o 、 玉米淀粉、蚝油和玉米深加工产品d n a 提取试剂盒的研制做出了贡献，而目前国内外未见玉米 淀粉d n a 提取方法的相关报道。对所在实验室研制的大豆色拉油d n a 提取试剂盒进行了改进， 将样本用量由1 0 m l 减少到6m l ，降低了成本。 2 、研究了不同物理、化学因素对d n a 提取及检测的影响，发现高温、极性酸碱条件，对样 本d n a 有较大影响，加热温度越高、溶液的p h 极性越大、处理时间越长，影响越大：对大豆色 拉油加工的关键步骤进行取样研究，发现精炼脱胶过程是豆油中d n a 损失的重要步骤：常温、避 光条件下，开封日起1 8 0 天较长时间贮藏对色拉油样本d n a 提取与转基因成分的定性p c r 检测没 有影响。 3 、针对转基因作物主要外源基因及调控元件进行p c r 检测方法的研究，试验建立了针对转 基因玉米、大豆、油菜部分转化体的定性p c r 佥测方法：试验建立了6 种转基因玉米( e v e n t1 7 6 、 b t l l 、t 2 5 、m o n 8 1 0 、g a 2 、n k 6 0 3 ) 身份鉴定检测技术，其中针对转基因玉米品种n k 6 0 3 的 检测技术国内外未见报道。 4 、探讨复合p c r 检测技术，建立了在一个反应中针对转基因玉米( e v e n t1 7 6 、b t l l 、t 2 5 、 m o n 8 1 0 、g a 2 1 、n k 6 0 3 ) 同时扩增多对引物的复合p c r 检测方法，用于成分混杂的转基因玉米 产品的检测。 5 、利用本研究建立的检测技术，对市场上随机购买玉米、大豆及加工产品，进行转基因成 分检测，发现部分产品中含有转基因成分，验证了检测技术的适用性。 关键词：转基因玉米，转基因大豆，d n a 提取，p c r ，定性检测 a b s t r a c t f r o m1 9 9 4 ，t h ep l a c i n go nt h em a r k e to ff o o dp r o d u c t sd e r i v e df r o mg e n e t i c a l l ym o d i f i e d ( g m ) c r o p sh a sr a i s e dp u b l i cc o n c e r no v e rt h e i rs a f e t ya n dp r o v o k e dn e wd e m a n d sf o rc l e a rl a b e l i n g p r o v i s i o n s s o ，m a n yc o u n t r i e s ( i n c l u d i n gc h i n a ，s i n c e2 0 0 1 ) i n t r o d u c e dl a b e l i n gp r o v i s i o n si nt h e i r b i o s a f e t yr e g u l a t i o n s t h i sh a sl e ds o m eo f f i c i a ll a b o r a t o r i e st od e v e l o pp r a c t i c a la n a l y t i c a lm e t h o d st h a t c a na s s i s ti nt h ee n f o r c e m e n to f t h el a b e l i n g p r o v i s i o n s t h i sr e s e a r c ha i m sa lg mm a i z ea n dg m s o y b e a n ，a n dt h e i rd e r i v e df o o d s t u f f s a tf i r s t ，w es t u d i e d o nh o wt oe x t r a c td n af r o md i f f e r e n tf o o d s ，a n dt a k ep a r ti nd e v e l o p i n gas e r i e so fr a p i da n de f f i c i e n t m e t h o d sa n dk i t sf o rs o l i d l i q u i df o o da n dl i p i d i cp r o d u c t s ；i m p r o v eo nt h eg m od e t e c t i o nk i t sf o ro i l t h es e c o n d ，t h ep r e s e n ts t u d yi n v e s t i g a t e st h ee f f e c t so fd i f f e r e n th e a t p ht r e a t m e n to nt h ep c r d e t e c t i o n t h eq u a n t i f i e so fd n aa n dt h ee f f i c i e n c yo fp c rd e c r e a s e da st h eh e a t i n g ( p h ) d u r a t i o n i n c r e a s e d t os e r i e so fr e f i n i n gp r o c e s s e s ，t h ed e g u m m i n gi st h em o s ti m p o r t a n ts t e pi nt h er e m o v a lo f d n af r o mc r u d es o y b e a no i l t h ep r o l o n g e ds t o r e dt i m ei sn oe f f e c to np c rd e t e c t i o n t h et h i r d ，f o rr o u t i n es c r e e n i n gp u r p o s e ，q u a l i t a t i v ep c rm e t h o d sa r ew e l le s t a b l i s h e df o rs o m e e v e n to fg mm a i z e ，s o y b e a na n dc a n o l a w ec o l l e c t i n g2 1k i n d so fp r i m e r su s e di np c r d e t e c t i o n ，a n d f i r s t l ye s t a b l i s h e ds p e c i f i cp r i m e r sf o rd e t e c t i n gg l y p h o s a t e - t o l e r a n tn k 6 0 3 t h ef o n l l w ed e v e l o p e dam u l t i p l e xp c rm e t h o dt od i s t i n g u i s ha m o n gg mm a i z ei no n et u b e t h e s p e c i f i c i t yo f t h i sp c rm e t h o dw a si n v e s t i g a t eb yu s i n gd n a e x t r a c t e df r o mm a i z e ，s o y ，c a n o l a ，c o t t o n ， a n dn oa m p l i c o nw a so b t a i n e db yu s i n gd n af i - o ms o y ，c a n o l a , c o t t o n t h ef i f t h ，p c rm e t h o d sw a se s t a b l i s h e dt od e t e c to ri d e n t i f ym a i z e ，s o y b e a na n dt h e i rd e r i v e d f o o d s t u f f s ，a n dp a r t so f t e s t sd e t e c ti n g r e d i e n t so f g m o s k e yw o r d s ：g e n e t i c a l l ym o d i f i e dc r o p sa n dt h e i rd e r i v e df o o d s t u f f s ；d n ae x t r a c t i o n ；p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ( p c r ) ；q u a l i t a t i v ed e t e c t i o n 插图和附表清单 第一章引言1 图】_ 1 ：全球转基因作物总面积r 19 9 6 2 0 0 3 ) 表1 1 ：不同标识管理政策要求的最低转基因成份含量闽值 表1 - 2 ：p c r 抑制剂及解决方法 表1 3 ：转基因大豆、玉米、油菜定性p c r 检测研究概况 表1 4 ：2 0 0 3 年全球己批准商业化生产的转基因玉米 表1 5 ：2 0 0 2 年欧盟转基因玉米的p c r 检测方法研究概况 第二章玉米及加工产品d n a 提取及大豆色拉油d n a 提取方法的改进l l 图2 1 ：6 种玉米一般加工产品d n a 电泳图谱1 5 图2 2 ：6 种玉米一般加工产品内源参照基因l v r 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果1 6 图2 - 3 ：玉米淀粉及玉米淀粉类加工产品d n a 电泳图谱1 7 图2 - 4 ：玉米淀粉及玉米淀粉类加工产品内源参照基因i v r 扩增产物琼脂糖凝胶电泳 结果1 8 图2 5 ：玉米油等3 种玉米深加工产品d n a 电泳图谱1 8 图2 - 6 ：玉米油等3 种玉米深加工产品内源参照基因抑扩增产物琼脂糖凝胶电泳结 果1 9 图2 7 ：奶粉d n a 及内源参照基因l e e 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果2 0 图2 - 8 ：大豆色拉油不同方法提取d n a 的内源参照基因l e c 扩增产物琼脂糖凝胶电 泳结果2 0 图2 - 9 ：大豆色拉油不同样本量提取d n a 的内源参照基因l e c 扩增产物琼脂糖凝胶 电泳结果2 1 表2 - 1 ：6 种玉米一般加工产品d n a 提取质量及d n a 得率16 表2 2 ：玉米淀粉及玉米淀粉类加工产品d n a 提取质量及得率1 8 表2 3 ：玉米油等3 种玉米深加工产品d n a 提取质量及得率1 9 表2 - 4 ：不同方法提取色拉油d n a 的提取质量及得率2 1 表2 5 ：不同提取体积提取色拉油d n a 的提取质量及得率2 】 第三章样本d n a 提取的影响因素2 4 图3 1 ：湿热处理玉米粒及玉米粉内源参照基因抑扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果2 7 图3 2 ：干热处理玉米粒及玉米粉内源参照基因v r 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果2 8 图3 3 ：微波处理玉米粒及爆玉米花内源参照基因i v r 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 ：! l ； 图3 - 4 ：酸碱条件处理玉米粒及玉米粉d n a 琼脂糖凝胶电泳结果2 9 图3 5 ：酸碱条件处理玉米粒及玉米粉内源参照基因i v r 扩增产物琼脂糖凝胶处理电 泳结果2 9 图3 - 6 ：酸碱条件处理样本对d n a 的影响3 0 图3 7 ：普通加工处理玉米种子内源参照基因如r 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果3 1 图3 - 8 ：不同加工步骤色拉油内源参照基因l e c 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果3 3 3 图3 - 9 ：不同加工步骤玉米淀粉内源参照基因抑扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果3 4 图3 1 0 ：3 0 天贮藏时间大豆色拉油l e e 、e p s p s 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果3 5 图3 i1 ：6 0 天贮藏大豆色拉油l e c 、e p s p s 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果3 5 图3 - 1 2 ：1 8 0 天贮藏时间大豆色拉油l e c 、e p s p s 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果3 5 表3 1 ：湿热处理( 1 2 0 ，0 1m p a ) 玉米粒及玉米粉d n a 提取质量及得率2 7 表3 2 ：干热处理( 1 8 0 ) 玉米种子粒及玉米粉d n a 提取质量及得率2 8 表3 3 ：微波处理( 1 0 0 ) 玉米粒及爆玉米花d n a 提取质量及得率2 8 表3 4 ：酸碱条件处理玉米粒及爆玉米花d n a 提取质量及得率3 0 表3 5 ：普通处理玉米粒及爆玉米花d n a 提取质量及得率31 表3 - 6 ：不同加工步骤色拉油d n a 提取质量及得率3 3 表3 7 ：玉米种子及组分d n a 提取质量及得率3 4 第四章转基因作物常用外源基因及调控元件定性p c r 检测3 8 图4 - 1 ：花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果4 2 图4 2 ：农杆菌t i 质粒f t o s 终止子扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果一4 2 图4 3 ：草丁膦乙酰转移酶p a t 基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果4 3 图4 4 ：b a r s t a 抗性标记b a r 基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果4 3 图4 5 ：苏云金杆菌6 内毒素c r y l a b 基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果4 4 图4 - 6 ：草甘膦抗性c p 4 一e p s p s 基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果4 4 图4 7 ：玉米突变草甘膦抗性m e p s p s 基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果4 5 图4 - 8 ：新霉素磷酸转移酶n p t 口基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果4 5 图4 - 9 ：水稻a c t i n ，启动子r a c t - p r o 基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果一4 6 图4 1 0 ：草甘膦氧化还原酶g o x 基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果4 6 图4 1 1 ：转基因玉米e v e n t1 7 6 中外源基因示意4 7 图4 1 2 ：玉米e v e n t1 7 6p e p e 苏云金杆菌6 内毒素c r y l a b 基因扩增产物琼脂糖凝 胶电泳结果4 7 图4 1 3 ：转基因玉米b t l l 中外源基因示意图4 8 图4 - 1 4 ：玉米b t l la d h i s i v s a 苏云金杆菌6 内毒素c r y l a b 基因扩增产物琼脂糖凝 胶电泳结果：4 8 图4 一1 5 ：转基因玉米t 2 5 中外源基因示意图4 9 图4 1 6 ：玉米t 2 5 草丁膦抗性基因p a t t 宅椰菜花叶病毒3 5 s 终止子扩增产物琼脂糖凝 胶电泳结果4 9 图4 1 7 ：转基因玉米m o n 8 1 0 中外源基因示意图4 9 图4 1 8 ：玉米m o n 8 1 0 热激蛋白苏云金杆菌6 内毒素c r y l a b 基因扩增产物琼脂糖凝 胶电泳结果5 0 图4 1 9 ：转基因玉米g a 2 1 中外源基因示意图5 0 图4 2 0 ：玉米g a 2 1 叶绿体加氧酶转移肽基因玉米突变草甘膦抗性基因扩增产物琼 脂糖凝胶电泳结果5 0 图4 2 1 ：转基因玉米n k 6 0 3 中外源基因示意图5 1 图4 2 2 ：玉米n k 6 0 3 热激蛋白玉米草甘膦抗性基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 图4 - 2 3 ：玉米内源参照基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 图4 2 4 ：大豆内源参照基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 5 1 5 3 5 4 图4 2 5 ：油菜内源参照基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 图4 2 6 ：番茄内源参照基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 图4 2 7 ：棉花内源参照基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 图4 2 8 ：7 种转基因玉米与其它转基因作物的定性p c r 检测结果 图4 2 9 ：7 种转基因玉米定性检测程序 表4 1 ：部分转基因作物的外源基因 5 4 5 5 5 5 5 7 5 8 3 8 第五章转基因玉米复合p c r 检测研究5 9 图5 - 1 ：多对引物复合p c r 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 表5 1 ：转基因玉米复合p c r 引物序列 表5 2 ：6 种转基因玉米品种复合p c r 反应体系和条件 6 3 6 0 6 1 第六章转基因产品的检测6 5 图6 1 ：大豆色拉油g 定性p c r 琼脂糖凝胶电泳结果 图6 2 ：大豆色拉油a 、b 定性p c r 琼脂糖凝胶电泳结果 图6 3 ：大豆色拉油c 、d 、e 定性p c r 琼脂糖凝胶电泳结果 图6 - 4 ：大豆卵磷脂固体饮料定性p c r 琼脂糖凝胶电泳结果 图6 5 ：大豆粉定性p c r 琼脂糖凝胶电泳结果 图6 - 6 ：玉米加工产品定性p c r 琼脂糖凝胶电泳结果 表6 1 ：色拉油定性p c r 检测 表6 2 ：玉米加工产品定性p c r 检测 6 7 6 7 6 8 6 9 6 9 7 0 6 8 7 1 缩略词 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n g m o g e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s m s g m c g e n e t i c a l l ym o d i f i e dc r o p s c t a b c e r t y i t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e q o s n o p a l i n es y n t h a s e c a r n y 3 5 s c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s3 5 s n p t i in e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s ei i p a tp h o s p h i n o t h r i c i nn - a c e t y l t r a n s f e r a s e b a r g e n ec o d i n gf o rap h o s p h i n o t h r i c i na c e t y l t r a n s f e r a s e f r o ms t r e p t o m y c e sh y g r o s e o p i e u s c r y l a b d e l t a - e n d o t o x i nf r o mb a c i l l u st h u r i n g i e n s i ss u b s p k u r s t a k i c p 4 一e p s p s5 - e n o l p y r u v y l s h i k i m a t e - 3 - p b o s p b a t es y n t h o s e m e p s p s p o i n tm u t a t e de p s p sg e n ed e r i v e df r o mm a i z e r a c t - p r o r i c ea c t i np r o m o t e rc o n t a i n i n gt h en o 1i n t r o n c t pc h l o r o p l a s tt r a n s i tp e p f i d e h s p 7 d - i m t h en o 1i n , o ns e q u e n c ef r o mm a i z eh s p 7 0g e n e ( h e a t - s h o c kp r o t e i n ) g o xg l y p h o s a t eo x i d a s e e c l e e f i n v ri n v e r t a s e l a t 5 2 o l y e o p m t e i nl a t 5 2 n a p i n b r a s s i c an a p u s1 7 sn a p i ns e e e ds t o r a g e p r o t e i n s a d l s t e a r o y l - a c pd e s a t u r a s e 聚合酶链式反应 转基因生物 转基因作物 溴代十六烷基三甲胺 十二烷基硫酸钠 胭脂碱合成酶 花椰菜花叶病毒 新霉素磷酸转移酶 草丁麟乙酰转移酶 磷酸乙酰转移酶基因 苏云金杆菌6 内毒素c r y l a b 5 _ 莽草酸一3 一磷酸合成酶 突变5 - 莽草酸一3 一磷酸合成酶 水稻a c t i n i 启动子 叶绿体转移肽 玉米热激蛋白- 内含子 草甘瞵氧化还原酶 大豆凝集素基因 玉米转化酶 l a t 5 2 糖蛋白 油菜1 7 s 种子贮藏蛋白 硬脂酰一a c p 脱饱和酶 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所 知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研 究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了日 意。 研究生签名： 前 ) 嗍 时间： 已p 【年 月日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业 科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 素吼氢 时间：b q 年功“日 翩躲孰孑统 帅：川年i 月如日 中国农业科学院硕士学位论文第一章哼f 言 第一章引言 1 1 转基因作物发展现状与安全性 1 1 1 转基因作物的发展现状 转基因生物又称遗传修饰生物( g e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s m s ，g m o ) ，娃经基因工程技术 改变基因组构成的生物，包括转基因植物、转基因微生物和转基因动物。其中转基因作物 ( g e n e t i c a l l ym o d i f i e dc r o p s ，g m c ) 发展最为迅猛。】9 8 3 年首例转基因烟草问世，到2 0 0 3 年全 球己批准种植的转基因植物共计1 8 种1 2 0 多个品种( 品系) ( a g b i o s ，2 0 0 3 ；b o n f i n il a u r a ，2 0 0 2 ) 。 自从1 9 9 6 年大规模种植转基因作物以来，全球g m c 的种植面积连续8 年均以每年大于1 0 的 速度增长，2 0 0 3 年全球g m c 种植面积达到6 7 7 0 万公顷。比2 0 0 2 年净增9 0 0 万公顷，增幅达1 5 ( c l i v ej a m e s 2 0 0 3 ) ( 图1 1 ) 。 图1 - 1 ：全球转基因作物总面积( 1 9 9 6 - 2 0 0 3 ) g l o b a l a r e a o f t r a n s g e n i e c r o p s m i l l i o n h e c t a r e s ( 1 9 9 6 t o2 0 0 3 ) 2 0 0 3 年全球共有1 8 个国家近7 0 0 万农户种植转基因作物。但是，各国转基因作物发展并不 平衡。目前主要的产地为美国、阿根廷、加拿大、巴西、中国和南非，种植面积达全球转基因作 物面积的9 9 。其中，中国的转基因棉花种植丽积2 8 0 万公顷，比2 0 0 2 年增长了9 0 万公顷，占 全球转基因棉花种植面积的4 。从不同转基因作物种类看，主要种植的转基因作物为转基区i 大 豆、玉米、棉花和油菜等4 类作物其中转基因大豆发展最快，2 0 0 3 年全球有4 1 4 0 万公顷( 占 全球转基因作物面积的6 l ) ( c l i v ej a m e s ，2 0 0 3 ) 。 转基因作物的广泛应用，产生了巨大的社会、经济和生态效益。例如，转基因作物不仅能提 中国农业科学院硕士学位论文 第一章引言 高产量，增强对病虫害以及恶劣环境的抵御能力，还可不受除草剂影响，减少杀虫剂的用量和次 数，同时也提高了对免耕栽培农作方式的适应性；此外，转基因作物正在或将为全球粮食产量的 安全稳定和减缓第三世界的饥饿问题发挥出潜在的作用。来自i s a a a 乐观谨慎的预测，全球转 基因作物种植面积和种植转基因作物的农民数目在2 0 0 4 年将继续增加。州于转基因产品研发的 投入不断增多，更多新的转基因棉花和玉米品种也会在今后几年进入商业化。经生物技术改良农 作物品种，将继续成为生产成本效益最佳、最维持环境安全，同时能确保全球粮食供求稳定的永 续途径( c l i v ej a m e s ，2 0 0 3 ) 。 1 1 2 转基因作物的安全性与标识管理 然而转基因生物对人体健康的影响及对生态环境的潜在风险引起欧洲等国家和地区公众的 广泛关注( e u r o p e a n c o m m i s s i o n ( 1 9 9 7 ) n o2 3 9 1 9 9 7 ；b a t s - r e p o r t ，2 1 9 9 7 ) ，产品中转基因成分 安全性问题的争议目趋激烈( a n k l a m ，2 0 0 2 ) 。目前人们所担忧的g m o 风险主要集中在三个方 面：一是人体健康的风险，转基因产品是否对人类无毒、无副作用，转基因产品与传统的产品相 比是否存在“实质等同性”、无显著差异：二是生态环境风险，转基因生物是否会对环境造成影 响，特别是长期的生态影响；三是社会伦理道德风险，转基因生物是否会对物种进化及人类社会 造成灾难。 近十年来，人类食用4 0 0 0 多种转基因产品及产品成分的经验表明，经过严格的安全性评价 审批程序而进入市场的转基因产品，不会对人类健康造成额外的风险。但是，受国际政治、经济 因素的影响，到目前为止，已有包括欧盟国家在内的4 0 余个国家、地区制定了相关的法律、法 规，要求对转基因生物及其产品进行标识管理( 金芜军，2 0 0 3 ) 。不同国家和地区根据自身情况 对转基因产品标识管理政策不尽相同，主要区分于标识类别、标识范围、标识闽值、标识内容和 阴性标识等5 个方面。例如，大部分国家和地区的转基因标识管理政策，都允许在产品( 饲料) 中存在少量转基因成份，将这种转基因成份的存在作为收获、运输及加工过程中，无法经技术手 段加以消除的意外混杂，而不需要进行标识，并且确定了产品( 饲料) 中转基因成份意外混杂的 晟高限量( 阂值) ( 表1 一i ) 。倘若产品( 饲料) 中转基因成份的含量超过这阈值，则需对该产 品( 饲料) 进行标识。 我国政府先后出台了一系列政策法规，对农业转基因生物实施标识管理。2 0 0 1 年5 月2 3b ， 国务院朱鳍基总理签署了第3 0 4 号中华人民共和国国务院令，发布了农业转基因生物安全管理 条例( 中华人民共和国国务院，2 0 0 1 ) ，在该条例第四章第二十八条中明确规定凡列入中华人民 共和国转基因生物目录的农业转基因生物应当有明显标识。随后农业部于2 0 0 3 年颁布农业转 基因生物标识管理办法( 中华人民共和国农业部，2 0 0 2 ) 对农业转基因生物实施标识管理，并 与2 0 0 3 年3 月2 0 日起正式实施。与欧盟、日本、韩国等国实施定量管理不同，我国要求对农业 转基因生物进行定性标识管理，第一批实施标识管理的农业转基因生物有：( i ) 大豆种子、大豆、 大豆粉、大豆油、豆粕；( 2 ) 玉米种子、玉米、玉米油、玉米粉( 含税号为1 1 0 2 2 0 0 0 、1 1 0 3 1 3 0 0 、 1 1 0 4 2 3 0 0 的玉米粉) ：( 3 ) 油菜种子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕；( 4 ) 棉花种子：( 5 ) 番茄种子、 鲜番茄、番茄酱。保障转基因产品标识政策贯彻实施的关键技术就是转基因作物及产品的检测技 术，因此如何有效地检测转基因成分，已成为近年生物安全管理的热点。 2 中囡被业科学院硕士学位论文第一章引言 表1 - 1 ：不同标识管理政策要求的最低转基因成份含量闭值( 金芜军，2 0 0 3 ) t a b l e1 - ht o l e r a n c el e v e l so f g mi n g r e d i e n t si nw h o l ef o o df o rd i f f e r e n tl a b e l i n gp o l i c i e s 1 2 转基因作物及产品的检测方法 1 2 1 简介 为了推动标识制度的实施，目前已经发展起一系列转基因产品的检测技术。检测方法主要分 三种，基于转基因植物中插入的特定外源d n a 片段的d n a 检测法，如p c r 检测法；基于外源 基因表达的蛋白质检测法，如e l i s a 检测法；以及以特殊生物学特性为基础的检测方法( b o n f i n i l a u r a 2 0 0 2 ) 。 蛋白质检测法与核酸检测法相比较，各具优缺点。其中，酶联免疫吸附检测( e l i s a ) 是蛋 白质检测的主要方法之一，将抗原与抗体反应的特异性与酶的高效催化作用结合起来，根据酶作 用于底物后的显色反应，当抗原与抗体结合时，借助于比色或荧光反应鉴定转基因成分的存在( 周 志军，2 0 0 2 ) 。e l i s a 检测对样品进行定性检测的同时又能进行定量分析，该方法己用于辣椒、 水稻、烟草、番茄、r r s ( r o u n d u p r e a d y ) 抗草甘膦大豆等转化植株的鉴定当中( 吕山花，2 0 0 2 ) 。 通常用e l i s a 法检测g m o 时成本低于p c r 法( b o n f l n il a u r a 等，2 0 0 2 ) 。然而，由于蛋白质 对热敏感，在加热过程中容易变性，因此，采用e l i s a 法可能无法检出转基因原料加工产品中的 g m o 成分：另外，蛋白质表达具有组织特异性，也限制了e l i s a 法的应用( a n k l a m ，2 0 0 2 ) 。 p c r 检测依据的是d n a ，而核酸存在于植物体的各个器官和组织的细胞中，因此，p c r 检测不 受材料的限制：同时，p c r 检测不仅具有快速、灵敏、特异性强等特点( e s t h e q2 0 0 2 ) ，而且， 核酸对热相对比较稳定，可应用于深加工产品的检测；此外，e l l s a 检测比p c r 检测灵敏度低 1 0 0 倍。因此，在目前实际检测工作中，核酸分子检测法即d n a 检测法得到广泛应用( j a r o s l a v a ， 2 0 0 2 ；林旭阳，2 0 0 0 ) 。 1 2 2d n a 检测方法 d n a 检测法主要分为定性p c r 与定量p c r 方法( w u r z ，1 9 9 9 ) 。在p c r 检测中，样本d n a 的质量和纯度是检测成功的关键( a n k l a m ，2 0 0 2 ) 。从植物样本中提取基因组d n a 比较容易。 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言 但是转基因产品的加t ，尤其是深加工会造成d n a 的损伤和断裂，同时，某些物理、化学或酶 因子也影响d n a 质量( a n k l a m ，2 0 0 2 ；k a y ，2 0 0 1 ) ，如罐制品在加工过程中导致d n a 降解：前 茄果汁制造采用低p h 时，d n a 发生化学修饰及降解都可以破坏d n a 质量；延比产品储藏期时， 核酸酶可能会降解d n a ( 吕山花，2 0 0 2 ) ：冈此高质量、高纯度的d n a 样品制备在g m c 及其 产品检测中十分重要，是整个检测研究的技术瓶颈，制约了标识管理政策的贯彻和实施( 陈颖， 2 0 0 3 ) 。 1 , 2 2 1d n a 的提取 转基因作物及产品d n a 提取一般包括几个步骤：样本预处理，主要针对酸性样本( p h7 0 1 0 0 的2 m n a o h 中和) 、脂类( 经正己烷去除油脂，随后样本可与水溶液混溶) 平i i 淀粉类样本 ( 加入t e r a m y it y p el6 5 1 9 孵育3 0m i n ) ，提高随后细胞裂解液的效果：细胞裂解缓冲液( s d s 、 c t a b 、e d t a 等) 处理样本，破坏细胞壁，释放d n a 至水相；酚氯仿去除杂质、p c r 抑制 剂，沉淀核酸( c a t h e r i n e ，2 0 0 2 ) 。根据上述步骤，d n a 提取方法主要分为两类：改进的传统方法 如c t a b 法( 刘光明，2 0 0 1 ) 、s d s 法等：商业化试剂盒( 如q _ i a g e n d n e a s y p l a n t m i n i k j t ) 等 用于不同样本材料d n a 的分离( 刘光明，2 0 0 1 ) 。目前，利用改进的c t a b 法提取样本d n a ， 而后结合商业化的d n a 纯化试剂盒纯化d n a ，已成为g m o 检测中d n a 制各的主要方法。这 些提取方法适用丁- 大部分分析材料( 大豆、玉米等作物) 以及粗加工产品( 淀粉、饼干、发酵产 品、粗油等) ，但是深加工产品( 色拉油、发酵产品) 的提取技术还不够成熟稳定( v a nd e n e e d e 2 0 0 0 ；2 0 0 2 ) 。有报道指出可以从粗油及精炼菜籽油中提取d n a ，但不能明确鉴定样本提取d n a ( 姚文国，2 0 0 1 ；a n t d a m ，2 0 0 2 ) 。 1 2 2 2d n a 的质量与纯度 以p c r 为基础的检测关键在于d n a 质量和纯度，这是检测转基因产品的关键所在。但是产 品中的某些添加成分、样本的前处理、提取过程中使用的不同细胞裂解液和d n a 纯化方式均可 能影响d n a 产率，并且某些成分可能抑制p c r 反应( c a t h e r i n e ，2 0 0 2 ) ( 表1 2 ) ，因此一般建议 采用商业离心柱纯化d n a ( b u c h a n ，2 0 0 1 ；z i m m e r m a n n ，1 9 9 8 ) 。 在g m o 定性检测之前，还需要检测一段内源参照基因来评估待扩增的d n a 片段。这段序 列一般属于看家基因，不管在转基因植物或非转基因植物基因组中都存在( n o b u a k i ，1 9 9 8 ；h u p f e r , 2 0 0 0 ) 。对该序列的扩增，可以证实抽提d n a 的“p c r 质量”情况，同时，避免由于抑制剂的存 在造成假阴性结果。对于转基因作物的定量检测而言，可以经检测内源参照基因计算出样品中转 基因作物和非转基因作物的模板总量，这是进行定量检测的基础；对于转基因产品而言，则可以 鉴定产品中是否含有某种作物( 如大豆、玉米、油菜等) 成分。 1 2 2 3p c r 检测方法 转基园生物中被整合到宿主基因中的外源基因一般都包括：启动子、结构基因和终止子，组 成一个基因盒( 吴乃虎，1 9 9 9 ) 。在许多情况下，由两个或更多基因盒插入宿主基因的同一位点 或不同位点。此外，在转化时，往往还有外源的抗性筛选标记基因和报告基因( 贾士荣，1 9 9 7 ) 。 因此，在检测转基因作物及产品时，主要针对外源启动子、终止子、筛选标记基因、报告基因和 4 中国农业科学院硕上学位论文第一章引言 表1 - 2 ：p c r 抑制剂及解决方法( c a t h e r i n ee2 0 0 2 ) t a b l e1 - 2 ：p r o c e d u r e sf o rh o m o g e n i z a t i o na n dp r e t r e a t m e u to f f o o ds a m p l e sp r i o rt od n ae x t r a c t i o n 结构基因的d n a 序列进行检测。目前，核酸检测的主要方式为定性p c r 和定量p c r ( p i e t s c h ，1 9 9 7 ；g a d a n i ，2 0 0 0 ) 。涉及的转基因作物有r o u n d u pr e a d y 大豆( 潘良文等2 0 0 1 ) 、 转基因玉米e v e n t1 7 6 、b t l l 等( 曹际娟，2 0 0 2 ；2 0 0 3 ) 、马铃薯、油菜( 潘良文等，2 0 0 1 ) 、番 木瓜( 谢为龙，2 0 0 2 ) 、欧美杨树( 王学聘等，1 9 9 7 ) 、番茄( 毛国杰，2 0 0 1 ；谢为龙等，2 0 0 2 ) 、 辣椒、水稻( 潘良文等) 和烟草( 贾建军，2 0 0 2 ；石春林等，2 0 0 0 ) 等。 传统的p c r 御, u 是定性检测的分析方法，其主要的缺点就是由于扩增效率的影响而不能对扩 增产物准确定量。从9 0 年代初期开始，为克服普j m p c r 进行核酸定量的一些问题，以p c r 为基础 的定量p c r 得到迅猛的发展( 潘良文，2 0 0 2 ；p h i l i p p ，2 0 0 1 ；g i l l 1 a n d ，1 9 9 0 ；a m eh o l s t - j e n s e n ， 2 0 0 3 ；g o r d o n ，2 0 0 2 ) 。定量p c r 可分为两大类，一类基于终点分析，即在p c r 反应终止以后，经比 较共同扩增的内标d n a 序列与靶d n a 序列的终止浓度来进行靶d n a 的定量，这类反应我们统称 为竞争性定量p c r ( s t u d e r , 1 9 9 8 ；t 丑、r e r n j e r s ，2 0 0 1 ；v a nd e n e e d e ，2 0 0 0 ) 。另一类为实时分析，即 经p c r 反应中的荧光信号值估计处于对数期p c r 反应合成的产物浓度，常见p c r - e l i s a ，实时定 量p c r ( p e t e r , 2 0 0 2 ；v ai l i n g o m ，1 9 9 9 ) 等。 我国针对转基因农产品的检测以定性p c r 为主，主要分析其插入的d n a 序列检测转基因农 产品。实际工作中需要了解插入d n a 的一些信息或者可能的候选序列。其中首先经p c r 技术筛 选检测转基因成分，主