（药剂学专业论文）盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒的制备及脑靶向研究.pdf

摘要 盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒的制备及脑靶向研究 摘要 固体脂质纳米粒( s o l i dl i p i dn a n o p a r t i c l e s ，s l n ) 是2 0 世纪9 0 年代初 发展起来的继乳剂、脂质体、微粒和毫微粒后，新一代的性能优越的亚微粒 给药系统，粒径在1 0 1 0 0 0n m ，具有聚合物纳米粒物理稳定性高、药物泄漏 少的优势，又兼有脂质体、乳剂毒性低、能大规模生产的优点，是一种极其 有发展前景的给药系统。本课题以盐酸氟桂利嗪( f l u n a r i z i n eh y d r o c h l o r i d e ， f n z ) 为模型药物，将其制备成f n z - s l n ，研究其各项物理化学性质，以此 为基础进行s l n 脑靶向方面的研究。 课题以硬脂酸为载体材料，以大豆磷脂和泊洛沙姆( p o l o x a m e r1 8 8 ) 为 乳化剂，采用溶剂乳化低温固化法制备了盐酸氟桂利嗪固体脂质纳米粒 ( f n z - s l n ) 。以包封率为主要评价指标，其中以s e p h a d e xg - 5 0 葡聚糖凝胶 法分离纳米粒与游离的药物，测定f n z - s l n 包封率，通过单因素考察，并用 正交设计优化了处方及制备工艺。 在透射电子显微镜( t e m ) 下观察用最优处方及制备工艺制备出的 f n z - s l n ，固体脂质纳米粒为球形或类球形实心固体，粒径1 4 1 n m ，包封率 为8 1 3 + 1 5 3 ，载药量为1 5 7 i - 0 0 2 。 以外观、粒径、包封率等为指标，对f n z - s l n 的物理化学稳定性、药剂 学特性等进行了考察，并对f n z - s l n 的体外释放进行了初步考察，通过对释 放曲线的拟合，其释放规律符合w e i b u ! ! 分布函数。 i 河南大学硕士学位论文 杨栋 以自制的盐酸氟桂利嗪水溶液为参比制剂，通过对小鼠进行尾静脉注射 给药，对小鼠体内的血浆及组织分布进行了初步研究，结果表明f n z - - s l n 提 高了f n z 在脑组织及肺组织的分布，其中脑组织的d t i 为1 8 巧3 ，显示出 在脑部有显著靶向性。 关键词：盐酸氟桂利嗪；固体脂质纳米粒；包封率；脑靶向 i i a b s t r a c t s t u d yo np r e p a r a t i o no f f l u n a r i z i n eh y d r o c h l o r i d e s o l i dl i p i dn a n o p a r t i c l e sa n di t sb r a i nt a r g e t i n g a b s t r a c t s o l i dl i p i dn a n o p a r t i c l e s ( s l n ) w h i c hw a sd e v e l o p e di nt h ee a r l y9 0 s ，2 0 t h a f t e re m u l s i o n 、l i p o s o m e s 、m i c r o p a r t i c l e sa n dm i l i m i c r o np a r t i c l e sw a san e w s u b m i c r o p a r t i c l ed r u gd e l i v e r ys y s t e mo fg o o dp e r f o r m a n c e s i t ss i z er a n g e sf r o m 1ot o10 0 0 m m i th a st h ea d v a n t a g e so fh i g i ls t a b i l i t y , l o wl e a ko fd r u g s ，a n dl o w t o x i c i t ya n dm a n u f a c t u r e do nal a r g es c a l ea sw e l la sl i p o s o m e sa n de m u l s i o n s l ni sap o t e n t i a ld r u gd e l i v e r ys y s t e m f l u n a r i z i n eh y d r o c h l o r i d e ( f n z ) w a s u s e da sam o d e ld r u gi n t h i sp a p e r i th a sb e e np r e p a r e di n t of n z - s l nt o i n v e s t i g a t ei t sp h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e si no r d e rt os t u d yb r a i nt a r g e t e da s p e c to f s u n s t e a r i ca c i dw a su s e da sc a r r i e r , g r a n u l e s t e na n dp o l o x a m e r18 8a ss u r f a c t a n tt o p r e p a r ef n z - s l nb ye m u l s i o n - e v a p o r a t i o n s o l i d i f i e da tl o wt e m p e r a t u r ep r o c e s s t oe v a l u a t ei tm a i n l yb ye n t r a p m e n tr a t e s e p a r a t ew r a p p e da n df r e ed r u g sb y s e p h a d e xg 一5 0 ，d e t e r m i n et h ee n t r a p m e n tr a t ea n do p t i m i z et h ef o r m u l aa n d t e c h n i q u eb ys i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a ld e s i g n f n z - s l nw h i c hw a sp r e p a r e db yt h eo p t i m u mf o m u l aa n dt e c h n i q u ew a s e x a m i n e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e i t sm o r p h o l o g yw a ss p h e r i c i t yo r n e a rs p h e r i c a ls o l i d t h em e a nd i a m e t e ro ft h ep a r t i c l e sw a sa b o u t1 4 0 n m ， i i i 河南大学硕士学位论文杨栋 e n t r a p m e n tr a t ew a s81 3 + 1 5 3 ，d r u gl o a d i n gr a t ew a s1 5 7 i - 0 0 2 t h e p h y s i c a la n d c h e m i c a l s t a b i l i t y , p h a r m a c y c h a r a c t e r i s t i c so ft h e f n z s l nw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n df n z s l nr e l e a s ei nv i t r ow e r ep r e l i m i n a r y i n v e s t i g a t e db yt h ei n d e xo fa p p e a r a n c e ，s i z e ，e n c a p s u l a t i o nr a t e b yf i t t i n gt h e r e l e a s ec l l r v ew ec a nk n o wt h er e l e a s ec u r v ei n l i n ew i t hw e i b u l ld i s t r i b u t i o n f u n c t i o n t h er e f e r e n c e p r e p a r a t i o n w a ss e l f - m a d ef l u n a r i z i n e h y d r o c h l o r i d e s o l u t i o n t h em i c ew e r ei n j e c t e dt h r o u g ht h et a i lv e i n ，b l o o d e dt h r o u g he y e b a l l ， k i l l e da n dp u t t e do u to ft h e i rm i n d sa n dv i s c e r a m a k i n gp r e l i m i n a r ys t u d yo ft h e p l a s m aa n dt i s s u ed i s t r i b u t i o n t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ef n z s l ni n c r e a s e dt h e d i s t r i b u t i o no ff n zi nb r a i na n dl u n g ，t h ed t io fb r a i ni sf r o m1 8t o5 3 ，s o f n z - s l nh a so b v i o u sb r a i nt a r g e t i n g k e y w o r d s ：f l u n a r i z i n eh y d r o c h l o r i d e ；s o l i dl i p i dn a n o p a r t i c l e s ；e n c a p s u l a t i o n e f f i c i e n c y ；b r a i nt a r g e t i n g ； i v 关于学位论文独立完成和内容创新的声明 本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明：所呈交番勺学位论文是 本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除 文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰 写过的研究成果。也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学住或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 学位串请夸c 擘住论文作者) ，荟名：主塑拯1 二 翻转牟s 慵妻7 日 关于学位论文著作权使用授权书 拳人经河南大学审核批准授予硬士学位。作为学位论文的作者，本人完全 了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文百自要求，即河南大学有权向国家 图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文( 纸质文 本和电子文本) 以供公众检索、查阎t 本人授权河南大学出于宣扬、展览学校 学术发展和进行学术交流等目的扒可以采取影印7 、缩印、扫描和拷贝等复制手 段保存、汇编学恼论突( 纸质文本和电子文本) 。 ( 涉及保密硝容的学位论文在解密后适用本授权书) 学位获得者( 学位论文作者) 签名：扬挞 ：2 0l o 年s 月3j 日 学位论文指导教师签名： 2 0i 己形沙 。牟弋月il 日 前言 1 上一j - 日u 舌 随着社会人口老龄化的不断增长，在老年人中常见的如短暂性缺血性发 作，脑血栓，脑栓塞等疾病发生率日益增加，脑血管病是导致人类死亡的三 大疾病之一，在全球范围内，每年使4 6 0 万人死亡，其中1 3 在工业化国家， 其余发生在发展中国家，患病和死亡主要在6 5 岁以上的人群【l 】。日本是脑卒 中发病率、死亡率最高的国家之一，脑血管病死亡率一直居死因之首。我国 也是脑卒中死亡率高发地区，据估计居民现患脑血管病6 0 0 万，每年新发生 脑血管病1 3 0 万人、死亡近1 0 0 万人，在幸存者中约3 4 的人留下偏瘫等后遗 症状，部分病人丧失劳动能力和生活能力【2 1 。 由此，脑血管病防治任务愈发突出，在多年的脑血管疾病的研究过程中， 人们认识到钙离子在脑血管病病理中的重要作用：扩张脑血管，增加脑血流 量，血管平滑肌的收缩和舒张，主要依赖于肌浆中钙离子的变化，而肌浆中 钙离子的浓度，取决于细胞外钙离子流入的多少。当肌浆内钙离子的浓度升 高达到一定水平( 大于1 0 。7 摩尔) 时，通过钙和钙调素相结合，并激活肌凝蛋 白，促使与肌动蛋白相互作用，最终导致血管平滑肌收缩。如果流入的离子 过多，血管即发生持续性痉挛，这种异常情况如发生在脑血管，轻者发生短 暂性脑缺血，重者导致脑梗塞，钙离子拮抗剂能阻滞钙离子跨膜内流，从而 可消除或缓解平滑肌收缩，使脑血管扩张，血流量增加。 本研究所使用的模型药物盐酸氟桂利嗪( f l u n a r i z i n eh y d r o c h l o r i d e ，f n z ) 是一种常用的钙离子拮抗剂，为白色或类白色结晶或结晶性粉末；无臭，无 河南大学硕士学位论文杨栋 昧。在甲醇或乙醇中略溶，在氯仿中微溶，在水中极微溶解，在苯中几乎不 溶。其化学名称为：( e ) 1 - 双( 4 - 氟苯基) 甲基】_ 4 - ( 2 丙烯基- 3 - 苯基) 哌 嗪二盐酸盐。其化学结构式如下： f f 2 h c i h f n z 能防止因缺血等原因导致的细胞内病理性钙超载而造成的细胞损 害，可以治疗脑动脉缺血性疾病，如脑动脉硬化，脑血栓形成和脑血管痉挛， 而且还能缓解血管痉挛，对血管收缩物质引起的持续性血管痉挛有持久的抑 制作用，尤其对基底动脉和颈内动脉最为明显。 市面上的盐酸氟桂利嗪制剂主要有片剂、胶囊，这些制剂均存在导致胃 部烧灼，胃纳亢进，皮疹，口干等不良症状，将f n z 制成脑靶向制剂，让其 直接作用于脑部，可以降低非靶向部位的药物分布，减轻毒副作用。固体脂 质纳米粒( s o l i dl i p i dn a n o p a r t i c l c s ，s l n ) 脚相容的高熔点脂质为骨架材 料，在室温下通常为固体，因此s l n 既有聚合物纳米粒的稳定性高、药物渗 漏慢等优势，又具备了脂质体、乳剂的低毒性等优点，而且s l n 还可以达到 缓释或靶向等作用f 3 1 。 研究路线：首先建立f n z 分析方法，然后选择合适的载药脂质、乳化剂 等辅料及选择适合本研究的s l n 制备方法，最后将制各出的f n z s l n 进行 质量评价和动物实验，以对其靶向性进行初步研究。 2 第一部分f n z 分析方法的建立 第一部分f n z 分析方法的建立 1 仪器和材料 1 1 仪器 w f z 2 6 a 型紫外可见分光光度计( 天津光学仪器厂) p 2 3 0 高效液相色谱仪( 大连依利特分析仪器有限公司) a t - 3 3 0 柱温箱( 天津奥特塞斯仪器有限公司) e c 2 0 0 0 色谱工作站( 大连依利特分析仪器有限公司 色谱柱：o d s c 1 8 柱，2 0 0 m m x 4 6r a i n ( 大连依利特分析仪器有限公司) a g 1 3 5 s 型电子分析天平( 瑞士梅特勒托利多) y p 6 0 0 型电子天平( 上海第二天平仪器厂) k s 2 5 0 d 超声波清洗仪( 宁波科生仪器厂) s z 9 3 型自动双重纯化水蒸馏器( 巩义市英峪予华仪器厂) 1 2 材料 盐酸氟桂利嗪( 郑州康瑞制药有限公司，批号2 0 0 8 1 0 0 2 ) 色谱甲醇( 天津市福晨化学试剂厂，批号2 0 0 7 0 8 0 4 ) 其余试剂均为分析纯 2 方法与结果 2 1 测定波长的选择 将f n z 用甲醇溶解，配制成2 0 9 9 m l f n z 甲醇溶液，用紫外分析仪扫 描其在2 0 0 5 0 0 n m 波长范围内的吸收图谱。如图1 1 所示，f n z 在2 5 3 n m 和 3 河南大学硕士学位论文杨栋 2 2 6 n m 处有最大吸收峰。两个峰高相近，但在2 2 6 n m 处，测定时干扰因素较 多，所以选择2 5 3 n m 为检测波长。 2 2 含量测定 2 2 1 色谱条件【4 1 图1 1f n z 甲醇溶液紫外吸收扫描图 f i g l - lu vs p e c t r o g r a m0 f f n z s o l u t i o n 色谱柱：o s d c 1 8 柱，( 2 0 0 m i n x 4 6 m m ，5 i t m ) ，流动相：甲醇0 4 - 一- - 7 , 胺 的磷酸盐缓冲液( 7 5 ：2 5 ) ；流速：1 0 m l r a i n l ；检测波长：2 5 3 n m ；进样量：2 0 1 x l 柱温：3 0 0 c 。在此条件下，f n z 峰形良好，见图1 2 4 第一部分f n z 分析方法的建立 暑 图1 - 2f n z 色谱图 f i g1 - 2t h ec h r o m a t o g r a mo ff n z 2 2 2f n z 标准溶液的制备 精密称取干燥至恒重的f n z2 5 0 m g ，用少量流动相溶解，转入2 5 0 m l 容 量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，即得浓度为0 1 m g r a l 。的f n z 贮备液。 精密量取f n z 贮备液1 0 0 m l ，转入5 0 m l 容量瓶中，用流动相定容至刻 度，摇匀，得到2 0 o p g m l 。1 的f n z 溶液。 2 2 3 标准曲线的制备 精密量取2 0 i - t g m l 1 的f n z 溶液0 2 5 、0 5 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、6 0 m l ， 分别置于1 0 m l 容量瓶中，用流动相定容至刻度，即制成浓度为0 5 、1 、2 、4 、 6 、8 、1 2 j a g m l 。的供试液，进样2 0 9 l 记录色谱图，数据见表1 1 。 河南大学硕士学位论文杨栋 表1 1 标准曲线数据 以峰面积a 为纵坐标，以标准溶液浓度c 为横坐标，进行线性回归，得 回归方程：a - 3 9 4 8 2 c + 1 8 3 1 1 ，相关系数r - - 0 9 9 9 7 ，线性范围：0 5 1 2 9 9 m l 一。 标准曲线见图1 3 。 6 0 0 5 0 0 04 0 0 ， 33 0 0 器 墨2 0 0 1 0 0 o 0246 8 浓度( 1 lg m 1 ) 图1 3f n z 标准曲线 f i g l 3s t a n d a r dc u n ，eo ff l u n a f i z i n eh y d r o c h l o r i d e 6 第一部分f n z 分析方法的建立 2 3 分析方法的方法学考察 2 3 1 加样回收率实验 量取o 1 m g m l 一的f n z 贮备液适量，分别加入用处方量制备的空白s l n ， 用甲醇溶解，流动相定容，得到浓度分别为o 5 、4 、1 2 i - t g m l 。1 的f n z 溶液， 进样2 0 1 x l ，测定峰面积，以标准曲线计算测得量，结果见表1 2 。 表1 - 2 加样回收率实验( z s ，刀= 3 ) t a b l 3r e s u l t so f r e c o v e r yt e s t ( x s 刀= 3 ) 从实验结果看，在高中低三个浓度下，方法的回收率较好。 7 河南大学硕士学位论文杨栋 2 3 2 精密度实验 精密量取f n z 贮备液适量，分别用流动相稀释成浓度为2 0 肛1 m l ， 6 0 1 1 1 m l ，1 2 0 山i n l j 的溶液，每隔2 小时进样一次，共测定三次，将测得的 面积代入回归方程，结果见表1 3 。 表1 - 3 精密度实验结果( n = 3 ) t a b i 一3r e s u l t so f p r e c i s i o nt e s t ( n = 3 ) 实验结果表明，使用该方法进行测定，精密度良好。 2 3 3 方法专属性实验 精密量取2 0 m l 空白s l n ，置5 0 m l 容量瓶中，加甲醇适量超声3 m i n 溶 解，并用甲醇定容至刻度，混匀，微孔滤膜滤过，精密量取1 0 m l 至1 0 0 m l 容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试液，进样2 0 , 1 ，记录色谱图。 另取f n z 贮备液制成l o i _ t 1 m l 以的对照溶液，进样2 0 山，记录色谱图。由图 1 _ 4 与图1 5 可以看出，辅料对药物没有干扰，方法专属性好。 8 第一部分f n z 分析方法的建立 图1 4 空白辅料溶液的色谱图 f i g1 - 4t h ec h r o m a t o g r a mo f b l a n ki n g r e d i e n t s 3 本章小结 图1 5f n z 溶液的色谱图 本部分建立了用高效液相色谱测定f n z 的含量的分析方法。由于f n z 的分子结构上有氟原子，会与色谱柱固定相上的羟基产生分子间力，影响洗 脱导致峰形较差，拖尾严重。在配置流动相的缓冲液中加入o 4 的三乙胺， 并将缓冲液p h 调制3 5 以改善峰形。 9 河南大学硕士学位论文杨栋 在本部分所述高效液相色谱条件下，f n z 在0 5 - 1 2 i - t g m l 。范围内呈良好 线性关系，相关系数为0 9 9 9 7 。回收率为在9 8 , - , 1 0 2 范围内、精密度小于 2 ，证明f n z 在此条件下的含量测定方法准确可靠。 1 0 第二部分f n z - s l n 制备方法研究 第二部分f n z s l n 制备方法研究 1 仪器和材料 1 1 仪器 j e m 1 0 0 c x i i 型透射电子显微镜( 日本电子) c 【广3 型恒温加热磁力搅拌器( 郑州长城科工贸有限公司) y p 6 0 0 型电子天平( 上海第二天平仪器厂) p h s 。2 5 型数显酸度计( 上海天达仪器有限公司) t g l - 1 6 5 型高速离心机( 上海安亭科学仪器厂) t x i i 型循环水真空泵( 郑州市予华科教仪器厂) r e 5 2 a a 旋转蒸发器( 上海亚荣生化仪器厂) x s 2 0 0 0 型生物显微镜( 济南胜利科学器材有限公司) a g 13 5 s 型电子分析天平( 瑞士梅特勒托利多) s z 9 3 型自动双重纯化水蒸馏器( 巩义市英峪予华仪器厂) k s 2 5 0 d 超声波清洗器( 宁波科生仪器厂) 1 0 1 型电热鼓风干燥箱( 北京中兴伟业仪器有限公司) j y 9 2 2 d 超声波细胞粉碎机( 宁波新芝生物科技有限公司) 1 2 材料 f n z ( 郑州康瑞制药有限公司，批号2 0 0 8 1 0 0 2 ) 大豆磷脂( 武汉市合中生化制造有限公司，批号2 0 0 7 0 1 0 3 ) 硬脂酸( 上海恒信化学试剂有限公司，批号2 0 0 3 0 3 0 1 ) 单硬脂酸甘油酯( 上海恒信化学试剂有限公司，批号2 0 0 3 1 1 1 5 ) 泊洛沙姆1 8 8 ( 南京威尔化工有限公司，批号2 0 0 8 1 1 0 7 ) 河南大学硕士学位论文杨栋 s e p h a d e x g - 5 0 葡聚糖凝胶( 北京瑞达恒辉科技发展有限公司) 其余试剂均为分析纯 2 f n z s l n 制备评价标准 2 1 外观及稳定性 由于处方及制备工艺的原因，s l n 会出现分层、药物渗漏等不稳定现象， 或者由于所含组分的特点，在储存过程中会出现变色、絮凝等外观上的变化， 因此可以利用s l n 的外观变化情况对s l n 的稳定性进行初步评价。合格的 s l n 无沉淀、静置时不分层。 方法：将制备的s l n 放置于1 0 m l 容器中，密封，于室温条件下放置1 0 天，按上述要求观察现象。 2 2 粒径的大小 采用透射电镜法来考察固体脂质纳米粒的大小：在室温条件下，取s l n 混悬液适量，加水稀释到一定浓度后滴加在铜网上晾干，再向铜网上滴加刚 好能覆盖铜网的1 的磷钨酸进行染色，在透射电镜下观察其粒径大小。 1 2 第二部分f n z - s l n 制备方法研究 2 3 包封率的测定 2 3 1 离心法【5 】 精密量取f n z s l n 混悬液2 0 m l ，1 5 0 0 0 r m i l l 1 离心3 0 m i n ，精密量取 上清液0 5 m l 于5 m l 容量瓶中，甲醇定容至刻度，测f n z 的含量c 1 。 精密吸取0 5 m l 的f n z s l n 混悬液，转入5 m l 容量瓶中，加入适量甲 醇超声溶解，用甲醇定容至刻度，用0 2 2 1 u n 微孔滤膜过滤，取续滤液测定 f n z 的含量c 2 。 离心法包封率计算公式如下： 包封率( ) = ( 1 一c 1 c 2 ) x1 0 0 公式( 2 1 ) 由于载药脂质硬脂酸密度与水相近，离心难度大，即使离心较长时间后， 离心管上清液中仍有白色的f n z s l n ，不能完全将f n z s l n 沉降至管底， 即很难把f n z s l n 与游离f n z 分离完全，故不宜使用离心法测定f n z s l n 的包封率。 2 3 2 葡聚糖凝胶；去【6 1 2 3 2 1 洗脱曲线的考察 取一定量s e p h a d e xg 5 0 ，用3 0 的乙醇溶胀1 2 h 后，装入到2 0 c m x1 0 c m 的层析柱中，最终得到柱高为1 5 ：- - 0 5 c m 的葡聚糖凝胶柱。 取空白s l n2 m l 上柱，用3 0 乙醇洗脱，饱和柱子后f 7 】，再分别精密吸 取f n z s l n 0 3 m l 上柱，用3 0 乙醇洗脱，流速1 0 m 1 r a i n - 1 ，每2 m i n 分段收 1 3 河南大学硕士学位论文杨栋 集洗脱液，然后把收集到的洗脱液分别加入到1 0 r r d 容量瓶中，先用适量甲醇 溶解，后用甲醇定容，取2 0 1 - l 1 进样测定，记录色谱图，代入线性回归方程算 出浓度，做洗脱曲线，如图2 1 。结果表明，葡聚糖凝胶柱可将f n z s l n 和 游离药物完全分开，即此法适合本实验的要求，所以选用葡聚糖凝胶法作为 包封率的测定方法。 1 02 03 04 0 时间( m i n ) 图2 - 1f n z s l n 在s e p h a d e xg 5 0 中的洗脱曲线 f i g2 - 1e l u t i o n c u i v eo f f n z s l nb ys e p h a d e xg - 5 0f i l t r a t i o n 2 3 2 2 包封率的测定 取f n z s l n 混悬液，分别精密吸取3 份各0 3 m l ，加入到s e p h a d e xg 5 0 墙 葡聚糖凝胶柱顶部，用3 0 的乙醇作为洗脱液洗脱，流速为1 0 m 1 r a i n 1 ，每 隔2 m i n 分段收集洗脱液，将含有白色混悬溶液的洗脱流份合并，转入1 0 m l 容量瓶中，用甲醇定容至刻度后摇匀。精密吸取2 0 山进样，测定峰面积后代 入线性回归方程算出f n z 浓度，求出平均浓度c l 。 1 4 6 4 2 o _ 【 曲t i v 燃嵌 第二部分f n z - s l n 制备方法研究 精密吸取同一批f n z s l n 混悬液0 3 m l 均为3 份，加入适量甲醇超声 溶解后定容至1 0 m l 容量瓶中，用0 2 2 1 a m 微孔滤膜过滤，取滤液2 0 9 l 进样， 测定峰面积后计算出f n z 含量平均值c o 。 葡聚糖凝胶层析法包封率计算公式如下： 包封率( ) = c l c o x l 0 0 公式( 2 2 ) 2 3 2 3 柱回收率测定 通过改变洗脱时的条件测定柱回收率来选出最好的洗脱条件。以下是其 他条件相同的情况下，以蒸馏水与3 0 乙醇溶液吲作为洗脱液，洗脱未饱和 与饱和的柱子的回收率测定结果，如下表2 1 表2 1 不同条件下的柱回收率与包封率( x s ，刀= 3 ) t a b2 1t h er e c o v e r yr a t ea n de n t r a p m e n te f f i c i e n c yo fc o l u n m i nd i f f e r e n tc o n d i t i o n ( x s 咒= 3 ) 由结果可看出实验组号4 测得的包封率和回收率都较高，所以选用3 0 乙醇溶液做洗脱液，并在实验前先用空白s l n 饱和柱子。 载药量可以根据包封率计算： 载药量( ) = 包封率( ) w f ，w 总1 0 0 公式( 2 3 ) 其中w f 为f n z 在制剂中的含量，w 总为制剂中f n z 和其他固体辅料的 1 5 河南大学硕士学位论文杨栋 总质量。 3f n z s l n 制备方法的初步筛选 用于制备s l n 的方法主要有薄膜超声分散、法【9 1 、溶剂乳化低温固化法【l o 】、 高压乳匀、法【1 1 】、微乳法f 3 】、高剪切乳化超声法【1 2 1 等，考虑到实验条件和药物性 质等原因，选择薄膜超声分散法和溶剂乳化低温固化法作为考察对象。 3 1 薄膜超声分散法 称取处方量的药物、硬脂酸和大豆磷脂溶于适量的二氯甲烷中，把已经 溶解药品的甲醇与上述液体一起加入到梨形瓶中；调好温度，减压至适当的 真空度后，旋转蒸发直至梨形瓶中药液蒸干；加入适量已配置的吐温8 0 溶液， 然后用超声波细胞粉碎机进行超声，即得s l n 。 3 2 溶剂乳化低温固化法 精密称取处方量的药物和大豆磷脂，加入到适量的无水乙醇中超声 3 0 m i n ，使其溶解得溶液a ；精密称取处方量的硬脂酸溶于适量的二氯甲烷得 溶液b ，然后将溶液a 与溶液b 混合均匀即得油相。 精密称取处方量的泊洛沙姆溶于一定量的蒸馏水中得到水相。将油相加 吨 热到7 5 士2 。c 与水相温度相同时，在1 5 0 0 r m i n l 搅拌条件下，逐滴加入水相中， 3 5 h 浓缩至1 0 2 0 m l ，然后再快速混于另一适量的水相( 0 左右) 中，用超 声波细胞粉碎仪超声1 0 , - 3 0 r a i n ，即得s l n 。 将两种方法制备出的s l n 放置一周后观察，薄膜超声分散法制备出的 1 6 第二部分f n z - s l n 制备方法研究 s l n 已开始分层；溶剂乳化低温固化法制备出的s l n 还是白色均一体系， 故选择溶剂乳化低温固化法作为制备方法。 4 溶剂乳化低温固化法制备f n z 4 1f n z s l n 处方研究 4 1 1 处方的初步确定 据调查现有f n z 市售制剂中f n z 常用剂量为5 l o m g 。考虑在压制时包 封率无法达到1 0 0 ，相对要增加投料量，结合文献报道及临床使用剂量，确 定主药f n z 投药量为2 0 m g 。 载药脂质的固体脂质一般为生理相容的可生物降解的天然或合成类脂， 包括甘油酯类如：三月桂酸甘油酯( d y n a s a n11 2 ) 、单硬脂酸甘油酯( i m w i t o r 9 0 0 ) 等；脂肪酸类如硬脂酸、棕榈酸、癸酸、二十二酸等；类固醇类如胆固 醇；蜡质类如鲸蜡醇十六酸酯( ( d y n a s a n1 1 8 ) 等n 3 1 。实际工作中常根据药物 的性质选择适宜的载体材料，国内报道【1 4 】硬脂酸和单硬脂酸甘油酯是常用的 载体材料，在本实验中，硬脂酸比单硬脂酸甘油酯更易制备出f n z s l n ，初 步选用硬脂酸作为脂质材料。 乳化剂的选择依赖于制备制剂的目的，大豆卵磷脂，其受酸碱度、盐浓 度的影响小，乳化能力较强，生物相容性好，而且本身也具有良好的生理活 性，可促进药物的透膜吸收。f n z 是水不溶脂难溶的药物，能插入大豆磷脂 的磷脂酰基链中，有一定亲和力【”】。 泊洛沙姆可以形成胶束，增加难溶药物的溶解度，而且还有空间位阻作 1 7 河南大学硕士学位论文杨栋 用，可以组织纳米粒的聚集，从而增加s l n 的稳定性。在药物穿越b b b ( 血 脑屏障) 的过程中也有一定作用，它通过抑制b b b 上多种转运蛋白的外排用， 包被纳米粒，间接通过b b b 上低密度脂蛋白受体介导的转运靶向入脑；与 b b b 上受体的特异性配体及其单克隆抗体等导向性分子连接后，经受体介导 的主动转运进入脑部【1 6 】。 综上所述，最终确定f n z 投料量为2 0 r a g ，乳化剂选择大豆磷脂和泊洛 沙姆，载药脂质为硬脂酸。 4 1 2 大豆磷脂用量 采用溶剂乳化低温固化法制备s l n 时，乳化过程是关键步骤，大豆卵磷 脂，其受酸碱度、盐浓度的影响小，乳化能力较强。本实验以大豆磷脂为主 要乳化剂，以包封率为指标，考察所得到的固体脂质纳米粒的稳定性，以确 定稳定剂的合适浓度。由表2 2 得出大豆磷脂的最佳用量为油相的o 5 1 。 表2 - 2 大豆磷脂浓度对包封率的影响( x s ，刀= 3 ) t a b2 - 2t h er e l a t i o nb e t w e e nl e c i t h i nc o n c e n t r a t i o n a n de n t r a p m e n te f f i c i e n c y ( x s 胛= 3 ) 4 1 3 泊洛沙姆用量 泊洛沙姆可以形成胶束，增加难溶药物的溶解度，提高药物的稳定性。 1 8 第二部分f n z - s l n 制备方法研究 本实验以泊洛沙姆为辅助乳化剂，以包封率为指标，考察所得到的固体脂质 纳米粒的稳定性，以确定稳定剂的合适浓度。由表2 3 可得出泊洛沙姆用量 应占水相的0 5 0 - 4 ) 7 表2 3 泊洛沙姆浓度对包封率的影响( 石s ，以= 3 ) t a b2 - 3t h er e l a t i o nb e t w e e np o l o x a m e rc o n c e n t r a t i o n a n de n t r a p m e n te f f i c i e n c y ( x s 刀= 3 ) 4 1 4 水相p h 的选择 s l n 在中性p h 值下稳定，本实验以s l n 的留样稳定性、包封率为指标， 考察p h 为6 0 、7 0 、8 0 、9 0 的水相所制得的s l n 放置一周后的稳定性，来 确定合适的水相p h 。由表2 _ 4 可得出在p h = 7 0 的条件下，所制备的s l n 包 封率最高。 表2 _ 4 水相p h 的考察( 工s ，甩= 3 ) t a b2 - 4e x a m i n a t i o no f a q u e o u sp h a s ep h ( x s 刀= 3 ) ( 有白色沉淀，药物析出用“+ ”表示，无药物析出、颜色乳白用“一”表示) 1 9 河南大学硕士学位论文杨栋 4 2f n z s l n 制备工艺研究 4 2 1 辅料加入方式对制剂的影响 采用溶剂乳化低温固化法制备s l n 混悬液，乳化是形成s l n 的关键步骤， 在制备过程中需较大的外力形成稳定均一的o w 型体系。将油相加入水相的 加入方式对s l n 的稳定性有着较大的影响。 油相加入方式： 一、直接倾倒 保持7 5 的磁力搅拌下的水相中，将相同温度的油相全部倒入，然后继 续恒温搅拌3 0 m i n 。 二、逐滴加入 水相用恒温磁力搅拌机保持7 5 搅拌，油相也保持相同的温度，用滴管 逐滴向水相中加入油相。 将上述两种方法得到的混合物，用超声波细胞粉碎仪用在同强度和次数 下处理后留样观察，结果如下： 第一种方式：放置2 4 小时后出现分层现象 第二种方式：放置同样的时间未出现分层现象，还是乳白的均一体系。 根据结果分析，由于逐滴滴加的过程中，油相体积相对较小，能及时被 水相包裹，乳化为很小的液滴，最终得到的s l n 稳定性较好。 4 2 2 制备时辅料加入顺序对f n z s l n 质量的影响 将处方量的大豆磷脂加入到无水乙醇中，然后微热使其溶解，再n a , 第二部分f n z , - s l n 制备方法研究 药物，使药物溶解后得溶液a ，把处方量的硬脂酸溶于二氯甲烷中得溶液b ， 将a 和b 混合得有机相。 将处方量的大豆磷脂与硬脂酸加入到二氯甲烷中搅拌溶解得溶液c ， 然后将药物溶解于无水乙醇中得溶液d ，将c 与d 混合得有机相。 将上述两种方案制备出的有机相分别逐滴加入到含有相同浓度泊洛沙 姆、相同温度、相同搅拌速度的水相中，制备出f n z s l n 后进行比较。 从外观上看，方案与方案制备出的f n z - s l n 均为乳白色混悬液，但 放置过夜后，方案制备的f n z s l n 已析出沉淀，方案的完好。放置一周 后，方案制备的f n z s l n 已出现分层，方案的仍为白色均一体系。 4 2 3 乳化温度 当温度高于固态脂质的熔点温度时使脂质( 硬脂酸熔点6 9 6 。c ) 成液态， 是乳化的前提条件，但是温度也影响乳化剂的乳化能力，如温度过高可以使 大豆磷脂氧化，所以乳化温度也不宜过高。固定处方组分及用量不变，分别 考察初* l n 备时的水浴温度为5 5 。c 、7 0 。c 、7 5 c 时对乳化剂乳化效果及其稳 定性影响，将以这些条件下制备出的s l n ，室温放置留样1 0 天后，以其稳定 性为指标进行考察，结果如表2 7 。 河南大学硕士学位论文杨栋 表2 7 乳化温度的考察 t a b 2 7r e n e wo fd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e so fe m u l s i f i n g ( 分层、粘壁用“+ ”表示，均一稳定乳白体系用“一”表示) 通过试验可知，将温度控制在7 5 c 条件下所制备的s l n 较稳定，此时固 体脂质为液态，说明只有在液态，才能被乳化剂充分乳化，故制备过程中的 温度必须维持在脂质熔点以上的1 0 1 2 左右【l 刀，温度过低会导致乳化不完全， 温度过高则影响乳化剂乳化能力。 4 2 4 冷却固化时间 冷却固化这个步骤对于s l n 的成型很关键，温差必须足够大，使液态的 脂质迅速冷却，才能使其在乳化的状态直接固化成为s l n ，否则随着温度缓 慢降低时，乳滴之间会相互粘连，使粒径增大。在0 士2 c 的冰浴条件下，以粒 径为指标，考察固化时间，结果见表2 8 。从结果可知，在0 士2 c 的条件下， 固化4 5 m i n 为最佳制备条件。 第二部分f n z - s l n 制备方法研究 表2 - 8 冷却固化时间考察( j s ，刀= 3 ) t a b 2 8r e v i e wo f c o o l i n gt i m eo l ls t a b i l i t yo f f n z s l n ( x s 玎= 3 ) 4 3 正交试验优化处方 在单因素考察及工艺研究的基础上，选择对f n z s l n 性质影响显著的3 个因素作为考察对象，即大豆磷脂的用量( a ) ，硬脂酸的用量( b ) ， p o l o x a m e r l 8 8 的用量( c ) 。根据预实验结果以及在最高最低水平时制备 f n z s l n 的可行性，综合选择各因素水平，其因素水平及结果见表2 5 、2 - 6 。 表2 - 5 因素水平 t a b2 - 5t h ef a c t o r sa n dl e v e l s 根据以上各因素、水平，以s l n 的包封率为考察指标，按正交设计l 9 ( 3 3 ) 表进行试验，结果见表2 - 6 。 河南大学硕士学位论文杨栋 由以上的结果可知，各因素对包封率影响的大小顺序为：b c a 。根据 实验结果，最优化组合是：a i b 2 c 3 ，即：大豆磷脂为o 1 5 9 ，硬脂酸为0 4 9 ， p o l o x a m e r l 8 8 为o 7 9 。最终得出制备处方为： f n z 2 0 m g 大豆磷酯 o 1 5 9 泊洛沙姆 o 7 9 硬脂酸 o 4 9 水1 0 0 m l 第二部分f n z - s l n 制各方法研究 5 最佳工艺制备f n z s l n 在相同的制备工艺条件下，利用最佳处方按照本部分3 2 项下方法制备三 批f n z s l n ，测定其包封率，粒径等，结果见表2 - 9 。 表2 - 9 最佳工艺制备f n z s l n t a b 2 - 9t h ep r e p a r a t i o no ff n z - s l nw i t hb e s tt e c h n o l o g y 6 讨论 测定包封率时采用蒸馏水作为洗脱液洗脱f n z 水溶液时，f n z 的回收率 不高；考虑到f n z 为难溶性药物，易吸附在葡聚糖凝胶表面，蒸馏水对f n z 溶解能力较小，难以洗脱下来