（生物化学与分子生物学专业论文）沙冬青耐寒基因amgols的克隆和遗传转化研究.pdf

符号说明 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进 行科学研究所取得的成果。所有的实验是在中科院遗传 发育所植物基因组学国家重点实验室进行的。对在论文 研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集 体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承 担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论 文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机 构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：尘 导师签名： 日期：丝：z 兰 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 沙冬青是我国西北荒漠地区唯一的超旱生常绿阔叶灌木，它长期在恶 劣环境中生长，主要分布于荒漠和沙漠地区，可以在冬季零下3 0 - 4 0 c 的 严寒环境中生存。本研究通过c d n a - a f l p 方法，从沙冬青中克隆得到 了在冬季上调表达的肌醇半乳糖苷合成酶基因( a m g o l s ) 。通过 r e a l t i m e p c r 检测，我们发现该基因不仅受到冷冻胁迫的诱导，同时还 受到干旱、高盐以及激素a b a 的诱导。通过相关软件分析其上游调控序 列，发现其中含有多种冷冻胁迫诱导相关转录因子的顺式作用元件，因 此我们推测a m g o l $ 基因可能受到胁迫相关转录因子的调控。通过 a m g o l s 基因转化大肠杆菌，获得的转基因菌株的抗寒性明显提高； a m g o l s 基因转化拟南芥，所获得的d m g o l s 转基因拟南芥植株的抗寒性 和抗冻性也明显增强。我们推测转a m g o l s 基因植株抗寒性和抗冻性增 强的原因可能为a m g o l s 催化合成了蜜三糖家族寡聚糖( p , y o s ) 和肌醇半 乳糖苷，在植株中起到了渗透保护的作用。 关键词：沙冬青；低温适应：肌醇半乳糖苷合成酶：c d n a a f l p ；r e a l t i m ep c r ；拟南芥转化 沙冬青耐寒基因a m g o 俗的克隆和遗传转化研究 c l o n i n go f ac o l dt o l e r e n c eg e n ea m g o l sf r o m a m m o p o j t a n t h u sm o n g o l i c u sa n dg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n a b s t r a c t a m m o p i p t a n t h u sm o n g o l i c u s i st h e o n l y e v e r g r e e nb r o a d l e a fs h r u b e n d e m i ct ot h ea 1 a s h a nd e s e r t , n o r t h w e s ts a n d ya r e ao fc h i n a ，w h i c hc a n s u r v i v ea t 3 0 o ra ne v e nl o w e rt e m p e r a t u r ei nw i n t e r b yc d n a - a f l p a n a l y s i s ，ac o l di n d u c e dg e n ea m g o l se n c o d i n gg a l a c t i n o ls y n t h a s e ( g o l s ) w a sc h a r a c t e r i z e da n dc l o n e df r o ma m o n g o l & u s e x c e p tf o rc o l d u p - r e g u l a t i o n ，a m g o l st r a n s c r i p t sw e r ei n d u c e db yd r o u g h t ，h i g hs a l i n i t ys t r e s s a n da b s c i s i ca c i d ( a b a lr e v e a l e db yr e a l - t i m ep c rd a t a t h ep r e s e n c e so f s e v e r a lb i n d i n gs i t e si nt h ep r o m o t e ra r e ao f a m g o l si m p l i c a t e dt h a ta m g o l s i sl i k e l yt ob er e g u l a t e db ys o m et r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa s s o c i a t e dw i t l ls t r e s s a m g o l sg e n ec o n f e r r e dc o l dt o l e r a n c et ob o t ht r a n s g e n i ce s c h e r i c h i ac o l ia n d a r a b i d o p s i s , p o s s i b l yb yc a t a l y z i n gt h ef i r s tc o m m i t t e ds t e pi nb i o s y n t h e s i so f t h er a f f i n o s ef a m i l yo l i g o s a c c h a r i d e s ( r f o s ) i ti ss u g g e s t e dt h a tg o l sm a y p l a ya ni m p o r t a n to s m o t i cp r o t e c t i v er o l ei nc o l da c c l i m a t i o n k e y w o r d s ：a m m o p i p t a n t h u sm o n g o l i c u s c o l da c c l i m a t i o n g o l s ( g a l a c t i n o l s y n t h a s e ) c d n a - a f l p 。r e a l - t i m ep c r t r a n s g e n i ca r a b i d o p s i s 2 山东农业大学硕士学位论文 第一章引言 1 植物抗冻基因 低温是限制植物地理分布的重要环境因素之一，并且严重影响植物 j 下常的生长、发育甚至造成植物死亡；每年由于低温和寒害引起的作物 损失巨大( s h i n o z a k ia n dy a m a g u c h i - s h i n o z a k i ，1 9 9 6 ；t h o m a s h o w , 1 9 9 8 ) 。 因此，长期以来人们从植物生理学、形态学、生物物理学、遗传育种 学、细胞生物学、生物化学、分子生物学等多个方面对对植物抗寒机理 进行了广泛研究。研究发现，植物在没有达到冻害的低温环境中生长一 段时间后，植物的抗冻能力有所增强，从而可以耐受随即发生冷冻胁 迫，这个适应过程称为低温驯化( c o l da c c l i m a t i o n ) 。w e i s e r ( 1 9 7 0 ) 最先提出植物在低温驯化过程中基因表达会发生改变的观点。现在大量 的研究已经证实，低温驯化可以诱发植物抗冻基因的表达。人们通过对 植物低温驯化过程中差异表达的基因以及蛋白进行了研究，分离和鉴定 了许多在植物抗冻过程中起作用的基因；表1 。 1 1 抗寒基因的分类 1 1 1 编码酶类基因 1 1 1 1 编码渗透调节物质的酶类的基因 植物在低温等环境胁迫时，通过诱导渗透调节物质合成酶基因的表 达来调节离子平衡，维持渗透压，来达到抵抗胁迫的目的。植物的渗透 调节物质主要包括：可溶性糖、脯胺酸、甜菜碱和醇类物质等。 s a r a v i t z 等发现，蜜三糖家族寡聚糖( r f o s ) 中的水苏( 四) 糖( s t a c h y o s e ) 和棉子糖( r a f f i n o s e ) 在冬季植株中的积累与植株在冬季冻害中的存活 率有紧密的联系。其中，不能在1 1 月份中积累大量r f o 的植株很难在 冬季中存活；而肌醇半乳糖苷酶基因的转录是冷冻诱导r f o 家族中各 物质合成积累的关键步骤( s a r a v i t ze ta 1 。1 9 8 7 ) 。因此，肌醇半乳糖 苷酶基因的表达与植物抵抗低温胁迫有密切的联系。 3 沙冬青耐寒摹因a m g o l s 的克隆和遗传转化研究 表1 部分已分离的抗寒基因 种类基因家族基因来源g e n b a n k 序列号 c o r l 5 a 拟南芥 n m1 2 9 8 1 5 e o r 6 6 拟南芥 n m1 2 1 6 0 2 c o r c o r 4 7 拟南芥 n ml o l 8 9 4 c o t 7 8 拟南芥 n m1 2 4 6 1 0 b nb n n 5 油菜 $ 6 8 7 2 6 抗 b n 2 8 油菜 $ 6 8 7 2 7 冻 基c a sc a s l 5 苜蓿 l 1 2 4 6 2 因 c a s l 8 苜蓿 l 0 7 5 1 6 c a p c a p 8 5菠菜 m 9 6 2 5 9 c a p l 6 0菠菜 a f 0 3 5 5 3 6 p a p a l 3马铃薯 x 6 7 1 2 1 w s c w s e l 2 0 小麦 m 9 3 3 4 2 转录调 c b f ，d r e bc b f l 尼，3 拟南芥 a f 0 7 6 1 5 5 节因子 多聚半乳糖醛 p g i p s 胡萝 a f 0 5 5 4 8 酸酶抑制子蛋 a f p s 白 1 型内切几丁质酶冬黑麦 a f 2 8 0 4 3 7 内切儿r 质酶 i i 型内切几丁质酶冬黑麦 a f 2 8 0 4 3 8 1 1 1 2 编码抗氧化酶类物质的基因 研究表明，由于植物受到胁迫损伤时，体内活性氧自由基大量积 累，导致膜脂过氧化加剧及膜蛋白凝集，质膜通透性增加( 沈漫等， 1 9 9 7 ) 。因此，抗氧化酶活性和含量的增加，可有效加强低温下植物对 膜脂过氧化的自身保护，从代谢水平减轻对细胞的损伤。在提高植物抗 冻性研究中，导入抗氧化酶基因是目前抗冻基因工程中的一条有效途 径。抗氧化酶主要包括：超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、 抗坏血酸过氧化物酶( a s a p o d ) 、谷胱苷肽硫转移酶( g s t ) 等。 4 山东农业大学硕士学位论文 1 1 2 编码膜质相关蛋白的基因 膜脂的相变温度与植物抗寒性关系密切。一般具有较高膜脂不饱和 度的植物，其相变温度较低，从而在较低温度下保持膜流动性，维持正 常的生理功能( 王毅等，1 9 9 4 ) 。g i b s o n 和a r o n d d 报道了拟南芥中的 f a d 8 基因，它可以催化膜脂中脂肪酸的去饱和，通过增加膜脂的不饱和 度，来提高植物的抗寒能力( g i b s o ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。c o r l s a 基因的表 达可以稳定膜的结构( a r t u se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。拟南芥的c o r l s a 基因在低 温、干旱及受脱落酸( a b a ) 诱导的胁迫中都表达( t h o m a s h o we ta 1 ， 1 9 9 4 ) 。a r m s 等证明，未经低温锻炼的转基因拟南芥植株中c o r l s a 的 表达可以增强体内叶绿体的耐冻性，转化c o r l s a 基因的植株较野生型 抗冻性有所提高。 1 1 3 编码信号转导或调节作用的蛋白因子的基因 许多与发育相关的转录因子( 例如：a r f 、g 翩s 、h o m e o d o m a i n 、 m a d s 和 m c ) 在冷冻胁迫中特别是在冷冻胁迫早期诱导；许多r n a 合成和降解有关的基因和染色质修饰蛋白也是冷冻诱导的。这说明在冷 冻条件下许多转录因子和起调节作用的蛋白因子与冷冻应答基因调控以 及植物发育存在潜在的相关性( b y e o n g - h ae ta 1 ，2 0 0 5 ) 。c o r l 5 a 在拟 南芥中的超表达可以增强体内叶绿体的耐冻性，所有的c o t 基因启动子 都带有c r t d r e 凋节元件( p r e p e a t d r o u g h tr e s p o n s i v ed e m e n t ) ，这个 调节元件若与转录活化因t ( t r a n s c d p ta c t i v a t o r ) 结合，就能刺激c o r 基 因的表达。与此调节元件结合的激活蛋白叫做c b f l ( c r t d r eb i n d i n g f a c t o r ) 。j a g l o o t t o s e n 等( 1 9 9 8 ) 的实验结果说明，能够超表达c b f l 的植 株的耐冻性比仅仅表达c o r l s a 植株的耐冻性要强得多( j a g l o o u o s e ne t a 1 ，1 9 9 8 ) 。 1 1 4 编码抗冻蛋白蛋白( a f p s ) 的基因 抗冻蛋白( a n t i f r e e z ep r o t e i n s ，a f p s ) 是一类能直接与冰晶核相互 作用，从而抑制冰晶生长的蛋白。它依靠其大量的缚冰域结合于冰晶表 沙冬青耐寒基因a m g o 腰的克隆和遗传转化研究 面，有效地抑制冰的再结晶，从而使这些植物度过低温季节。抗冻蛋白 对细胞膜具有保护作用，在较低的温度下能与类脂体发生作用并稳定类 脂体。一些生物体内发现有大幅提高a f p 的生物活性的活化蛋白存在。 a f p 与冰核剂共同调节控制过冷水平和冰晶生长速度，一些无机离子与 a f p 也有协同作用。a f p 调节细胞原生质体的状态，使过冷点降低或诱 使细胞外结冰，保证细胞内不结冰，同时还抑制冰的重结晶，防止对细 胞造成机械损伤，而保证细胞不死亡。抗冻蛋白能以非依数形式降低水 溶液的冰点，但对熔点影响很微弱，从而导致水溶液的熔点和冰点之间 出现差值，这种差值称为热滞( t h o r m a lh y s t e r e s i s ) 活性；热滞活性是 判断抗冻蛋白活性的重要指标。研究表明，自然界存在许多具有高热滞 活性的植物抗冻蛋白及其相关基因。1 9 9 8 年w o r r a l l 等从胡萝卜分离到 第一个植物的a f p 基因，d n a 全长1 2 3 8b p ，编码3 3 2 个氨基酸，体外热 滞值0 3 5 。w o r r a l l 等将其c d n a 连接在表达载体上的双c a m v 3 5 s 启动 子之后导入烟草，在转基因烟草中用蛋白免疫杂交法检测到3 6k d 的多 肽表达，其提取物可抑制冰晶的生长( w o n a l le ta 1 ，1 9 9 8 ) 。随后，冬 黑麦和欧白英中也分别克隆得到抗冻基因c h 9 ，c h t 4 6 年u s t h p 6 4 。 l2 植物抗冻基因研究方法 大量的研究证实，低温驯化可以诱发植物许多抗冻基因的表达。通 过研究植物在低温驯化过程中基因表达差异来分离和克隆基因的方法有 很多，主要的方法是通过对植株有抗冻表型的突变体和野生型之间基因 组和蛋白组差异或者同一种植株在冻害条件和常温不同的生理状态下基 因表达的差异来分离抗冻基因。其主要分为两个方面：一个是反映某些 基因在不同条件下的表达时间、表达量，以及蛋白质翻译后的加工修饰 和亚细胞分布差异的蛋白质组学；另一个方面是比较稳定状态下m r n a 的丰度高低及有无的转录组学。其中用于蛋白质组学中研究中蛋白质分 离的技术主要是双向凝胶电泳( 2 d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，2 - d e ) ，它的优点是可以在分子水平以动态的、整体的角度对生命现象 的本质及其规律进行研究；但是它也有重复性差等缺点，使得几乎不能 同来自其它实验室的资料进行比较。另一个方面的研究主要集中在转录 6 出东农业大学硕士学位论文 组学，它有研究方法简单、自动化程度高、效率高等优点：转录组学主 要是对c d n a 的差异表达进行研究，其方法主要有差异杂交、c d n a - a f l p ( e d n aa m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 以及基因芯片 ( g e n ec h i p ) 技术等。 1 2 1 双向电泳 1 9 7 5 年f a r r e l 建立了聚丙烯酰胺凝胶双向电泳( t w o d i m e n s i o n a l e l e e t r o p h o r e s i s ，2 - d e ) 。其基本原理是第一向为等电聚焦( i s oe l e c t r o f o c u s i n g ，i e f ) ，根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为s d s 聚 丙烯酰胺凝胶电泳( s o d i u md o d e e y l s u l f a t ep o l y a e r y l a m i n e dg e l e l c c t r o p h o r e s i s ，s d s p a g e ) ，按亚基分子量大小进行分离。经过电荷和 分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息 ( f a r r e l le ta 1 ，1 9 7 5 ) 。魏令波等( 1 9 9 9 ) 用双向电泳电泳回收法从 沙冬青( a m m o p i p t a n t h u sm o n g o l i c u s ；m a x i m c h e n gf ) 叶片热稳定蛋 白质中分离到一种抗冻蛋i ! t a f p ，其分子量为4 0k d ，p i 为9 0 ，热滞活 性为0 9 ( 2 0m e m e ) 该a f p 的n 端序列为 s d d l s f i t n k f v p c q t d i l f ，在沙冬青体内广泛分布且叶片含量较 高，可能是沙冬青抗冻生理过程中的主要物质，对于沙冬青抵御冬季冷 冻温度具有重要的作用。 1 2 2 差异杂交 差异杂交即以组织来源相同而状态不同的两种组织总e d n a 为探 针，分别与不同的e s t 克隆进行打点杂交，选出那些杂交信号有差异 的克隆。其基本原理是：分别构建有待分离的目标基因表达存在差异的 a 材料和b 材料的e d n a 文库，并用各自的总m r n a 为探针去分别筛 选两个文库，就可以分别找出在a 材料和b 材料中特异表达的e d n a 片段。包括差异显示( d i f f e r e n f i a ld i s p l a y ，d d ) 、代表性差异分析 ( r e p r e s e n t i o n a ld i f f e r e n ta n a l y s i s ，r d a ) 、基因表达指纹( g e n ee x p r e s s i o n f i n g e r p r i n t i n g ，g e f ) 、基因表达系列分析( s e r i a la n a l y s i s o fg e n e 7 沙冬青耐寒基因a m g o l s 的克隆和遗传转化研究 e x p r e s s i o n s a g e ) 和抑制性扣除杂交( s u p p r e s s i o n s u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n ，s s h ) 等。 差异显示的优点为原理简单、操作简便快捷和灵敏度高，随即被广 泛应用。国内学者利用该技术相继分离了水稻盐胁迫应答基因( 李予银 等，1 9 9 9 ) ，细胞质雄性不育表达相关基因的e d n a 片段等( 凌杏元 等，1 9 9 9 ) 。但由于其存在“假阳性”高( 可达7 0 ) 、实验室重复性 差、3 端引物倒数第二个碱基的简并性使得某些差异条纹不能被扩增 等缺点，许多研究者致力于对此技术进行改进和优化，由此产生了一系 列衍生的技术、如e d d ( e n h a n c e dd d ) 、o d d ( o r d e r e dd d ) 、 g d d ( g e n o m ed d ) 等( b r o u d e 等，1 9 9 7 ) 。c u n n i n g h a m 通过对大豆抗寒植 株和非抗寒植株的c d n a 文库的筛选，得到多个差异克隆，然后分离得 到了c a s l 5 基因，并证明c a s l 5 基因受到冷冻诱导( m o n r o ye ta 1 ， 1 9 9 3 ) 。 1 2 3e d n a - a f l p ( e d n a a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) c d n a - a f l p 技术是b a c h e m 等以a f l p 为基础发明的用于r n a 指 纹分析的方法( b a e h e me ta 1 。1 9 9 6 ) 。该技术结合了r t p c r 和a f l p 技术，分析植物m r n a 表达差异。提取植物总r n a 后，将模板m r n a 逆转录成c d n a ，两边同时利用2 个限制性内切酶进行酶切：酶切片段 同适宜接头连接，然后利用同接头互补的引物预扩增，再在引物3 末 端加2 3 个选择性碱基进行选择性扩增，最后在测序胶上展示；最终可 以获得11 3 0 - 1 0 0 0b p 间重复性好、清晰的条带( b a c h e m e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 由于p e r 反应中采用较高的退火温度，反应条件严谨，可靠性高，重复性好， 且不需要预先知道序列信息，所需仪器设备简单，可广泛应用于生物体 基因表达特性的研究。郭丽琼，林俊芳等采用单酶切c d n a - a f l p 改良 法克隆分离了十条草菇冷诱导基因片段，分别为5 0 4b p 、5 4 9b p 、5 5 5 b p 、3 0 1b p ，1 8 9b p 、6 0 2b p 、6 0 5b p 、8 3 4b p 、7 0 3b p 、1 0 8 5b p 。经 n o r t h e r n 杂交结果证明，采用c d n a - a f l p 方法所获得的差异d n a 片 段只在特定的低温处理条件下表达( 郭丽琼等，2 0 0 0 ) 。 山东农业大学硕士学位论文 c d n a - a f l p 技术特点为：( 一) c d n a - a f l p 技术重复性好， c 肼q a - a f l p 在c d n a 酶切片段两端加上统一的引物作为p c r 扩增模 板，比d d r t - p c r 反应的可靠性大为提高，其重复性可达9 5 以上。 m o n e y 等( 1 9 9 6 ) 为证实该技术的重复性，重复合成新的c d n a 并按程序 进行选择性扩增，在进行的l o 个不同m s ei 引物产生的条带中不同批 次合成的c d n a 表现结果完全一致。b a c h e r n 等进一步证实了r a p p c r ，d d - p c r 等技术对反应条件以及模板质量非常敏感。而e d n a - a f i p 对反应模叛与反应条件的要求就没有那么苛刻。( 二) c d n a a f l p 技术可准确反映基因间表达量的区别。d d p c r 与r a p - p c r 等 m r n a 指纹技术为了获得可见产物，都要求一个较低的退火温度。结果 特异扩增产物条带的强弱不仅同c d n a 样本最初浓度有关，也依赖于引 物和模板的特异配对程度。在p c r 扩增过程中，同引物配对交叉的大 量c d n a s ，与完全配对的少量c d n a 相比较，可能产生较少的扩增产 物。而c d n a - a f l p 技术由于其反应条件的严谨性，扩增产物水平完全 依赖于单个模板的浓度，这样可能为基因组的表达量提供一个可靠的结 果。b a c h e m 等( 1 9 9 6 ) 分离了在块茎形成过程中特异表达的t d f 5 3 1 ，其 与工似( 赖氨酰氧化酶基因) 高度同源。e d n a - a f l p 分析表明 f 5 3 lo 2d 低水平表达，然后稳步增至第1 0d 。这结果与n o r t h e r n 分析结果完全一致。 c d n a a f l p 技术的应用非常广泛，包括：( 一) 基因表达特性的 研究。c d n a - a f l p 可直接地研究基因表达特性。b a c h e m 等( 1 9 9 6 ) 用己 知表达模式的马铃薯贮藏蛋白s 黝丁r 8 2 基因验证c d n a - a f l p 技术研究 基冈表达的可行性，证实它可用于研究基因的时空表达模式。( 二) 遗 传标记分析。利用e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ) 作为数量性状代表位 点可提高复杂性状定位的准确性但是这种方法周期长、效率较低。 s u a r e z 等( 2 0 0 0 ) 利用c d n a - a f l p 分析木薯作图群体的一对亲本，获得 5 0 0 多个t d f s ( t r a n s c r i p t sd c r i v e df r a g m e n t s ) ，它们分别在各自的亲本中 表达，对其中5 0 个t d f s 进行克隆和分析，并将部分标记定位于遗传 图谱上。同时，对t d f s 遗传作图表明，t d f s 比随机e d n a 有更多的 多态性。另外，e d n a a f l p 还可以用于遗传群体分析，直接构建基因 9 沙冬青耐寒基因a r a g o l s 的克隆和遗传转化研究 组范围的转录图谱，c d n a - a f l p 得到的差异克隆可直接作为一个遗传 标记用于遗传分析。( 三) 分离特异表达的基因。分析基因表达差异， 寻找分子标记最终的目的是为了分离基因以及研究该基因对于生物个体 发育的影响。h a b u 等( 1 9 9 7 ) 利用单酶切c d n a - a f l p 技术，比较了普通 牵牛白花、红花两个品系的花芽m r n a 。获得2 个在两个品种中有不同 扩增条带的e d n a 片段，序列分析表明，它们从单个基因衍生而来。该 基因在红花花芽中高度表达，而在白花中不表达，并从花芽e d n a 文库 中克隆得到了全长基因。由于e d n a a f l p 高效可靠等优点( b e s s ee t a 1 ，1 9 9 8 ) ，今后在植物发育、逆境胁追反应甚至植物生理调控等基因 分离方面具有广阔的应用前景。 1 2 4 基因芯片( c h i p ) d n a 芯片又被称为基因芯片、d n a 阵列( d n aa r r a y ) 或寡核苷酸微芯 片( o l i g o n u e l c o t i d em i e r o e h i p ) 等。其基本原理是：首先将d n a 序列( 每个 序列的长度在几十个到几百个碱基的范围内) 通过光蚀刻技术与固相化 学合成相结合或自动化快速打印、喷射法将d n a 固定在固相表面组成 密集的分子阵列。它可以对基因表达水平检测：将c d n a 芯片与标记特 定组织或发育时期的m r n a 或e d n a 探针杂交，根据杂交信号的有无或 强弱，获得基因的表达信息，然后根据不同材料闻基因差异表达的信 息，推论某个基因的功能或鉴定和分离目的基因。b y e o n g - h al e e 等利用 a f f y m e t r i x 公司的拟南芥基因芯片研究了低温处理和野生状态下的拟南 芥基因组中大约2 4 ，0 0 0 个基因的转录表达。通过统计他们得至u 9 3 9 个受 冷调节的基因，其中包括6 5 5 个上调基因和2 8 4 个下调基因：然后他们又 通过该基因芯片对拟南芥野生型和i c e l 突变体的基因表达量进行对比， 说明亿e 基因调节许多激活或抑制其他冷冻诱导下调的转录因子的表 达，在冷冻诱导基因调节和对冷冻胁迫抵抗中的重要的作用( b y e o n g - h ae t a l 2 0 0 5 ) 。 分离差异表达的技术从诞生起就在科学实践中不断地被发展和完 善，随着技术的更新替代，迸一步拓宽了应用领域。不能否认每一种分 离差异表达技术都有各自的优缺点，使用时应依据不同的实验目的选用 1 0 山东农业大学硕士学位论文 不同的技术，但可以肯定，分离差异表达技术将为抗冻基因的研究揭开 崭新的篇章。 在植物的低温锻炼过程中确实发上了基因表达的改变，诱发了许多 诱导蛋白的表达，目前也有部分抗冻基因被分离和鉴定，这些信息对于 更进一步的研究冷冻调控的基因网络和通过突变分析、基因超表达以及 其它的分子和细胞生物学方法来确定冷冻诱导的基因功能提供借鉴。但 是低温胁迫下植物的响应是受基因网络调控的多基因表达共同作用的结 果，并非简单累加，植物细胞对低温的感知，胁迫信号的传递，转录因 子的诱导以及下游功能基因的调控等等这一系列的分子机理目前还不清 楚。因此，开展低温胁迫条件下冷诱导基因的差异表达、抗冻蛋白的作 用机理、转录因予基因表达诱导及其对功能基因的调控的研究，已经成 为植物分子生物学领域研究的一个前沿内容。 2 肌醇半乳糖昔合成酶( g o l s ) 基因的研究进展 肌醇半乳糖苷( g a l a e t i n 0 1 ) 是棉子糖家族植物中一种常见的成分。它 的熔点是1 1 3 1 1 4 。c ( 闭管) 、2 2 0 2 2 2 * c ( 开管，二水合物) ，旋光度 + 1 3 5 6 。( 晓0 ，水) 。它由u d p d 半乳糖在肌醇半乳糖基转移酶催化合 成。它的主要生理功能是作为生物合成低聚糖( 三、四和五糖) 的半乳糖 供体。肌醇半乳糖苷合成酶催化u d p - 半乳糖和m y o 肌糖合成肌醇半乳 糖苷的反应，该反应是蜜三糖家族的低聚糖( r a f f m o s ef a m i l y o l i g o s a c c h a r i d e s ，r f o s ) 合成的第一个关键步骤，是r f o s 厶饿的最关键的 调控步骤( l i ue ta 1 ，1 9 9 9 ) ，其代谢通路如图1 1 所示( t e r u a k ie ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。 s a r a v i t z 等( 1 9 8 7 ) 发现，r f o 家族中的水苏( 四) 糖( s t a c h y o s e ) 和棉 子糖( r a f f i n o s e ) 在冬季植株中的积累与植株在冬季冻害中的存活率有 紧密的联系。其中，不能在1 1 月份中积累大量r f o s 的植株很难在冬季 中存活。因此，g d 心基因的表达对r f o s 的积累和植株在冬季的存活起 到重要的作用( c u n r t i n g h a l l le ta 1 。2 0 0 2 ) 。t e r u a k i 等( 2 0 0 2 ) 也发现，蜜 沙冬青耐寒基因a m g o 厢的克隆和遗传转化研究 + + + + p + s 协e h y o e e 图1 1r f o s 在植物中的代谢途径( t e r u a k ie ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 f i g u r e1 1t h e m e t a b o l i c p a t h w a y o f r f o s i n p l a n t s ( t e r u a k ie t a l ，2 0 0 2 ) 三糖( r a f f i n o s e ) 和肌醇半乳糖苷在植物抵御干旱、高盐和寒冷胁迫中 起重要的作用。 l i u 等( 1 9 9 8 ) 实验证明，芸豆中的肌醇半乳糖苷合成酶在低温和 干旱环境中表达量增加。 植物通过调控编码渗透调节物质，特别是脯氨酸、甘氨酸和甘露糖 醇等物质合成基因的表达或上调其通路，使其在植物抵抗胁迫过程中发 挥作用( t e r u a k it a j i ，c h i e k oo h s u m ie ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 2 鹄 掣 驴 研f 啐 灶 钵 一麓 山东农业大学硕士学位论文 t e r u a t i 等( 2 0 0 2 ) 在拟南芥中发现了7 个肌醇半乳糖苷合成酶基因 ( a r g o 钳7 ) ，其中d t g o l s - i 和d t g o l s - 2 受干旱和盐胁迫的诱导，但是 不受冷冻诱导；而4 t g o l s - 3 受冷冻诱导，但是不受干旱和盐胁迫诱导： a t g o l s - 2 基因转化拟南芥，证明肌醇半乳糖苷合成酶基因在植物对干旱 胁迫的抵抗方面其重要作用。但是目前并没有爿t g o l s - 3 基因相关的转化 实验以及j 4 t g o l s - 3 基因在抗冻方面功能验证的报道。 b r u c ed o w n i e 等( 2 0 0 3 ) 克隆得到了番茄中的肌醇半乳糖苷合成酶 基因( l e g o l s - i ) ，发现在番茄中该基因受到干旱的诱导，但是不受低 温诱导，低温仅仅是可以延缓肌醇半乳糖苷合成酶基因表达量的减少。 3 沙冬青概述 沙冬青似m m o p i p t a n t h u sm o n g o l i c u sc h e n g ) ，又名蒙古沙冬青、蒙 古黄花木，属于豆科( f a b a c e a e ) 。沙冬青是多年生的豆科常绿灌木，高 约2 米，冠幅3 米，掌状- d , 叶，稀单叶，花期4 月。花两性，总状花 序项生，具花8 一l o 朵，花冠黄色，蝶形。苞片卵形，萼筒状，疏生柔 毛。果期5 月，荚果扁平，长椭圆形，无毛。沙冬青体细胞染色体构成 为2 n = l g ( p a na n dh u a n g ，1 9 9 3 ) 。沙冬青源于第三纪，是亚洲中部荒漠 地带唯一的常绿阔叶灌木。 沙冬青对严寒、干旱、高温、风蚀沙埋具有特殊的抗性，而且牡畜 不啃食，是改造荒漠的优良灌木和防风固沙的能手。在沙漠区大量栽植 沙冬青灌木林，可以节约水资源。而且，沙冬青本身还具有较高的园林 观赏价值。沙冬青树形优美。枝叶繁茂，四季常绿。金黄色的蝶形花早 春丌放，素有”大漠迎春花”之美称。 4 本研究的立题依据、研究意义及实验目标 温度是植物生长所必需的环境条件，而低温是限制地球上植物分布 与生长的重要因素，植物冻害每年都导致巨大经济损失，尤其在我国每 l o 年左右有一次周期性冻害。如1 9 9 9 年出现的冻害，仅广东，广西，福 建三省受冻害面积就在1 0 0 万公顷以上，受冻害作物，蔬菜，花卉经济 损失达1 5 0 亿元。由于植物抗冻性属多基因控制的抗性性状，其理化机 沙冬青耐寒基因a m g o l s 的克隆和遗传转化研究 制及遗传机理很复杂，利用常规育种手段往往难以达到定向改良的目 的，因而应用分子生物学技术进行植物抗冻性的遗传改良已成为研究热 点并取得一些成功。 沙冬青是我国西北荒漠地区睢一的超旱生常绿阔叶灌木，它长期在 恶劣生境中生长，它分布于荒漠和沙漠地区，属典型的大陆性气候条 件，气候干旱，降水量少，夏季温度常达3 5 以上，冬季常在零下2 0 - 4 0 。c ，有时甚至更低，所以在对历史环境演变的长期适应过程中，逐步 形成独特的超早生结构和抗逆机理，叶片具有厚的角质层，浓密的表皮 毛，气孔下陷，栅栏组织发达，抗旱性、抗寒性、抗热性很强，并且 还具有耐盐、耐粗砺贫瘠、抗虫、抗风沙等基质。具有丰富的抗逆基 因资源。 木本植物多具有多年生的特征，经低温驯化发展出较强的抗寒性， 所以从木本植物中分离得到的抗寒性基因，不仅效果更好，而且用于改 良林木和果树的抗冻性更为有效。 目前对于肌醇半乳糖苷合成酶基因的研究大部分数据仅局限于植物 抗旱方面和非生物胁迫条件下该基因在植株中表达分析。本研究从高度 抗冻的常绿木本植物沙冬青中分离克隆其抗冻基因肌醇半乳糖萤合 成酶基因，研究了植物低温诱导蛋白基因克隆及其理化性质与抗冻关 系，将其转化原核生物和模式植物，进一步研究其功能，从而为木本植 物的抗寒品种的培育提供有效途径和理论依据，具有应用前景。 该实验目标为： 1 通过c d n a - a f l p 的方法从中国自己的抗冻资源内蒙古荒漠地区 高度抗冻的常绿木本植物沙冬青中分离、克隆其耐寒基因。 2 通过将所克隆的目的基因转化原核生物和模式植物，进一步研究其 功能，了解其发挥抗冻作用的机理。 3 通过植株转化，使抗冻基因在作物和林木的抗寒应用上打下良好基 础；尤其为将抗冻基因用于改良林木和果树的抗冻性能提供借鉴。 1 4 山东农业大学硕士学位论文 l 实验材料及试剂 第二章材料和方法 1 1 实验材料 在冬天( 1 0 血，d e c ，一1 5 - 3 0 ) 和夏天( 尹，a u g , 2 5 ，1 2 ) 分别在 内蒙古乌海沙漠中采集当地的沙冬青材料( 叶片和茎) ，用于c d n a a m p l i f i e df r a g m e n t sl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( c d n a - a f l p ) 和r a p i d a m p l i f i c a t i o no f e d n ae n d s ( r a c e ) 。 在内蒙古乌海沙漠中取成熟的种子，种植到1 2 片叶( 约6 周) ，分 别进行4 摄氏度冻处理、干旱、盐以及a b a 处理，用于r e a l - t i m ep c r 对 于该基因的诱导表达分析。 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) c o l u m b i a ( c 0 1 生态型。 大肠杆菌菌株：b l 2 1 。 农杆菌菌株：g v 3 1 0 1 ( p m p 9 0 ) 。 载体：测序载体为：p b s - t ( t i a n g e n ) 。原核表达载体为：p e t 2 2 b ， 为遗传所8 0 2 组所有。真核表达载体为：p c a m b i a 2 3 0 0 3 5 s o c s ，由 中国科学院遗传与发育研究所5 0 2 组惠赠。 1 2 实验试剂及技术 各种d n a 内切酶、t 4d n a 连接酶及k l e n o w 酶为p r o m e g a , b i o l a b s 或t i a n g e n 产品；回收试剂盒为t i a n g e n 产品；其它实验室常用 的分子生物学及化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。 i 2 1 试剂配制 l 、酸性饱和酚：重蒸酚8 0 0 温浴至熔化，加入p h4 0 的3m 乙酸钠 震荡混匀，静止数分钟后弃水相，在加入新的p h4 0 的3m 乙酸钠 震荡，如此反复至酚的p h 降至4 3 。上层覆盖水相，4 c 避光保存。 沙冬青耐寒基因a m g o l s 的克隆和遗传转化研究 2 、8 ml i c h 称取1 9 2 6g l i c i h 2 0 ，使用0 1 d e p c 水溶解，定容 至1l ，室温放置过夜后，高压蒸汽灭菌，4 保存。 3 、3m 乙酸钠：称取2 4 6 0 9g 无水乙酸钠溶解至5 0 0m l0 1 d e p c 水中，用乙酸调p h 至5 3 ，定容至ll ，室温放置过夜后，高压蒸 汽灭菌，4 c 保存。 4 、1mt r i s c i ：3 0 3gt r i s 碱溶于1 0 0m l 水，冷却至室温后加浓盐 酸调节p h 值至8 0 ，定容至2 5 0m l ，高压灭菌，室温保存。 5 、2 0 十二烷基苯磺酸钠( s d s ) ：9 0 0m l 水溶解2 0 0g 电泳级 s d s ，加热到6 8 并用磁力搅拌器搅拌，加几滴浓盐酸调节p h 值 至8 0 ，定容至1 l ，过滤灭菌，室温保存。 6 、0 5me d t a ：4 6 5 2gn a 2 e d t a 2 1 - 1 2 0 溶于1 0 0m l 水中，5m n a o h 调节p h 值至8 0 ，补水至2 5 0m l ，湿热灭菌，室温保存。 7 、7 5 乙醇：使用烘烤过的试剂瓶和d e p c 处理过的超纯水配置，4 保存。 8 、x - g a l 贮备液：将x - g a l 溶于二甲基甲酰胺中，配成2 0m g m l 浓度 的溶液，装入玻璃瓶或聚丙烯管中，避光2 0 保存。 9 、i p t g 溶液：将lg i p t g 溶于9 m l 水中，加水定容至1 0 m l ，浓度 为1 0 0m g m l ，用0 2 2u m 的一次性滤器过滤除菌后分装，2 0 保 存。 l o 、聚丙烯酰胺凝胶电泳所用试剂： ( 1 ) 胶贮液( 5 0 0m l ，3 0 ) ：丙烯酰胺1 4 5g ，n ，n 亚甲双丙烯酰 胺5g ( 丙烯酰胺：n n 一亚甲双丙烯酰胺= 2 9 ：1 ) ，4 c 保存； ( 2 ) t e m e d ( n ，n ，n ，n 四甲基7 , - - 胺) ：分析纯，室温保存； ( 3 ) 尿素：分析纯，