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摘要 酶电极是利用酶催化反应的高度专一性与电化学信号检测的高 灵敏度的一种电化学生物传感器，近几十年来发展迅速。高效高活性 的酶固定技术的研究对生物催化领域意义重大，也是提高酶电极使用 寿命和重复性的基础。 电化学石英晶体阻抗分析( e q c x a ) 是一种电极表面化学生物 修饰过程的重要表征技术。该技术通过快速测量石英晶体电声阻抗而 获取较全面的晶体谐振信息，从而可同步动态研究电化学反应或过程 的多种理化参数和材料学性质，如电极表面低至纳克级的质量变化、 溶液粘密度和修饰膜粘弹性等。 本文在本实验室前面工作的基础上，在壳聚糖的电沉积、葡萄糖 氧化酶的固定及酶电极研究等方面完成了一些创新性工作。主要内容 如下： 1 综述了生物传感器的概念、构成和生物分子识别物质的固定方法， 以及电化学石英晶体微天平( e q c m ) 技术及其应用。 2 提出了一种以1 。4 苯醌电还原法诱导沉积厚度可控的酶壳聚糖 多壁碳纳米管( m w c t 盯) 复合膜用于固定葡萄糖氧化酶( g o d ) 的 新方法。利用耳q c l a 技术现场监测了壳聚糖( c s ) 在金电极表面 的沉积过程。结果表明电沉积的壳聚糖为非刚性的水凝胶膜，并 籍此制作了性能良好的g o d c s m w c n t a u 电极用于葡萄糖的 检测，同时与h 2 0 2 电还原法和析氢法所制备的传感器进行了比 较。优化条件下，该传感器的线性范围为0 0 0 5 - 8m m o ll - 1 、检测 限为2t t m o ll 以( s i n - - 3 ) 、响应时间在1 5s 内，并且稳定性良好， 米氏常数( ，m i p p ) 为6 8 0m m o ll 一，表明此方法制备的纳米复合 膜具有良好的生物兼容性。 3 利用e q c i a 技术研究了普鲁士蓝( p b ) 在金电极上的电沉积过 程。通过优化p b 的量，制作了一种性能良好的 n a n o a u - h b - c h i t o s a n p b a u 电极用于过氧化氢的检测，优化条件 下，该传感器表现出良好的性能，其线性范围为li _ t m o l l d - 5 m m o l l 1 、检测限为2 7 x 1 0 4 m o ll ( s ，n 釜3 ) 、响应时问在1 0s 以内，并 且稳定性良好。 4 在铂颗粒修饰的8 b 铅笔芯电极上电生多巴胺聚合膜固定葡萄糖 氧化酶( g o d ) ，通过优化聚合溶液中磷酸缓冲液、多巴胺( d a ) 和g o d 三者的浓度，研制了价廉性优的新型葡萄糖酶电极用于 葡萄糖传感检测。优化条件下，该传感器的线性范围为0 0 5 - 1 2 m m o ll - i 、检测限为6g 。m o ll 1 ( s i n = 3 ) 、响应时间在1 5s 内，并 且稳定性良好，具有较强的抗干扰能力，用于实际血样检测，结 果满意。 关键词：生物传感器，电化学石英晶体阻抗分析( e q c i a ) ，铅笔电 极，葡萄糖氧化酶( g o d ) ，壳聚糖( c s ) ，l ，4 一苯醌( b q ) ，过氧化氢， 血红蛋白，普鲁士蓝( p b ) ，多巴胺电氧化聚合膜( p f d o ) n t h ee n z y m a t i ce k c 缸o d ei so n ek i n do fe l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s t h a tc o m b i n e sh i g h l ys p e c i f i ce n z y m a t i cc a t a l y t i cr e a c t i o n sw i t hh i g h m y s e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ，w h i c hh a sd e v e l o p e dv e r yr a p i d l yi n t h ep a s td e c a d e s t h ee l e c t r o c h e m i c a lq u a r t zc r y s t a li m p e d a n c ea n a l y s i so ! q c i a ) i s a n i m p o r t a n ta n a l y t i c a l m e t h o df o r m o n i t o r i n g t h e p r o c e s s e s o f c h e m o d b i o - m o d i f i c a t i o no ne l e c t r o d e8 u r f 觚：e s ，v i aas i m u l t a n e o u sa n d r a p i dm e a s u r e m e n t o ft h ee l e c t r o a c o u s t i ci m p e d a n c ef o rt h ep i e z o e l e c t r i c q u a r t zc r y s t a l ( p q c ) 1 e s o l l 曲c e ，f r o mw h i c hm u l t i p l ec h e m i c a u p h y f i c f l p a r a m e t e r s a n dm a t e r i a l - r e l e v a n t c h a r a c t e r i s t i c s d u r i n g a n e l e c t r o c h e m i c a lp e r t u r b a t i o nc a nb ea c q u i r e d , s u c ha se l e c t r o d e - m a s s c h a n g e sd o w nt ot h en a n o g r a ml e v e l ，t h es o l u t i o nv i s c o d e n s i t y , a n dt h e e l a s t i c i t yo f m o d i f i e df i l m s i nt h ep r e s e n tt h e s i s ，w eh a v ec a r r i e do u ts o m ei n n o v a t i v er e s e a r c h e s o nt h ee l e c t r o d e p o s i t i o no fc h i t o s a n ( c s ) ，t h ei m m o b i l i z a t i o no fg l u c o s e o x i d a ( g o d ) a n dc o n s t r u c t i o n so fe n z y m a t i ce l e c t r o d e s t h em a i n c o n t e n t sa 舱a sf o l l o w s 1 t h ec o n c e p ta n dc o n s t r u c t i o no ft h eb i o s e n s o r s ，m a i n l yi n v o l v i n g i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sf o rb i o m o l e c u l e s ，a sw e l la st h ep r i n c i p l ea n d a p p l i c a t i o n o ft h ee l e c t r o c h e m i c a l q u a r t zc r y s t a l m i c r o b a l a n c e ( e q c m ) ，h a v e b e e nb r i e f l yr e v i e w e d 2 an o v e lm e t h o dt oi m m o b i l i z eg o di n 1 , 4 - b e n z o q u i n o n e e l e c t r o r e d u c t i o n - i n d u c e d d e p o s i t i o n o ft h i c k n e s s - c o n t r o l l a b l e e n z y m e - c h i t o s a n - m w c n tn a n o c o m p o s i t ef i l mh a sb e e np r o p o s e d i t h ee q c l at e c h n o l o g yw a su s e dt om o n i t o rt h ep r o c e s so fc h i t o s a n d e p o s i t i o no l lt h ea u e l e c t r o d e t h er e s u l ts u g g e s t e dt h a tt h ec h i t o s a n f i l md e p o s i t e db ye l e c t r o r e d u c t i o nw a sn o n r i g i dh y d r o g e l ag l u c o s e b i o s e u s o rw i t hg o o dp e r f o r m a n c ew a st h u sf a b r i c a t e d , a n dc o m p a r e d w i t ht h es c q 啮o r sv i ah e 0 2o rh 2 0e l e c t r o r e d u t i o nm e t h o d t h ee f f e c t s o fe x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r so nt h es e n s o rp e r f o r m a n c e ，i n c l u d i n g a p p l i e dp o t e n t i a l ，s o l u t i o np h w e r ee x a m i n e d a ta l lo p t i m a lp o t e n t i a l o f0 7vv ss c e ，t h ec u r r e n tr e s p o n s eo ft h eb i o s e n s o ri ns e l e c t e d p h o s p h a t eb u f f e r ( p h7 们w a sl i n e a rw i t hg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nf r o m o 0 0 5t o8m m ，w i t hl o w e rl i m i to fd e t e c t i o no f 2p m ( s n 弓) ，s h o r t ”r e s p o n s et i m e ( w i t h i nl s s ) ，t h em i c h a e l i sc o n s t a n t w a s e s t i m a t e da s6 8m m 3 t h ee q c l at e c h n o l o g yw a su s e dt om o n i t o rt h ep r o c e s so f e l e c t r o d e p o s i t i o no fp r u s s i a nb l u e ( p b ) o na ue l e c t r o d e ah y d r o g e n p e r o x i d e ( h 2 0 2 ) b i o s e u s o rw i t hg o o dp e r f o r m a n c ew a sc o n s t r u c t e d , v i at h eq u a n t i t yo p t i m i z a t i o nf o rp b ，a n de f f e c t so fe x p e r i m e n t a l p a r a m e t e r s0 nt h e n s o rp e r f o r m a n c e ，i 玳l u d i n ga p p l i e dp o t e n t i a l ， s o l u t i o np ha n de l e c t r o a c t i v ei n t e r f e r e n t s ，w e r ee x a m i n e d a ta n o p t i m a lp o t e n t i a lo f - 0 2 5v v ss c e t h ec u r r e n tr e s p o n s eo ft h e b i o s e m o ri nt h es e l e c t e dp h o s p h a t eb u f f e rq h7 0 ) w a sl i n e a rw i t ht h e c o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2f r o m1g t mt o5m m ，w i t hal o w e rl i m i to f d e t e c t i o no fo 2 7p m ( s n = 3 ) ，s h o r tr e s p o n s et i m e ( w i t h i nl os ) t h e b i o s e n s o re x h i b i t e dg o o ds t o r a g es t a b i l i t y 4 an e we n z y m a t i ce l e c t r o d ew i t hc o s te f f e c t i v e n e s sa n dg o o d p e r f o r m a n c ef o rg l u c o s ed e t e c t i o nw a sd e v e l o p e db yc o d e p o s i t i n g g l u c o s eo x i d e s ei n t ot h ep o l y m e rf r o me l e c t r o c h e m i c a lo x i d a t i o no f d o p a m i n e ( d a ) o n ap t - m o d i f i e d8 bp e n c i ll e a de l e c t r o d e e f f e c t so f c o n c e n t r a t i o n so fp h o s p h a t eb u f f e r , d aa n dg o d 、e r ei n v e s t i g a t e d a tt h eo p t i m a lp o t e n t i a lo fo 6 5vv e r s u st h ek c l s a t u r a t e dc a l o m e l e l e c t r o d e ( s e e ) ，t h ec u r r e n tr e s p o n s eo ft h eb i o s e n s o ri nt h es e l e c t e d p h o s p h a t eb u f f e rq h7 o ) w a sl i n e a r 、) l r i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fg l u c o s e f r o mo 0 5t o1 2m m ，懈t i lal o w e rd e t e c t i o nl i m i to f6 州( s i n - - 3 ) ， s h o r tr e s p o n s et i m e ( w i t h i n1 5 s ) a n dg o o da n t i i n t e r f e r e n ta b i l i t y 1 1 璩 m i c h a e l i sc o n s t a n t ( 印p ) w a se s t i m a t e dt ob e9 21m m t h e b i o s e n s o re x h i b i t e dg o o ds t o m g es t a b i l i t y , i e 9 7 o fi t si n i t i a l r e s p o n s ew & qr e t a i n e da f t e r7 - d a ys t o r a g ei nt h es e l e c t e dp h o s p h a t e b u f f e ra t4 。c ，a n de v e na f t e ra n o t h e rt h r e ew e e k st h eb i o s e n s o r r e t a i n e d9 3 o f i t si n i t i a lr e s p o n s e k e y w o r d s ：b i o s e m o r , e l e c t r o c h e m i c a lq u a r t zc r y s t a li m p e d a n c ea n a l y s i s ( e q c i a ) ，p e n c i le l e c t r o d e ，g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) ，c h i t o s a n ( c s ) ，1 ， 4 - b e n z o q u i n o n e q ) ，h y d r o g e np e r o x i d e ，h e m o g l o b i n ( 1 b ) ，p r u s s i a n b l u e ( p b ) ，p o l y m e rg r o w nf r o md o p a m i n eo x i d a t i o n ( p f d o ) v 基于电沉积壳聚糖和多巴胺氧化聚合膜的安培生物传感研究 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：降j 及象讼0 7 年6 月中日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密日。 ( 请在以上相应方框内打“ ”) 作者签名：阂及泛日期：冲6 月甲日 导师签名：椭日期：叶6 月牛日 基于电沉积壳聚糖和多巴胺氧化聚合膜的安培生物传感研究 第一章绪论 生物传感器具有选择性高、分析速度快、操作简易和仪器价格低 廉等特点，而且可以进行在线甚至活体分析，从而为生物医学、环境 监测、食品医药工业及军事医学领域直接带来新技术革命。2 0 世纪 8 0 年代起国际上对生物传感器进行广泛的研究和探索。近些年来已 经研制出系列在环境监测、临床检验和生化分析等方面有实用价值的 生物传感器【l - 9 。 1 1 生物传感器 1 1 1 生物传感器的概念及其工作原理 生物传感器是由固定化生物物质( 酶、蛋白质、抗原、抗体、生 物膜等) 做敏感元件与适当的化学信号换能器件组成的生物电化学 分析系统。它具有特异识别分子的能力，以生物体内存在的活性物质 为测量对象。它与传统的化学传感器和离线分析技术( h p l c 或质谱) 相比，具有方便、省时、精度高、便于计算机收集和处理数据，又不 会或很少损伤样品和造成污染等优点。 生物传感器一般有两个组成部分：其一是分子识别元件( 感受 器) ，由具有分子识别能力的生物活性物质构成；其二是信号转换器 ( 换能器) ，主要是电化学或光学检测元件。当待测物与分子识别元件 特异性地结合后，所产生的复合物( 或光、热等) 通过信号转换器转 变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析监测的目的。 1 1 2 生物传感器的分类 根据生物传感器中信号检测器上的敏感物质分类：如免疫传感器 硕士学位论文 0 0 3 、酶传感器【1 1 , 1 2 1 、微生物传感器13 1 、组织传感器 1 4 】、细胞传感器【1 5 1 6 等。 根据生物传感器的信号转换分类：如电化学传感器( 包括电流型 1 1 7 、电位型把l 、电容型和场效应晶体管( f e d 生物传感器2 町等) 、 半导体传感器、测热型传感器【2 ”、测光型传感器【2 2 矧、测声型传感器 等。 1 1 3 电流型酶传感器 电流型酶传感器是生物传感器领域中最重要，研究得最多，且选 择性极高的一种类型。它基于酶化学反应和异相电子转移反应，在恒 定电位的情况下，电流随反应有一定响应的原理。1 9 6 2 年c l a r k 等【2 4 j 研制的葡萄糖酶电极用于葡萄糖的测定就是基于这一原理。这是世界 上第一个生物传感器。一个优良的酶传感器的主要性能体现在灵敏 度、选择性和重现性上。要满足1 ) 酶固定化技术上，酶可保持良好 的生物活性，且固定化层有良好的稳定性及耐用性，保持酶高度的选 择性。2 ) 保证快的响应时间及高的灵敏度，尽量减少其他活性物质 的干扰。因此对于电流型酶传感器的研究，酶电极的制备是最关键的。 1 1 4 电极上酶的固定化方法 电流型酶传感器的酶限定或附着在转换器即电极上而构成所谓 的酶电极，是一种化学修饰电极。因此，同常规固定化酶相比，电极 上酶的固定化具有这样一些特征：1 ) 固定化酶是与电极紧密接触的： 2 ) 通过适当地控制固定化酶的微环境( 即通过化学修饰电极表面) 可获得很多要求的性质，如增加的稳定性、高灵敏度、快速的响应、 高取样速率；3 ) 固定酶的电极的尺寸、形状和表面性能方面具有较 大的灵活性；4 ) 防止溶液中其它物质的干扰和对电极表面的玷污等。 基于电沉积壳聚糖和多巴胺氧化聚合膜的安培生物传感研究 因此，酶电极制备的关键技术就是酶的固定化，即在电极表面覆 着一层敏感膜。膜的厚度、致密性、均匀度与分子排列的有序性等因 素对酶电极的性能也有一定的影响。目前，固定方法很多，常用的有 吸附法、组合法、共价键合法、交联法，包埋法等等。 ，物理吸附法即将含有酶的溶液滴在电极表面，溶剂自然挥干。此 法简单，操作条件温和，但由于生物分子与固体表面结合力弱，易泄 露或解脱。稳定性差，目前较少使用。文献报道将葡萄糖氧化酶结合 于葡聚糖衍生物上，然后吸附于多孔碳电极上构成酶传感器，由于葡 聚糖衍生物增强了酶的稳定性及多孔碳的强吸附性，使其具有较好稳 定性和重现性。 组合法是酶和电极材料简单地混合以制备固定化酶电极的一种 方法。典型的是酶碳糊电极口5 1 。y a m a m o t o 2 6 用由过氧化物酶、二茂 铁、石蜡油、石墨粉混合制成的碳糊电极，以含n a t i o n 的纤维素酯 膜包裹，制得的酶电极用于流动注射分析h 2 0 2 ，效果较好。另一种 是有机导电盐做电极材料与酶混合制得的酶电极 2 7 1 。此电极制作简 单，电极表面可更新，缺点是电极表面不均匀，重现性差，酶有泄露， 用酶量大，电极不易微型化。 交联法是通过采用功能团试剂如戊二醛等，在酶分子之间、酶分 子与凝胶聚合物之间交联形成网状结构而使酶固定化的一种方法。 由于交联剂对酶有一定的破坏，现在较少单独使用，经常与其他方法 结合使用 2 s , 2 9 1 。 共价键合法实际上是一种表面修饰，基质可以是转换器即电极本 身或另外一种能够在其操作中沉积到电极表面的聚合物材料，即通过 共价键将酶直接结合到电极表面。如马来酸酐共聚物，甲基丙烯酸 酸酐共聚物及其衍生物，或其他带有o h 、- n h 2 、s h 、c o o h 等功 能基团的聚合物材料以薄层的形式沉积到整个电极上。通过单体或其 堡主堂垡丝壅 衍生物共聚合，或者通过与预聚物直接反应，可以将功能性基团加到 聚合物上，酶通过氨基酸残基进行结合 3 0 j 。在利用天然材料如甲壳素 p n 、丝素蛋白【3 2 1 等固定酶时，通常也是用共价键合法，通过酶的氨基 酸残基与其上的酰基共价结合的。共价键合法的优点是酶结合的牢 固，稳定性好。酶固定的稳定性与其他方法相比是最好的。但如果共 价键在生物分子的活性部位键合，或反应条件苛刻，都会使生物分子 的活性降低。 包埋法实际上是酶在凝胶或聚合物基体中的物理保留。人们已经 对许多种聚合物作为捕集酶的基质进行了全面的研究，如明胶【3 3 j 、环 糊精 3 4 1 、聚苯胺弼、聚氯乙烯口6 1 、聚丙烯氰如、聚乙烯亚胺p 8 1 及其 他许多聚合物以及胶体嗍，利用他们的单体聚合时将酶一起包埋其 中。此法的优点是a 可采用温和的实验条件及多种凝胶或聚合物； b 大部分酶可很容易地掺入聚合物膜中，一般不产生化学修饰；c 由 于没有化学变化，对酶活性影响较小：d 膜的孔径和几何形状较易 控制；e 包埋的酶比较牢固，并可结合其他固定化方法如共价键合 和交联进一步改进包埋的稳定性：可固定高浓度的活性生物组分等 嗍。此外，电沉积高分子聚合物包埋法具有更好的化学和物理稳定性， 沉积的聚合膜与基体电极有更强的结合力，因此电沉积高分子聚合膜 修饰电极具有更强的机械强度，对某此分析底物有特定的选择性富集 作用，从而增强了传感器的稳定性，选择性和灵敏度。与其它固定方 法相比，电沉积方法对电极的几何形状和面积大小没有限制，并且具 有厚度可控，重现性好，膜均一性好等优点，另外，电沉积方法适用 于简单电极，因此比较容易发展微型生物传感器。近年来电沉积方法 在制作生物传感器方面的应用一直引起人们的广泛关注。 基于电沉积壳聚糖和多巴胺氧化聚合膜的安培生物传感研究 1 2 电化学石英晶体微天平( e q c m ) 1 2 1q c m 概述 早在1 8 8 0 年，c u r r i e 兄弟就发现某些晶体具有压电效应【4 1 1 ，压 电效应包括“正压电效应”和“逆压电效应”。p q c 在气相中振荡时， 其性能与表面涂层的质量、物态、性质、分布、体声波由晶体向涂层 的传播及声阻抗等因素有关。1 9 5 9 年德国物理学家s a u e r b r e y 提出了 厚度剪切压电石英晶体频移蛳与晶体表面均匀刚性薄膜物质质量之 间存在线性关系，即著名的s a u e r b r e y 方程【4 2 】： 颈 掰州阻“2 】- 2 2 6 4 xi 旷符a m a( 1 一1 ) 式中，矗为晶体基频( i - i z ) ，蛳为晶体频移( h z ) ，a 为电极表面积 ( c m 2 ) ，岛和硒分别为石英晶体的密度( 2 6 4 8 9c m - 3 ) 和晶体剪切模 量( 2 9 4 7 1 0 g c m s 2 ) ，朋为刚性薄膜质量变化( g ) ，负号表示 质量增加导致频率下降。 早期学术界一直认为压电检测器只能应用于气相中 4 3 1 ，直到 1 9 8 0 年以后，才实现了压电液相稳定振荡并成功地用于分析化学领 域，从而开辟了液相压电传感的新领域，大大地拓宽了它的应用范围。 研究表明，压电晶体除了有灵敏的质量效应以外，还存在有更多的非 质量效应，如粘度、密度、应力、粘弹性、电导率、介电常数、表面 性状等介质或界面效应。k a n a z a w a 等人 4 4 1 率先提出了描述p q c 谐振 频率与溶液粘密度关系的方程。此后。m a r t i n 等人 4 5 1 提出了一系列质 量及液体负载同时影响的p q c 等效电路参数方程。根据m a r t i n 方程， 龋、焉和i 都与( 风仇) m 的改变量线性相关由于动态电阻和电导 半峰宽( 蛎l ，2 ) 都能反映e q c m 振荡能量的衰减 4 6 1 ，因此，对其进 行分析，我们可使用如下方程估算净的液体负载效应 4 6 - 4 s ： 2 心。，6 矾m * a 眉，l = 2 霄f a l l l = 4 心。，乌氏i 肛。允瓦一_ 4 心l q 魄( 1 - 2 ) 硕士学位论文 式中6 而l 也l ，蛳l ，a r l l 和工l l 分别是由于溶液的粘度( ，7 l ) 和密度 ( p d 的改变引起的觚咖石，足t 和厶的改变值，其中厶和厄分别 为石英晶体在空气中的动态电感和谐振频率，为压电石英晶体的 弹性常数( 2 9 5 7 1 0 mnn l - 2 ) 。 方程( 1 - 2 ) 的意义明显在于如果实验中响应满足 2 咒，a 名。* a 墨= 2 ，目f a 止，= 4 咒厶。蜣办。，丘瓦a - 4 咒。蜕 ( 1 - 3 ) 那么，鲕，a r i ，a l i 和6 蛎i ，2 应该完全受i q c 电极表面附近局 部溶液粘密度的变化控制；否则，其它因素例如质量改变和电极表面 粗糙度也可能起作用【4 9 1 。根据方程( 1 3 ) ，对9 - m h z 的石英晶体而 言，匀缸慨a r l l 和蛳l 溉s 4 f o i 彪l 的斜率分别约为1 0l i zq 以和 加5 0 。事实上，这些斜率是净的液体负载效应的特征。通常、f o a r l 和蛳6 酶i ，2 的绝对值越大，粘密度效应就越弱，s a u e r b r e y 方程所反 映的质量效应就越强。因此，方程( 1 - 2 ) 和( 1 - 3 ) 能很好地评估粘 密度对e q c m 频率的影响。 1 2 2 电化学石英晶体阻抗技术 液相e q c 谐振的研究方法包括振荡器法( 主动法) 和阻抗分析 法( 被动法) ，主动法只提供晶体的振荡频率，而被动法可得到晶体 谐振行为的多维压电信剧5 0 引l 。常规的e q c m 将电化学技术与主动 法结合，一般只监测压电石英晶体的振荡频率；若与被动法结合，电 化学实验现场能更全面地表征石英晶体谐振行为并获取多维压电信 息，按测量技术特点我们称为电化学石英晶体阻抗分析 ( e l e c t r o c h e m i c a lq u a r t zc r y s t a li m p e d a n c ea n a l y s i s ，e q c l a ) 技术。 该研究方向的先驱者是n o e l 和t o p a r t 等人【5 2 l 。然而，他们仍把这一 新技术称为e q c m 。由于e q c t a 技术在电化学微扰期间允许同步、 快速测量i q c 谐振的电声阻抗( 或导纳) 数据。因此，通过对多维 基于电沉积壳聚糖和多巴胺氧化聚合膜的安培生物传感研究 压电信息( 这些信息能够很完全的表征p q c 谐振) 的分析，e q c t a 能够判断外来膜是否刚性 4 5 , 4 6 4 s 5 3 - 5 6 1 2 3 q c m 和e q c m 的应用 q c m 和e q c m 技术已经被用于电化学、电分析化学和生物分析 领域，主要包括： 1 2 3 1 研究膜的形成机理 e q c m 可现场检测电极表面低至纳克级的质量变化及修饰膜粘 弹性等参数的变化，因此，e q c m 可对电极表面修饰的膜的形成过程、 膜的厚度、膜的氧化还原性、膜的吸附脱附行为和膜中离子的迁移情 况进行定量地表征。x i e 掣韧用e q c m 研究了在水溶液中电化学聚合 吡咯过程所伴随的离子迁移与p h 之间的关系，比较研究了不同电解 质( h c l 0 4 和h 2 s 0 4 ) 和不同电极材料( p t 和a u ) 对聚苯胺降解过 程的影响【 】，还研究了裸金电极和4 氨基噻吩修饰电极上电聚合苯胺 膜的粘弹性【矧c h a n g 等用聚紫罗碱修饰的金电极构成的e o ：m ， 去检测百草枯的氧化还原行为。s k o m p s k a 等哪谰e q c m 研究了聚乙 烯基咔唑膜，证明膜的形成过程包括阴离子的不可逆嵌入过程和聚合 物通过乙烯基的交联过程。 1 2 3 2 研究金属的沉积与溶出 e q c m 低至纳克级的高质量敏感性使其可现场研究金属欠电位 沉积( u n d e r - p o t e n t i a ld e p o s i t i o n ，u p d ) 。m e l r o y 等首次把e q c m 用于原位研究u p d 过程，测量了p d 和c d 在a u 电极上u p d 沉积的 吸附价。b r u c k e n s t e i n 等【6 3 】研究了银电极上铅的u p d 机理。此外， e q c m 在测量金属溶解腐蚀速度方面更为有效其明显的优点，即费时 短灵敏度高，因而在金属【鲫及合金睁1 的腐蚀研究中也得到了广泛的应 用。x i e 等嗍用e q c m 研究了f e ( c m 6 3 7 氧化还原过程中c n 对金电极 硕士学位论文 的腐蚀。 一 1 2 3 3 在生化分析领域的应用 ( i ) 生物物质的定量测定，c h e n g 等【6 7 】用q c m 测定了血浆中 肝素的含量；a l f o n t a 等t 6 s 利用酶标免疫放大法联用电化学与q c m 技 术测定了霍乱毒素，检测限可达i 0 xl f f ”m ：在微生物方面，利用 与细菌、病毒及细胞等相关抗体的特异性结合，成功地实现了对大肠 杆菌、沙门氏斟7 0 】、金黄色葡萄球菌川、疱疹病毒 7 2 1 、血中t 细 胞嗍等的测定。f a w c e t t 等【州首先利用e q c m 研究d n a 杂交； o k a h a t a 等f 7 5 】把单链d n a 固定在石英晶体上用于检测溶液中互补的 d n a 链；( 2 ) 蛋白质吸附过程研究，在研究蛋白质的吸附过程动力 学中，q c m 是少数可以提供在线实时信息的手段之一。e b a r a 等【7 0 】 首先在压电石英晶体表面用l a n g m u i r 膜平衡法制备了单层磷脂膜， 研究了蜂毒素( 一种线形多肽) 和b 球蛋白在磷脂膜上的吸附，并 且比较了吸附的蛋白质在液相中和吹干后在气相中对p q c 频率响应 的影响。本室也应用电化学石英晶体阻抗分析技术研究了蛋白质在不 同物质修饰的压电石英电极表面的吸附过程 7 7 4 3 1 及生物物质的表面 固定过程等 8 4 - 8 9 1 ；( 3 ) 免疫动力学和酶动力学研究，利用压电技术中 的质量传感和非质量传感与免疫反应或酶反应结合，应用于免疫或酶 动力学研究。o k a h a t a 等【蚰】引入脂双层复合物作为q c m 涂膜和 m u r a t s u g u 等【9 羽发展的胶乳压电免疫传感器( l p e i c ) 都促进了新型 压电免疫传感研究的展开。本室也应用e q c m 技术现场监测抗人免 疫球蛋白g 分别在裸金电极、聚邻苯二胺( p o p d ) 修饰电极和正十 二硫醇( c 1 2 s h ) 修饰电极上的吸附以及与入免疫球蛋白g 的反应 9 2 】。 质量传感多通过酶联质量放大技术以提高检测灵敏度 9 3 4 5 】；同时还出 现了一些基于非质量效应的压电传感器用于酶促反应分析，利用压电 传感器对体系电导率、粘密度等非质量因素的响应，对酶促反应动力 基于电沉积壳聚糖和多巴胺氧化聚合膜的安培生物传感研究 学进行研究已显示出广阔的应用前景 9 6 - 9 9 ；( 4 ) 药物与生物大分子相 互作用的研究，s u 等b o o | 利用q c m 监测了抗癌的铂类药物与d n a 的 相互作用，发现顺、反铂类药物与d n a 的作用过程不同，这为以后 研究药物分子与d n a 的相互作用机理以及提供一种简便的药物筛选 技术作出了探索性的尝试。田等利用压电石英晶体阻抗分析法研究了 抗肿瘤抗生素( 丝裂霉素c 和博来霉素) 与d n a 的相互作用动力学， 并得出了速率常数等动力学参数【l 优】。另外，q c m 对生物过程的研究 也有报道，h e 等 i 0 2 利用q c m 检测培养液化学性质的改变对大肠杆 菌进行了测定，检测范围为l 妒1 0 7 c e l lm l 1 。同时，也测定了细菌的 生长速度。b a o 等 t 0 3 1 0 4 1 基于培养液的凝固提出了一种测定细菌的方 法，监测了大肠杆菌和溶壁微球菌的生长过程。 1 3 本文构思 近十几年来生物传感器的研究和应用发展迅猛，方兴未艾。各种 生物识别分子的固定方法及固定材料被用于生物传感器的研究，其中 利用高分子聚合膜包埋法固定生物分子的报道屡见不鲜，寻找合适的： 高分子聚合膜，以及引入纳米材料，从而提高生物传感器的性能，是 当前研究的热点之一。常规e q c m 大体上只记录压电石英晶体( p q c ) 振荡频率的改变值，与之相比，电化学石英晶体阻抗分析( e q c i a ) 技术通过快速测量石英晶体电声阻抗而获取更全面的晶体谐振信息， 从而可同步动态研究电化学反应或过程的多种理化参数和材料科学 性质，如电极表面低至纳克级的质量变化、溶液粘密度和修饰膜粘弹 性等。有鉴于此，在本研究室已有的研究工作基础和广泛的文献工作 基础上，本文以电沉积高分子聚合膜包埋生物识别分子的方法制备了 基于壳聚糖水凝胶和多巴胺电氧化聚合物的生物传感器，实现了对葡 萄糖、h 2 0 2 的高灵敏检测；并提出了利用对苯醌电还原的方法制备 硕士学位论文 壳聚糖水凝胶用于固定生物识分子和纳米粒子的新方法，以电化学石 英晶体阻抗分析技术现场监测壳聚糖水凝胶的动态形成过程。 基于电沉积壳聚糖和多巴胺氧化聚合膜的安培生物传感研究 第二章基于l 4 苯醌电还原诱导沉积厚度可控酶壳聚糖一 多壁碳纳米管复合膜的葡萄糖传感器 2 1 引言 壳聚糖是一种甲壳素脱已酰的多糖衍生物，它含有丰富的氨基， p k 为6 3 1 0 5 1 。在p h 低于p k 时，大部分氨基被质子化，使壳聚糖 成为一种水溶性的聚电解质。而当p h 上升到p k 以上时，氨基去质 子化，壳聚糖变为不可溶( 示意图2 - 1 ) 。由于壳聚糖具有许多吸引人 的特性，如良好的成膜能力、生物兼容性好、无毒性、粘附力强、机 械强度高、对水的高渗透性和易化学修饰等，使得它成为一种很好的 固定生物分子的基质1 0 6 1 。 侈挚藐嚣缮徽 s o l u b l e i n s o l u b l e 据报道，壳聚糖水凝胶可以通过h 2 0 的电还原消耗质子沉积到 电极表面，与电极紧密结合并保持原有的性质【1 昨n o l 。l u o 等叫1 1 4 1 在此基础上研制了一系列基于电沉积壳聚糖膜的生物传感器。但是此 方法需要在电极表面施加较高的电位( - 3 0v ) 1 1 3 1 或强的电流密度 ( 5 0a m 2 ) t 1 0 8 1 来促使h 2 0 发生还原反应消耗质子，这样容易使溶液中 的酶变性或失去生物活性。并且在此过程中伴随着剧烈的析氢反应， 电极表面不断有氢气泡释放出n 1 2 1 ，沉积的壳聚糖膜有可能呈现多孔 性和不均匀的结构。 由于苯醌的电还原过程中也需要消耗质子，基于此，我们提出以 l ，4 苯醌( b q ) 作为一种“质子消耗体”，通过苯醌的电还原诱导沉 硕士学位论文 积厚度可控的壳聚糖膜。此方法的实验条件温和，只需在电极施加 - 0 1v 的电位即可实现壳聚糖水凝胶的沉积，避免了由于过高的电位 导致酶失活。另外，此方法非常迅速，2 0 0s 即可完成酶电极的制作， 而文献报道用析氢法沉积壳聚糖膜制备酶电极需1 0m i l l 1 1 3 1 ，从而节 省了时间。 为了更好地理解该方法沉积壳聚糖的过程及原理，绘制了示意图 2 - 2 。如图所示，在还原电位下，对苯醌在电极表面被电极给出的电 子还原，并消耗质子，同时一元弱酸分解补偿被消耗的质子维持平衡 使p h 值保持不变，随着反应的进行，电极表面局部的h a 被消耗殆 尽后，质子得不到补偿，平衡被打破，电极表面局部的p h 值升高与 本体溶液之间形成p h 梯度，当电极表面p h 大于6 3 时即可产生壳 聚糖沉积现象。 s d l e l n e2 - 2 i l l u s t r a t i o no fc se l e c t m d e p o s i t i o nt r i g g e r e db yb q r e d u c t i o n 基于电沉积壳聚糖和多巴胺氧化聚合膜的安培生物传感研究 碳纳米管由于具备许多独特的性质，如高电导率、高机械强度和 化学稳定性，非常适合于发展电化学传感器和生物传感器。碳纳米管 修饰电极对许多化合物的电化学过程展现出了良好的催化性能【s 】。 由于碳纳米管难溶于一般的溶剂中，大多数情况下，碳纳米管是先分 散在二甲基甲酰胺和丙酮中，然后涂覆在电极上的。这种制备电极的 方法复杂，而且由于使用了有机溶剂使得生物传感器的应用范围受到 了很大了限制。g o r s k i 等 n 6 l 报道了基于溶解碳纳米管在壳聚糖溶液 中的脱氢酶传感器。然