（生物化学与分子生物学专业论文）毕赤酵母定向t载体的构建.pdf

捅芰 甲醇营养型巴斯德毕赤酵母最近已被越来越多的用来表达重组蛋白质。相比起哺乳 动物细胞，巴斯德毕赤酵母要更容易进行基因操作和高密度培养。同样重要的是，毕赤 酵母是一种真核生物，表达出来的蛋白质具有更好可溶性，能进行正确的折叠以及行使 生物功能所需的翻译后修饰。本研究将巴斯德毕赤酵母表达载体p h b m 9 0 5 a 改造成定向克 隆的方式，极大的提高了克隆效率。 本研究首先在毕赤酵母表达载体p h b m 9 0 5 a 基础上构建了基于l a c o 重构的定向t 载体 p h b m y e v 。载体经i i s 型限制性内切酶b 月u i 酶切后，会在3 末端产生一个突出的碱基t 。 而目的基因经过p c r 扩增得到的产物则会在3 末端带上一个突出的碱基a 。由于载体自 身带有1 3 b p 长的l a c o 序列，目的基因的引物上带有7 b p 长的片段。把载体和片段经过连 接反应后转化大肠杆菌d h i o1 3 感受态细胞，涂在加有底物x - g a l 的平板上。定向插入的 克隆将重构完整的l a c o 序列，竞争性吸附宿主菌表达的l a c i 蛋白，使宿主菌本身的b 一 半乳糖苷酶基因表达解抑制，从而降解平板上的x g a l 使得转化子显蓝色。由其它原因 得到的转化菌落不能表达t 3 一半乳糖苷酶而显白色。 另外本研究还构建了基于t 7 启动子重构策略的定向t 载体p h b m y g f p 。该载体也是使用 ii s 型限制性内切酶b f u i 酶切而在3 末端产生一个突出的碱基t ，并且自身带有9 b p 的t 7 启动子序列，而在设计目的基因引物时加上另外的7 b p 的序列。把酶切得到的载体和p c r 得到的目标基因产物连接后转化大肠杆菌r o s e t t a b l u e 感受念细胞，3 7 。c 培养一段时 间。目的克隆将重构完整的t 7 启动子，从而表达超折叠a f p 基因，重组克隆在蓝光下会 发出强烈的绿色荧光，其它的转化芮落则不能发光。 以上两个载体都经过验证，使用它们克隆p c r 产物会非常的有效率。 关键词：毕赤酵母；l a c o 重构：t 7 启动子重构；定向克隆；t 载体 a bs t r a c t t h eu s eo ft h em e t h y l o t r o p h i cy e a s t ，p i c h i ap a s t o r i s ，a sac e l l u l a rh o s tf o rt h ee x p r e s s i o n o fr e c o m b i n a n tp r o t e i n sh a sb e c o m ei n c r e a s i n gp o p u l a ri nr e c e n tt i m e s p p a s t o r i si se a s i e rt o g e n e t i c a l l ym a n i p u l a t ea n dc u l t u r et h a nm a m m a l i a nc e l l sa n dc a nb eg r o w nt oh i g hc e l l d e n s i t i e s e q u a l l yi m p o r t a n t ，p p a s t o r i si sa l s o ae u k a r y o t e ，a n dt h e r e b yp r o v i d e st h e p o t e n t i a lf o rp r o d u c i n gs o l u b l e ，c o r r e c t l yf o l d e dr e c o m b i n a n tp r o t e i n st h a th a v eu n d e r g o n ea l l t h ep o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n sr e q u i r e df o rf u n c t i o n a l i t y i nt h i ss t u d y ，w em o d i f i e d et h e e x p r e s s i o np l a s m i dp h b m 9 0 5 ai no r d e rt od e v e l o pn o v e ld i r e c t i o n a lc l o n i n gv e c t o r sw h i c h m a k et h er o u t i n ec l o n i n ge f f e c t i v e l y h e r ew ec o n s t r u c t e dad i r e c t i o n a lc l o n i n gv e c t o rp h b m y e vb a s e do nr e c o n s t r u c t i o no f l a c ob ym o d i f y i n gp l a s m i dv e c t o rp h b m 9 0 5 a t h ev e c t o rw a sd i g e s t e db yt y p el l s r e s t r i c t i o ne n z y m eb f u is ot h a tato v e r h a n gc o u l db eg e n e r a t e d i nt h em e a nt i m ep c r u s i n g t a qd n ap o l y m e r a s ep r o d u c e sa na d e n o s i n e ( a ) p r o t r u s i o na tt h e3 e n d so fi t sp r o d u c t s t h e v e c t o rw a sc o n s t r u c t e dc o n t a i n i n ga13 - b pf r a g m e n to fl a c ow h i l eat a r g e tg e n ew a sc a r r y i n g t h eo t h e r7 b pf r a g m e n to fl a c o p c rp r o d u c t sw e r el i g a t e dw i t ho u rv e c t o r , a n dt h ep r o d u c t s w e r et r a n s f o r m e di n t oe s c h e r i c h i ac o l is t r a i nd h10 1 3 ，t h e nt r a n s f o r m a n t sw e r ei n c u b a t e do n t h em e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t hx - g a l c o l o n i e sc a r r y i n gt h ec o r r e c ti n s e r ti nt h ec o r r e c t o r i e n t a t i o nw o u l dt h e r e f o r er e c o n s t r u c tt h el a c os i t e sw h i c hw o u l dc o m p e t i t i v e l yb i n dt ot h e r e p r e s s o rl a c ie x p r e s s e db yt h eh o s ts t r a i n so fw h i c ht h et r a n s c r i p t i o no fl a c zp r o m o t e rw e r e d e r e p r e s s e d t h ec o l o n yc a r r y i n gap l a s m i dw i t ht h el a c os i t ew o u l dd i s p l a yab l u ec o l o r w h i l eo t h e rt r a n s f o r m a n t sw o u l dd i s p l a yaw h i t ec o l o r w ea l s o d e v e l o p e d a n o t h e rd i r e c t i o n a l c l o n i n g v e c t o r p h b m y g f pb a s e d o n r e c o n s t r u c t i o no ft 7p r o m o t e ri nt h i ss t u d y a f t e rd i g e s t i o nb yb f u i ，ato v e r h a n gc o u l db e g e n e r a t e do nb o t he n d so ft h el i n e a r i z e dv e c t o r w ec o n s t r u c t e dt h ev e c t o rc o n t a i n i n ga9 - b p f r a g m e n to ft 7p r o m o t e ra n dt h er e s t7 一b pf r a g m e n tt 7p r o m o t e rw a sp l a c e di nt h et a r g e t g e n e t h ep c rp r o d u c t sw e r el i g a t e dw i t hb f i d i g e s t e dp h b m y g f el i g a t i o np r o d u c t sw e r e t r a n s f o r m e di n t oc o m p e t e n tr o s e t t a b l u ee s c h e r i c h i ac o l ic e l l s t h et r a n s f o r m a n t sw e r e i n c u b a t e da t37 0 cf o rs e v e r a l d a y s c o l o n i e sc a r r y i n gt h e c o r r e c ti n s e r ti nt h ec o r r e c t o r i e n t a t i o nw o u l dt h e r e f o r er e c o n s t r u c tt h et 7p r o m o t e rw h i c hw o u l dm a k et h eh o s ts t r a i n s i i e x p r e s ss f g f et h ec o l o n yc a r r y i n gap l a s m i dw i t ht h ec o m p l e t et 7p r o m o t e rw o u l de m i t f l u o r e s c e n c ew h i l eo t h e r sw o u l d n t b o t hv e c t o r sh a v eb e e nt e s t e d b yu s i n gt h e s ev e c t o r , p c rp r o d u c t sp r o d u c e db yt a q d n a p o l y m e r a s ec a nb ec l o n e de f f i c i e n t l y k e yw o r d s ：p i c h i ap a s t o r i s ；r e c o n s t r u c t i o no fl a c o ；r e c o n s t r u c t i o no ft 7p r o m o t e r ； d i r e c t i o n a lc l o n i n g ；t - e x t e n d e dv e c t o r i i i 缩略词 a m p 7a m p l i c i l l i nr e s i s t a n c eg e n e 肛gm i c r o g r a m l a l m i c r o l i t e r b p b a s ep a i r d d a y d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e d n t p d e o x y r i n e d i a m i n et r i p h o s p h a t e g f p g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n hh o u r h i s 4h i s t i d i n o ld e h y d r o g e n a s eg e n e k a n 7 k a n a m y c i nr e s i s t a n c eg e n e k b k i l o b a s e k d ak i l o d a l t o n m a nm a n n a n a s e m f d s s m g m l n m l o d p a g e p a o x i p c r s d s t a o x i s e c r e t a t i o ns i g n a lo fa m a t i n gf a c t o r m i l i g r a m m i n u t e m i l i l i t e r o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p r o m o t o ro f a l c o h o lo x i d a s eg e n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e t e m a i n a t o ro f a l c o h o lo x i d a s eg e n e 氨苄青霉素抗性基冈 微克 微升 碱基对 天 二甲基亚砜 脱氧核糖核苷三磷酸 绿色荧光蛋白 小时 组氨醇脱氢酶基因 卡那霉素抗性基因 千碱基 千道尔顿 甘露聚糖酶 0 【交配因子信号肽序列 毫克 分钟 毫升 光密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 乙醇氧化酶基因启动子 聚合酶链反应 十二烷基磺酸钠 乙醇氧化酶基囚终止子 n ，n ，n ，n 四甲基乙二 t e m e d n n ，n ，n _ t e r a m e h y le t h y l e n e d i a m i n e 胺 r m i n y n b r o t a t i o np e rm i n u t e y e a s tn i t r o g e nb a s e i v 每分钟转速 酵母氮源基础 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名： 日期：年月日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的e p 6j j 本和电子版本；学校有权保存并向国家有关部fj 或机构送交论文 的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许采片j 影印、缩印、数字化或其 它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学位论文的部分或全部 内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期： 第一部分文献综述 第一部分文献综述 1 1 巴斯德毕赤酵母表达系统 1 1 1 巴斯德毕赤酵母表达系统的构成 巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，它能够在以甲醇为唯一的碳源和能源的培 养基中快速生长。甲醇迅速诱导巴斯德毕赤酵母所合成大量醇氧化酶( a l c o h o lo x i d a s e ， a o x ) 是甲醇代谢途径的关键酶，可达细胞可溶解蛋白的3 0 【l 】。巴斯德毕赤酵母的表达 载体是整合型载体，即外源基因需整合到酵母染色体基凶组中以实现表达。典型的巴斯 德毕赤酵母表达载体包括醇氧化酶l ( a o x l ) 基因的启动子和转录终_ l 上= 子( 5 a o x i 和 3 a o x l ) ，它们被克隆位点( m c s ) 分开，外源基因可以在此插入，此载体还包含组氨酸 脱氧酶基因( h i s 4 ) 筛选标记或z e o c i n 抗性( i n v i t r o g e n 公司的专利产品) 筛选标记等。为便于 基因操作，表达载体都是穿梭型质粒，先在大肠杆菌中复制扩增，然后被导入宿主酵母 细胞，因此，载体上还有大肠杆菌质粒的复制单元及筛选标记。当整合型载体转化受体 时，它的5 a o x l 和3 a o x l 能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基 因插入到受体染色体上，外源基因在5 a o x i 启动子控制下表达。i n v i t r o g e n 公司已开发 出多种适合于胞内和胞外分泌的毕赤酵母表达载体( 图1 1 ) ，如：p p i c 3 ，p p i c 9 ，p h i l s 1 ， p p i c z a ，b ，c 系列和p p i c z a a ，b ，c 系列等【2 1 。表达系统利用醇氧化酶基因的启动子 为强诱导型启动子。存毕赤酵母中有两个基因编码a o x 。a o x l 基因严格的受甲醇的诱 导和调控，a o x 2 基因与a o x i 基因序列相似，有9 2 以上的同源性，其编码的蛋白质有 9 7 的同源性。a o x i 基因的编码产物在氧化过程中起主要作用【l 】甲醇能诱导a o x 的 合成，而甘油和葡萄糖则抑钭i l j a o x 的产生。只有去除了其它的能源和碳源后，利用甲醇 诱导才能启动a o x l 基因的转录和翻译。 澜 鎏鍪j 蒸篓 匕 参 图i 1 毕赤酵母表达载体 毕赤酵母表选系统采用两类筛选标记。类是营养缺陷型选择标记，女f l h i s 4 ，a r g 4 等。相应基因缺失的宿主菌只能在完全培养基如y p d ( y e a s l e x i m c l ，p e p t o n e d e x t r o s e ) r r _ 生长，不能在缺乏相应营养的选择培养基中生长。带有筛选标记的载体d n a 与宿主染 色体发生整台后使宿主能在选择培养基中生长，从而方便筛选。另一类是显性筛选标 记，女 j t n 9 0 3 k a n 。，即使利用全培养基也能达到筛选目的。正常情况下，宿主菌在含02 5 g 4 18 的y p d 培养基中生长受到抑制，表逃载体若含有来源于大肠杆苗转座子t n 9 0 3 的序列转化酵母后就可使转化苗株对g 4 1 8 产乍抗性，因此可筛选转化子吐 1 1 2 巴斯德毕赤酵母的受体菌 大多数应用宿主菌是通过突变改造野生型石油酵母y 一1 1 4 3 0 而米的。它们一般具有 个或多个选择标记，组氮酸脱氯酶基因( h i s 4 ) 突变而形成的营养缺陷型常作为选择标 记。根据醇氧化酶基冈缺失所造成的甲醇利用能力高低的坐化，川将宿丰饼分为卵 表 型： 图1 2 外源基因的整台方式 1 1 3 转化方法及整合方式 f 1 1m u t + ( m e t h a n o lu t i l i z a t i o np l u s ) ，含自 a o x l $ i a o x 2 ，在台甲醇的靖养基上快 速牛长，为甲醇利用快型，g s l l 5 就是 m u r 宿p 茼- i ： ( 2 ) m u t t ( m e t h a n o lu t i l i z a t i o ns l o w ) 为甲醇 利用慢型如k m 7 ，其a o x i 被酿酒酵母 的a r g 4 基凼所代替，凼此只能依赖启动 子a o x 2 ，在含甲醇培养基中慢速生长 1 4 , s i ： ( 3 ) m u t - ，2 个a o x 基因都被替代。因此在 含甲醇的培养基上不能生长，女i m c 1 0 0 - 3 菌株。口r 咀通过m d ( m d h ) 和 m m ( m m h ) 平扳筛选区分m u t s l l m u t + 表 型。s m d l l 6 3 s m d l l 6 8 等是最近外发 的类蛋白酶缺失的宿主菌可减少所表 达外源蛋白的降解，具订广泛的应用价值 n 外源基因转化毕赤酵母较为复杂，只有外源基幽整合到宿主苗基因组染色体的特定 位点h 如a o x l 或h i s 4 位点1 才能够稳定存在”，如粜转化后的重组载体未能整合到染色 体上，那么这种转化子是小稳定的，重组载体极易三失p ”】。对于巴斯德毕赤酵母而言， 表达质粒通常有以f 2 种整合方式r 图i2 1 ：一是碳位点换。含p a o x l 、外源基冈和转 录终止区的表达单位置换了基冈组染色体上完整的自功能的a o x l 基肛i ，产生的表达苗 的发型为m u ! 。，此种转化子甲醇利川率很低，f h 它表达外源基因的效率高i 。二是单位 点且换。外源荩因的表达单位通过更自f 插入椭一i 茼染包体，t 闭组 ：h i s 4 位点或a o x l 琏 吲的上游或下游，得到的转化r 表型为m u t + 。此种转化r 仍能利用甲醇 | “。转化毕靠酵 湖北大学硕士学化论文 母的常见方法有4 种：原生质体转化法、电转化法、聚乙二醇( p e g ) 法和氯化锂( l i c l ) 法。 一般说来，原牛质球和电转化法效率较高( 约1 0 3 - 1 0 4 l agd n a ) t 13 1 。电转化法简单，原生 质体法复杂，但在实验中发现用原生质体法转化形成的转化子有时能达到很高的拷贝 数。p e g 方法并i l i c l 方法很简单，但转化效率较低，且不易形成多拷贝【1 4 】。 1 1 4 外源基因的表达方式 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白有胞内表达和胞外分泌型表达2 种方式，这与表达载 体的选择及其构建时是否带有信号肽有关。 1 1 4 1 重组蛋白的胞内表达 适宜于通常在胞浆中表达或不含二硫键的非糖基化蛋白，较胞外分泌水平高，但产 物纯化较为复杂【l5 1 。对于那些易于降解的不稳定蛋白或具有毒素活性及对宿主菌有毒害 作用的蛋白，可以将它们存储于甲醇酵母细胞内的特异性细胞分隔过氧化物酶体中。研 究表明，胞内表达蛋白分选人过氧物酶体的作用主要与靶信号p i s l 矛i p i s 2 有关，它们可 与表达蛋白结合，帮助蛋白前体从胞浆进入过氧化物体。研究证实，有一种含甲硫氨酸 的蛋白质通过p t si 信号转运入过氧化物酶体后，半衰期由胞浆中的2 0 m i n 提高到 1 4 0 m i n 。 1 1 4 2 重组蛋白的胞外分泌 表达蛋白被分泌到培养基中，而酵母自身分泌的蛋白很少，因而非常利于纯化。在 分泌过程中，可进行蛋白质的翻译后加工，有助于形成有活性天然构象，包括前体蛋白 的成熟、二硫键的重建、蛋白构象的正确折叠、适度的糖基化修饰。分泌型表达可利用 目的基因自身的信号肽，也可利用酵母自身的信号肽如磷酸酶( p h 0 1 ) 、转化酶 ( i n v e r t a s e ) 1 6 1 和q 因子，其中q 因子使用最为广泛 1 7 1 9 1 。 1 1 5 启动子的选择 巴斯德毕赤酵母表达系统最常用的启动了是来源于巴斯德毕赤酵母醇氧化酶 ( a l c o h o lo x i d a s e ，a o x ) 基因的启动子。巴斯德毕赤酵母可利用a o x l 丰i a o x 2 基因编码醇 氧化酶，但细胞中醇氧化酶活性以a o x l 基冈编码的产物为主。甲醇可严格调控和诱导 a o x i 基冈的表达，以甲醇为碳源进行摇瓶培养时，a o x i 基吲编码的醇氰化酶可达细胞 可溶性蛋白总量的5 ，用发酵系统培养时可达到或超过细胞可溶性蛋白总量的 3 0 2 0 , 2 1 】。a o x l 基因表达水平的调控发生在转录水平，以甲醇为碳源生长的细胞能检测 4 第部分文献综述 至i j a o x l 基因的转录( 占总m r n a 的5 ) ；而在其它碳源中生长的细胞则检测不至i j a o x i 转 录的信息，据此可用甲醇诱导巴斯德毕赤酵母表达外源目的蛋白。a o x l 基因存在抑制 去抑制和诱导两种调控机制：培养物中抑制物( 如葡萄糖) 去除后，并不能使a o x l 基因大 量转录，只有在甲醇诱导下，a o x l 基因才能大量转录。虽然利用a o x l 基因已成功表达 了多种外源蛋白，但此基因表达系统不适用于食品生产；此外，发酵培养时由于添加大量 甲醇还存在火灾隐患。因此，不以甲醇为唯一诱导物的启动子具有更大吸引力，目前已研 制成功的主要包括：g a p ，f l d l ，p e x 8 和y p t l 启动子。研究证实：巴斯德毕赤酵母3 磷酸 甘油醛脱氢酶基因( g l y c e r a l d e h y d e s 一3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，g a p ) 的启动子( e 1 g a p 启动子) 口2 】在葡萄糖的诱导下，能提供与a o x l 启动子水平相当的连续性表达，在培养过程 中不需更换碳源，操作更为简便。但g a p 启动子的连续性表达不适用于对酵母具有毒性 作用蛋白的生产。甘油或甲醇也可激发g a p 启动子，但g a p 产量分别是葡萄糖诱导条件 下的2 3 和1 3 。巴斯德毕赤酵母谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶( g l u t a t h i o n e d e p e n d e n t f o r m a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ，f l d ) 基因的启动子( e 口f l d l 启动子) ，在甲基化胺为氮源( 葡 萄糖为碳源) 培养条件下，能够提供与a o x l 启动子水平相当的表达。在甲醇为碳源( 硫酸 铵为氮源) 的培养条件下，也可诱导f l d i 启动子表达目的蛋白。研究发现，某些外源基 因可因被启动的表达水平过高，而导致目的蛋白折叠失准，加工无能或定位错误。上述 a o x l ，g a p 或f l d l 启动子即为导致外源基因过高表达的启动子。为扩大外源基因的有 效表达，某些能够启动基因柔和表达的启动子如p e x 8 和y p t l 启动子，已从巴斯德毕赤酵 母中分离获得。 1 1 6 外源蛋白的糖基化作用 巴斯德毕赤酵母对分泌的外源蛋白具有糖基化作用，可通过n 连接使寡糖链与外 源蛋白肽链糖基化识别位点( a s n x s e r t h r ) 天冬酰胺一卜的氮原子( n ) 共价结合【2 3 2 4 1 ；也 可通过o 连接使寡糖链与外源蛋白肽链丝氨酸苏氨酸上的羟基( o h ) 共价结刽2 5 2 6 】。高 等真核细胞在其分泌的外源蛋白上所添加的寡糖链含n 乙酰半乳糖胺、半乳糖和唾液酸 【2 刀；而低等真核细胞如巴斯德毕赤酵母在其分泌的外源蛋 j 上所添加的寡糖链只含甘 露糖【2 8 - 3 0 】。值得注意的是：有些天然分泌时不被糖基化的蛋白，由巴斯德毕赤酵母表达时 却可能发生糖基化。如人体内合成的胰岛素样生长因子i 为非糖基化蛋白，而由巴斯德毕 赤酵母表达时，却有1 5 发生了糖基化作用【3 1 | 。此外，巴斯德毕赤酵母为其外源蛋白添加 湖北人学硕士学位论文 寡糖链时，所选择的丝氨酸和苏氨酸有时也与天然宿主细胞不一致。 巴斯德毕赤酵母对外源目的蛋白的糖基化作用具有以下两个主要特征：极少出现 过度糖基化，可避免外源蛋白产生过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠 而影响其功能。糖链中不含具有潜在致敏作用的q 1 ，3 甘露糖，使用安全。 1 1 7 影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达的因素及 优化策略 虽然毕赤酵母表达系统已经引起广大研究者的关注，但在实际应用和生产中，实现 在毕赤酵母表达系统中高效生产外源蛋白还受多方面因素的影响。 1 1 7 1 宿主茵的影响 有些宿主菌的转化子是m u t 8 表型，如l 洲7 1 转化子；有些是m u t + 表型，女i ： g s l l 5 转 化子。哪一种表型对外源蛋白的表达量更高，对每一种蛋白而言是不确定的，因此在 m u t 8 表型的菌株中表达水平较低时，可以尝试用m u t + 表型的菌株来表达【3 3 , 3 4 。另外，选 择具有强启动子，带有抗性标记、多拷贝筛选标记【”】、蛋白水解酶缺失的宿主菌，既利 于操作又利于高效生产外源蛋白。 1 1 7 2 表达载体的影响 应用毕赤酵母表达外源蛋白时既可选择胞内表达载体，又可选择分泌型表达载体。 一般而言，对于非分泌蛋白采用胞内表达载体，而对于正常分泌蛋白则选择分泌型载体， 这样更有利于表达产物的分离纯化。毕赤酵母载体中最常用的启动子为甲醇诱导性很强 的a o x l 启动子，由它控制的外源基冈通常能得到高效表达。 1 1 7 3 外源基因自身的影响 外源基因的特性是决定表达成败的首要因素。( a + t ) 含量高的基因在毕赤酵母中表 达时有时会造成转录提前终止而不能有效转录 3 5 , 3 6 , 3 7 】。因此对( a + t ) 含量丰富的基因， 最好是再= 新设计序列，使其( a + t ) 含量在3 0 - - - 5 5 范围内。某些稀有密码子，尤其是 稀有密码子密集区往往也成为制约翻译速率的冈素，所以应该使稀有密码子突变为酵母 所偏爱的密码子来提高表达效率，对这些偏好密码子的使用程度和基因表达水平成正 比。因此，要得到高效表达，最好对外源基因进行改造，选用甲醇酵母偏好的密码子【3 8 , 3 9 ， 尽量使m r n a 5 非翻译区的核苷酸序列和长度与醇氧化酶的相似。 外源蛋白的窄间构象、糖基化位点、水溶特性、氨基酸组成以及其他的理化特点都 会影响毕赤酵母对其分泌，所以应根据外源蛋白自身的理化特点来选择胞内表达或分泌 6 第一部分文献综述 型表达方式。外源基冈在酵母基因组中的整合数也可以影响外源基因的表达水平，应该 选用高拷贝整合来提高外源基因的表达水平。 1 1 7 4 培养条件的影响 培养条件主要包括培养基、通气型4 0 1 、甲醇含量【4 、p h 值、培养时问、培养温度 4 2 , 4 3 等。培养基主要对生物量和诱导表达有影响。在培养基中添加特殊的营养物质( 如添加 限制氨基酸；在表达含有金属的酶时，在培养基中添加金属元素) ，能提高一些特殊蛋 白的表达水平。充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达极其重要，应该保持高通气 量。实验室里在三角瓶中培养时可以加人适当的缓冲液调整p h 值，以保持最高程度的通 气量来满足诱导表达的需要。甲醇诱导的方式、用量、诱导时间都会影响外源蛋白的表 达水平。在诱导期间每天应往培养基中补加甲醇，以弥补甲醇的消耗和蒸发；但由于培 养条件和转化子表型不同，添加甲醇的量也有所不同，一般添加量为培养基体积的0 5 1 。诱导时问过短则表达量很低，过长则外源蛋白的降解增加，应根据菌株的需 要选择合适的诱导时间，一般诱导时间在1 5 0h 左右。另外，甲醇诱导表达时，培养温度 不宜超过3 0 。 1 1 7 5 转化方法及阳性转化子的筛选鉴定 因为表达单位的不一整合方式、拷贝数、阳性转化子、表达晕的特异、快捷鉴定方 法对获得高表达株具有重要意义，所以应采用既操作简便又可提高转化率和表达单位拷 贝数的方法来转化，具体选择哪种方法应根据实验条件具体选择常用的4 种转化方法中 的一种。小量摇瓶试验是筛选转化子简便而有效的方法。但是摇瓶培养中表达外源蛋白 的水平往往不能准确反映发酵罐中的情况，为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵 罐培养条件实验，现在可用s c m 摇瓶技术来筛选阳性转化子。 1 1 7 6 信号肽的影响 分泌表达既町以减轻宿主细胞代谢负荷，又可减少宿主细胞蛋白酶对外源蛋白的降 解，是一种理想的蛋白质生产方式。分泌表达既可利用外源蛋白自身信号肽又可利用酵 母菌的。因子信号肽来表达外源蛋白，如果自身的信号肽序列效果不佳则可尝试用甲醇 酵母的信号肽。如果外源基因产物不能分泌到体外，则可将产物连上一个定向肽，使其 定向运输到过氧化物酶体中，以免产物积累对宿主细胞造成毒害，同时产物自身的稳定 性也会大大增强。另外，还有一个问题是信号肽加工不完全，其表达的外源基因产物常 比设计的多几个氨基酸残基，这可能是酵母自身调节机制对外源基因高表达的应答反 应，此问题可以通过定向缺失诱变来解决。 巴斯德毕赤酵母表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题，也不存在 湖北大学硕士学位论文 哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题，并能够对月的蛋白进行类似高等真 核牛物的翻译后蛋白加工，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。随着对巴斯德毕 赤酵母表达系统的研究的广泛深人，该表达系统也将更完善。相信在将来的理论和实践 中，如在分了生物学基础研究、基因工程产品开发、生物催化剂、生物制药等诸多应用 领域中也必将发挥巨大作用。 1 2 克隆方法概述 基因工程发展到今天，已经有了很多d n a 克隆的方法，该法按照是否需要连接酶 分成两类：( 1 ) 依赖连接酶的克隆方法是经典的克隆方法，主要分为以下两种：1 ) 粘隍末 端连接m 】，载体质粒和待插入的外源片段都通过合适的限制性内切酶切割，产牛相瓦匹 配的粘性末端，其互补末端通过连接酶作用，重新形成磷酸二酯键而得到环化的重组质 粒；2 ) 平末端连接【4 5 1 ，平末端连接中，载体和片段均为平端，都没有粘性末端突出。其 优点是步骤简单，不需要多次酶切，但是克隆效率较低，而且不能实现定向克隆。总的 来说，依赖连接酶的克隆方法简单高效，是克隆单个基因的常用的方法。其不足之处在 于：1 ) 插入片段要经过限制性内切酶处理，这样在实验设计时就要考虑目的基冈的d n a 序列，不能实现多基冈的平行操作，不适合高通量；2 1 该过程使用连接酶，一方面延 长了实验剧期，另一方面也会带来载体自连背景，增加了筛选工作量。 重组质粒的构建并不一定是都要依赖于连接酶作用，通过位点特异性重组或其他 方式也能达到同样的目的，据此而发展出的方法称为不依赖连接酶的克隆方法。主要有 如下几类【4 6 】： 1 2 1g a t e w a y 克隆系统 g a t e w a y 克隆系统是i 扫i n v i t r o g e n 公司开发的商业化克隆的模式。它利用体外九噬菌 体i n tf a m i l y 的特异性重组而实现定向基因克隆。g a t e w a y 克隆系统有入口载体和表达载 体两套系统。入口克隆通过载体年 i p c r 片段在重纽酶介导a t t b 千t l a t t p 之间的特异性同源重 组而实现。目的基因向表达载体的转移则通过类似的同源重组l r 反应来完成。 第一部分文献综述 a + a t 吐， + b pc l o n a s e - - ， n l rc i o n a s e 1 2 2c l o n t e c h 克隆系统 甜t t 2 图1 3g a t e w a y ：克隆系统4 6 a t 值2 c l o n t e c h 公司首创了一种以噬菌体p l 的位点特异性重组和c r e l o x 系统为基础的克 隆方法，它也具有有入口载体和表达载体两套系统。入口克隆使用c l o n t e c h 的专利酶通 过1 5 b p 同源区序列介导的克隆。具体过程为，设计扩增目的基因的引物时，在引物末端 加上1 5 个碱基与载体同源，则共转化到细菌时，可顺利转化生成重组质粒。目的基因向 表达载体的转移c r e l o x 位点特异性重组米实现。 9 湖北人学硕十学位论文 b 甓。 、 钳獬j 槲 v 钿r e ( ；o m ，b i ? 。= 、悔 ! 絮o 3 、。一，黝 麓耐、w 7 二。 、慧咿、，麓 二艾 图1 4c l o n t e c h 克隆系统1 4 6 i 1 2 3u n i v e c t o r 克隆系统 u n i v e c t o r 克隆系统由美匡 b a y l o r 医学院s t e p h e ne l l e d g e 实验室发展起来的克隆系统。 该系统采用体p c r e l o x 位点特异性重组从主克隆和表达载体产生单一的共整合的表达 质粒。u n i v e c t o r 入口克隆载体的复制点来自质粒r 6 k ，它只能在表达p i r 蛋白的大肠杆菌 中复制。这样在目的基因向表达载体转移时，能有效的淘汰未发生转移的入口克隆载体。 u n i v e c t o r 系统在大肠杆菌、细菌、酵母、昆虫、哺乳动物等宿主上都有应用。 + f e c o n b 钿a s e m 一厂一、 知w 螂。 二i 峭亨) ?、 t 锕 。一，蛳 图1 5u n i v e c t o r 克隆系统4 叫 1 0 、，槲 一 一 甜 嘲 ， “ 嘶 蝌 雌厂艾 7 ： 第一部分文献综述 1 2 4l i g a t i o ni n d e p e n d e n tc l o n i n g ( l i c ) 系统 这是一种不依赖于d n a 连接酶，也不需要体外特殊重组酶处理的一种高效克隆方法 f 4 7 。5 0 】。在l i c 系统中，线性化的载体和p c r 片段经t 4d n a 聚合酶的3 5 外切核酸酶活性 处理，产生长的特异性互补的1 0 1 5 b p 粘性末端。两者在体外条件下孵化，互补的粘性 末端退火形成环状分子，经转化进大肠杆菌细胞后，细菌的修复系统修复这些突出和缺 口而得到正确重组子。插入片段和载体均用p c r 方式获得，然后用t 4d n a 聚合酶处理， 体外退火后直接转化大肠杆菌得重组质粒。在此基础上，此后的研究中发展出了利用限 制性内切酶消化使载体线性化，然后经t 4d n a 聚合酶处理以产生长的粘性末端，这样 的方式可以避免p c r 过程中载体上产生突变。这个过程中，载体的两粘性末端彼此无同 源性，也没有使用连接酶，因而载体自连背景低， 1 3t 载体构建 目前有许多种商业载体用于刁同类型d n a 片段的克隆。有的载体主要依靠于限制性 酶切位点用于定向克隆外源片段。普遍的方法是在每个引物中引入适当的限制性内切酶 位点，通过用相应的限制性内切酶处理载体和外源片段。从而在载体和外源片段末端形 成单链互补尾巴，以此定向插入外源片段。另一种方法叫做t a 克隆，该方法使用一个 被命名为t 载体的质粒用于外源片段的引入，该载体在其线性质粒d n a 的3 末端连接有 一个胸腺嘧啶残基( 3 t ) ，因此允许以a 结尾p c r 产物插入。该策略利用了某些嗜热性 d n a 聚合酶的末端转移酶活性t a q 聚合酶具有优先添加单个腺嘌呤残基到双链d n a 分 子的3 末端的非模板依赖活性，因此绝大多数由t a q 聚合酶p c r 扩增而来分子均拥有单个 3 a 残基【5 1 1 。t 末端载体d n a 可以通过利用t a q 聚合酶或者末端脱氧核苷转移酶( t d t ) 和 脱氧胸腺嘧啶核苷三磷酸( d t t p ) 在任意平末端载体形成单个3 t 残基而获得【5 2 1 。已有许 多报道应用限制性内切酶x c m i 构建克隆或表达t 载体的方法 5 3 - 6 3 】该限制性内切酶的独 特特征是可以人工创造3 t 末端。所有这些载体的共同点是在一个初始载体中引入两个 x c m i 限制性内切酶识别位点这是通过在初始载体中插入一个含有两个相q b x c m l 识别 位点的人工合成d n a 片段或捅入一个和两端分别携带有一个x c m l 识别位点的媒介 d n a 片段而获得的。使用x c m i 切割这些衍生质粒便将获褂在其3 末端带有单个胸腺嘧啶 核苷的线性载体。 湖北大学硕士学位论文 1 4i i s 型限制性内切酶 所谓的i i s 型酶，i ：l 女 i f o ki 和a l wi ，它们在识别位点之外切开d n a 。这些酶的大小 居中，约为4 0 0 6 5 0 个氨基酸左右；它们识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点 的域和一个专门切割d n a 的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到d n a 上， 但与临近的酶结合成二聚体，协同切开d n a 链。因此一些i i s 型的酶在切割有多个识别 位点的d n a 分子时，活性可能更高。 1 5 本研究的目的 随着p c r 技术的发展和普及，克隆p c r 产物已广泛应用于分子生物学的各个领域。 通常p c r 产物不具有粘末端，只能进行平末端连接的克隆，由于t a qd n a 聚合酶具有 非模板依赖性末端转移酶活性，能在两条d n a 链的3 末端加上一个多余的碱基，致使平 端连接的效率不高，克隆效率低。改进的方法一般是在p c r 引物的5 端加上限制性内切 酶识别序列，或是改变引物中l 至数个核苷酸引入限制酶位点，然后用相应的酶处理p