（动物学专业论文）普鲁兰类酵母g7b菌株β甘露聚糖酶的研究.pdf

卜、 ， l 零 普鲁兰类酵母g 7 b 菌株p 甘露聚糖酶的研究 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 2 0 10 一0 3 2 6 本人 研究成果 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或 其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：翩签字日期：矽加年6 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 黝 签字日期：如向年月7 日 新擀砂u 卞 签字日期：仉p 年r 月，臼 维素 而且 饲料、造纸、印染和石油开采等领域中得到了广泛的应用。 本文从实验室已知的1 7 株具有p 甘露聚糖酶活力的海洋酵母菌株中，筛选 出自中国南海表层海水的酵母菌g 7 b 菌株所产p 甘露聚糖酶活力最高。通过传 统的酵母菌种鉴定及分子生物学鉴定，最终鉴定该株海洋酵母菌属于普鲁兰类酵 母( a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ) 。酵母菌g t b 菌株所产b 甘露聚糖酶粗酶液最适反 应p h 为5 0 ，最适反应温度为6 0 c 。通过对其发酵培养基优化，其最适产酶培 养基和条件为：角豆胶o 6 “加) ；酵母粉o 5 ( w v ) ，( n h 4 ) 2 s 0 40 5 ( w v ) ， k h 2 p 0 4o 2 ( w v ) ；海水配制，培养基起始p h 调至6 0 。在2 8 ，1 8 0r p m 震 荡培养4 8h ，其培养上清液所含b 甘露聚糖酶活力最高，达到1 0 5u i i l l 。用粗 酶液水解底物，产物为少量甘露糖单糖和甘露低聚糖。 为进一步研究b 甘露聚糖酶，我们对酵母g 7 b 菌株产的p 甘露聚糖酶进行 了纯化，并对纯化酶的性质进行了研究。通过s e p h r a d e x t mg 7 5 凝胶过滤层析 和d e a es e p h a r o s ef a s tf l o w 阴离子交换层析方法对其所产p 甘露聚糖酶进行 纯化，通过s d s p a g e 检测其分子量大约为6 6k d a ，获得单一的目的条带。最 终纯酶与原样品相比，纯化倍数为1 8 6 倍，回收率为1 7 2 。p 甘露聚糖酶最适 作用p h5 0 ，在p h5 0 7 0 范围内稳定，最适作用温度6 0 ，在低于5 0 酶的 稳定性较好。环境中的m 9 2 + 和z n 2 + 对酶有一定激活作用，而h 9 2 + 、m n 2 + 和c u 2 + 对酶有抑制作用，尤其是h 9 2 + 和m n 2 + 对酶有强烈的抑制作用。所有的蛋白抑制 剂对p 甘露聚糖酶都有一定的抑制作用，其中s d s 的抑制作用最为明显。p 甘 露聚糖酶对底物角豆胶的动力学常数值和最大反应速度戤分别是2 9 4 5 1 i l g m l 和2 7 9 “m o l ( m i n * m 1 ) 。该酶水解底物角豆胶，通过薄层层析分析，其产 物主要为甘嚣低聚糖和少量单糖，说明其具有p 1 ，4 甘露聚糖内切酶活性，能够 随机水解甘露聚糖内部的p 1 ，4 一甘露糖苷键，证实该酶为p l ，4 一甘露聚糖酶。 关键词：海洋酵母菌；3 - 甘露聚糖酶：发酵条件优化；纯化 i s o l a t e df r o mt h ec u l t u r ec o l l e c t i o no f0 1 1 1 l a b am u c hh i g h e re n z y m ea c t i v i t yc o u l d b ed e t e c t e df r o mt h es t r a i nn a m e dg 7 b ，w h i c hw a si s o l a t e df r o mt h es e aw a t e rs a m p l e o ft h es o u t hs e aa n di n d e n t i f i e dt ob ea u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s t h eo p t i m a l 1 3 - m a n n 锄a s ea c t i v i t yc o n d i t i o nw a sp h5 0a n d6 0c e n t i g r a d e a f a ra no p t i m i z a t i o n , t h em o s ta p p r o p r i a t em e d i u mw a sl o c u s tb e e ng u m0 6 ( w v ) ，y e a s te x t r a c t 0 5 ( w v ) ，a m m o n i u ms u l f a t e0 5 ( w v ) ，p o t a s s i u md i h y d r o g e np h o s p h a t e0 2 ( w v ) i ns e aw a t e r t h ei n i t i a lp hs h o u l db ea d j u s t e dt o6 0 a f t e rs h a k i n gi n c u b a t i o na t2 8 c e n t i g r a d ea n d18 0r p mf o r4 8h o u r , t h ef i - m a n n a n a s ea c t i v i t yo f t h es u p e m a t a n tc o u l d r e a c h10 5 u m 1 a f t e rd e a l i n gs u b s t r a t e 谢t i lg r o s sb - m a n n a n a s e ，t h ep r o d u c tw a s m a n n a na n dl i t t l em a l l n o - o l i g o s a c c h a r i d e s t h i si m a n n a n a s ew a sp u r i f i e da n di t sc h a r a c t e rw a sf u r t h e rs t u d i e d a6 6 k d a p u r i f i e de n z y m ew a so b t a i n e du s i n gs e p h a d e x t mg 一7 5g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y a n dd e a es e p h a r o s ef a s tf l o wa n i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y t h eo p t i m a l f u n c t i o np ho fp u r i f i e dp - m a n n a n a s ei s5 0 ，a n di tw o u l ds t a ys t a b l eb e t w e e np h 5 0 - 7 0 t h eb e s tr e a c t i o nt e m p e r a t u r ei s6 0c e n t i g r a d ea n di sm o r es t a b l eb e l o w5 0 c e n t i g r a d e m 9 2 + a n dz n 2 + c o u l ds t i m u l a t et h i se n z y m ew h e r e a st h eh 9 2 + ，m n 2 + a n d c u 2 + c o u l ds u p p r e s si t a l lt h ep r o t e i ni n h i b i t o r sc o u l ds o m e h o ws u p p r e s st h ep u r i f i e d f ；- m a n n a n a s e ，o fw h i c hs d sw a st h em o s ti n t e n s eo n e t h e a n d 默f o rt h e s u b s t r a t eo fp u r i f i e de n z y m ew a s2 9 4 5 1p m l 和2 7 9 1 m a o l ( m i n m 1 ) ，r e s p e c t i v e l y a tl a s t ，t h er e s u l to ft h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h yh a si l l u s t r a t e dt h a tt h em a i np r o d u c to f l o c u s tb e e n g u m w i t h p u r i f i e dp - m a n n a ：n a s e w a sm a l n a n a n dl i t t l e m a n n o o l i g o s a c c h a r i d e s ，w h i c he n s u r e dt h a tt h i se n z y m eb e l o n g e dt oe n d o p 一1 ，4 - m a n n a n a s ef a m i l ya n dt h ea u t h e n t i c i t yo ft h i se x p e r i m e n tc a r lb et e s t i f i e d k e yw o r d ：m a r i n ey e a s t ；1 3 - m a n n a n a s e ；o p t i m a lc o n d i t i o n s ；p u r i f i c a t i o n 1 1 甘露聚糖的组成和结构 第一章绪论 甘露聚糖( m a l l n a n ) 是自然界中广泛存在的一种高分子量的碳水化合物， 属于半纤维素家族，在结构上它是一类以1 3 1 ，4 甘露糖苷键连接的线状多糖，半 乳糖或葡萄糖也可以通过a 1 ，6 糖苷键与甘露糖主链的侧链相连形成分支。一般 可以分为4 大类：线状甘露聚糖( 1 i n e a rm a n n a n ) ，葡萄糖甘露聚糖( g l a u e o m a n n a n ) ， 半乳甘露聚糖( g a l a c t o m a n n a n ) 和半乳糖葡萄糖甘露聚糖( g a l a c o g l u c o m a n n a n ) ( p e t k o w i c ze ta 1 ，2 0 0 1 ) 。线状甘露聚糖除有p 1 ，4 糖苷键连接甘露糖主链外，其 侧链还含有少量半乳糖，其含量低于5 。葡萄糖甘露聚糖的d 1 ，4 甘露糖苷键中 随机的出现少量的1 3 1 ，4 葡萄糖苷键，半乳糖以a 1 ，6 糖苷键的形式连接到主 链上形成侧链( n o r t h c o t e ，1 9 7 2 ；p o p aa n ds p i r i d o n , 1 9 9 8 ) 。半乳糖甘露聚糖，包 含一个水溶性的p 1 ，4 甘露糖苷键项链的主链，支链上具有许多以仅1 ，6 糖苷 键连接半乳糖残基，如皂荚豆的内胚乳所含有的半乳糖甘露聚糖，半乳糖和甘 露糖比例约为l ：2 5 ( 蒋建新等，2 0 0 3 ) 。葡萄糖半乳糖甘露聚糖则是在p 1 ，4 甘露糖主链上，包含着以葡萄糖和甘露糖为分支末端的半乳糖残基( a s p i n a l le ta 1 ， 1 9 6 2 ；p o p aa n ds p i r i d o n , 1 9 9 8 ) 。 图1 1 线状甘露聚糖结构图 f i gl - 1t h es t r u c t u r eo fl i n e a rm a n n a n 图1 - 2 半乳糖甘露聚糖结构图 f i gl - 2t h es t r u c t u r eo fg a l a c t o m a n n a n 半纤维素在自然界中存在极为广泛，甘露聚糖作为植物半纤维素的重要组 分，广泛存在于一些植物组织 ( f i h o ，1 9 9 8 ；p e t k o w i c ze ta 1 ，2 0 0 1 ) ，其在植物细 普鲁兰类酵母g 7 b 菌株b 甘露聚糖酶的研究 胞壁中作为结构多糖类物质，将木质素和纤维素结合在一起形成木质纤维素 ( p u l sa n ds c h u s e i l ，1 9 9 3 ；f i l h o ，1 9 9 8 ；s a h ae ta l ，2 0 0 3 ) ，木质纤维素是一类重要的 可再生资源和能源( b r o d a , 1 9 9 2 ) 。某些软木组织中所含有的半纤维素能达到干 重的2 5 3 0 ( p e r e ze ta 1 ，2 0 0 2 ) ，其主要是半乳糖葡萄糖甘露聚糖和半乳糖甘露 聚糖，其中甘露糖，半乳糖，葡萄糖残基比例大约为3 ：l ：1 ，而硬木组织中的 半纤维素就要少一些，大约为干重的3 5 ，所含有的葡萄糖甘露聚糖的甘露糖， 葡萄糖残基比例为2 ：1 ( p u l sa n ds c h u s e i l ，1 9 9 3 ) 。其作用是将植物组织中纤维素 牢牢的结合在一起( p r e s t o n ，1 9 6 8 ；b r e n n a n e ta 1 ，1 9 9 6 ；l i e p m a ne ta 1 ，2 0 0 7 ) 。在 豆科植物细胞壁中，甘露聚糖是主要的组成成分，比如魔芋，瓜儿豆和角豆，其 可以作为储存组织存在于这些豆科植物的细胞壁和胚乳中( m e i e ra n dr e i d , 1 9 8 2 ) 。另外甘露聚糖也可以参与吸胀作用来保持水分。一些研究表明，甘露聚 糖在某些时候也可以以信号分子的形式，对植物的生长产生影响( l i e p m a n e ta 1 ， 2 0 0 7 ) 。 甘露聚糖的结构相对来说比较稳定，在传统的工业生产中，除了利用强酸， 强碱，高温，高压等极端的条件，普通方法难以去除，而用这些传统方法往往会 给环境造成很大负担，而且在工业生产中的成本也会增加。因此，研究利用b 甘露聚糖酶来降解甘露聚糖来代替原始的工业方法，具有非常重要的应用价值。 1 2 甘露聚糖水解酶( 系) 的组成和分类 要完全水解甘露聚糖，需要许多酶协同作用，包括以下几类( 1 ) p 甘露聚 糖酶( 1 ，4 一b d - m a n n a nm a n n o h y d r o l a s c ，e c3 2 17 8 ) ，是一种内切半纤维素酶，能够 随即水解甘露聚糖主链上所含的b 1 ，4 甘露糖糖苷键，产生新的碳链。( 2 ) 肛 甘露糖苷酶( 1 ，4 一b d - m a n n o p y r a n o s i d eh y d r o l a s e ，e c3 2 1 2 5 ) ，是一种外切酶，从 甘露聚糖或甘露低聚糖的非还原性末端上或是切下一个甘露糖( c o u g h l a ne ta 1 ， 1 9 9 3 ；w o n ga n ds a d d l e r , 1 9 9 3 ) 。( 3 ) p 一葡萄糖苷酶( 1 ，4 - p d 舀u c o s i d eg l u c o h y d r o l a s e ， e c3 2 1 2 1 ) ，也是一种外切酶，作用在甘露低聚糖的b 1 ，4 葡萄糖苷键上，从 非还原末端上切下一个葡萄糖单糖。( 4 ) a 半乳糖苷酶( 1 ，钿d g a l a c t o s i d e g a l a c t o h y d r o l a s e ，e c3 2 1 2 2 ) ，则是一种脱支酶，能够水解以q 1 ，每半乳糖苷键 与甘露聚糖主链相连的侧链，从而为其他酶的进一步水解提供了底物( f i l h o ， 2 1 9 9 8 ) 。( 酰基团。 多卅阳舳 ”晒i 娥- 1 一一 一一 g 岭p 1 m a n p - 1 - - , 4 m a n p ( 1 - - 4 ) 1 3 m a n p ( 1 - - 4 ) 一p m a n p 一一 一一 g i c 口一6 一 图1 3 甘露聚糖水解酶作用方式 f i g1 - 3e n z y m a t i ca t t a c ko nm a n n a l ls t r u c t u r e 1 3p 一甘露聚糖酶的作用机理及水解产物 b 甘露聚糖酶( 1 ，4 p d m a n n a nm a n n o h y d r o l a s e ，e c3 2 1 7 8 ) 是一类能够水解 甘露聚糖主链上所含的1 3 1 ，4 甘露糖糖苷键的内切半纤维素酶，其作用机理见 图1 3 ，底物包括线状甘露聚糖，半乳甘露聚糖，葡萄糖甘露聚糖和半乳糖葡萄 糖甘露聚糖。甘露聚糖经p 甘露聚糖酶作用后，通过h p l c 或纸层析方法分析， 产物一般是少量甘露糖单糖和2 1 0 个单糖分子构成的甘露低聚糖，酶和底物的不 同来源对产物的聚合度有着很大的影响( c l e a r y , 1 9 8 8 ：田新玉等，1 9 9 3 ；杨文博 等，1 9 9 5 ；a r i s o ne ta 1 ，1 9 9 3 ) ，其对底物水解程度是不相同的，其作用方式和深 度主要与葡萄糖和a 半乳糖残基在主链中的位置、含量和整个碳链的酯酰化的程 度有关，例如枯草芽孢杆( b a c i l l u ss u b t i l i s ) k 5 0 合成的p 一甘露聚糖酶，对于瓜儿豆 胶和咖啡豆所含有的半乳糖甘露聚糖的水解率分别为5 和3 6 ( 余红英，2 0 0 2 ) 。 b 甘露聚糖酶水解产物也不完全相同，其作用位点是多糖链的非还原性末端的第 3 或是第4 个糖分子( e m i se ta 1 ，1 9 7 2 ) ，如s t r e p t o m y c e ss p 合成的p 一甘露聚糖酶在 水解魔芋粉中的葡萄糖甘露聚糖的过程中所得到的水解产物是少量甘露糖单糖 和4 种不同的直链的低聚糖，分别为：g m ，g g m ，g - m - m ，g - g - m m 其中m 代表 甘露糖，g 代表葡萄糖( t a k a h a s h ie ta 1 ，1 9 8 4 ) 。 普鲁兰类酵母g 7 b 菌株b 甘露聚糖酶的研究 不同来源的p 甘露聚糖酶对底物也有不用的要求，从黑曲霉中分离纯化得到 的p 一甘露聚糖酶要求甘露聚糖底物有4 个连续的残基，瓜儿豆胶中合成的b 甘露聚 糖酶则要求底物要有5 个连续的甘露糖残基( c l e a r y , 1 9 8 8 ；a r i s o ne ta 1 ，1 9 9 3 ) ，另 外学者认为，半乳糖之所以只会出现在甘露聚糖主链的两侧，与1 3 1 ，4 甘露聚 糖中所含的缎带式的两重轴结构是密不可分的( c l e a r y , 1 9 8 8 ) 。底物本身的物理 状态也会影响酶对底物的作用，一般来讲，难溶性的，成分复杂的，烃基被取代 的和多分支的甘露聚糖比较难水解，而聚合度比较低的甘露聚糖水解起来比较缓 慢( 关荣发等，2 0 0 2 ) 。 有研究表明，有些微生物合成的d 甘露聚糖酶具有转糖苷基的作用，如一株 s c l e r o t i u mr o l f s i i 合成的p 甘露聚糖酶水解甘露聚糖，当其水解底物为甘露多聚糖 时，产物主要为二糖和三糖，而以甘露四糖和c 1 4 标记的单糖为混合底物时，被 标记的单糖转移到了甘露低聚糖中( g u b i t ze ta 1 ，1 9 9 6 ) ，以甘露四糖和半乳糖为 底物时，产物则是a 1 6 半乳糖b 甘露三糖( g u b i t ze ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 4 产p 一甘露聚糖酶的微生物 1 4 1p - 甘露聚糖酶的来源 p 甘露聚糖酶广泛存在于自然界中，包括动物，植物，细菌，真菌。比如某 些豆科植物处于发芽阶段的种子( n o n o g a k ia n dm o r o h a s h i ，1 9 9 9 ；c l e r r y , 1 9 8 3 ) ， 番茄( 王傲雪等，2 0 0 6 ) 和莴苣( s u n i le ta 1 ，1 9 9 7 ) ，和一些低等海洋软体动物 如短滨螺的肠道分泌液中( l a r s s o ne ta l ，2 0 0 6 ；y a m a u r ae ta 1 ，1 9 9 6 ) ，都发现存在 p 甘露聚糖活性。但其中微生物作为酶来源的物种最为丰富，自2 0 世纪8 0 年代以 来，对微生物产1 3 甘露聚糖酶的研究进展很快，据不完全统计，已报道的国内外 共记录了产1 3 甘露聚糖酶的菌株已经近1 0 0 种，细菌中的芽孢杆菌，假单胞菌， 弧菌，真菌中青霉，曲霉，木霉都是产b 甘露聚糖酶比较常见菌群。其中原核微 生物来源的有：b a c t e r o i d e so v a t u s ( g h e r a r d i n ie ta 1 ，1 9 8 7 ) ，r h o d o t h e r m u sm a r i n u s ( g o m e sa n ds t e i n e r , 19 9 8 ) ，p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ( b r a i t h w a i t ee ta 1 ，l9 9 5 ) 等，其 中对芽孢杆菌属的研究是最多的如：最c i r c u l a n s ( h e c k e ta 1 ，2 0 0 5 ) ，b a c i l l u ss u b t i l i s ( 李文玉等，2 0 0 0 ) ，b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ( 彭爱铭等，2 0 0 4 ；张峻等，2 0 0 0 ) 等。 4 普鲁兰类酵母g 7 b 菌株9 甘露聚糖酶的研究 真核来源的有：a s p e r g i l l u sn i g e ，( 朱劫等，2 0 0 9 ) ，a s p e r g i l l u sn i g e ，( l i ne ta i ， 2 0 0 4 ) ，a s p e r g i l l u st a m a r i i ( c i v a se ta 1 ，19 8 4 ) ，a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s ( p u c h a r t e ta 1 ， 2 0 0 4 ) ，t r i c h o d e r m ar e e s e i ( j u h a s ze ta 1 ，2 0 0 5 ，；b i l e ye ta 1 ，19 9 3 ) ，p e n i c i l l i u m p u r p u r o g e n u m ( k u s a k a b ee ta 1 ，19 8 7 ) ，s c l e r o t i u mr o l f s i i ( s a c h s l e h n e ra n dh a l t r i c h ， 1 9 9 8 ) 。而真菌中，目前研究最多的是霉菌。相对于其他来源的1 3 甘露聚糖酶， 微生物来源的b 甘露聚糖酶具有活性高，成本低，提取方便，具有更宽的作用p h ， 温度范围和底物专一性等显著特点，因此备受重视。 1 4 2 产p 一甘露聚糖酶的发酵条件 大量研究表明大多数微生物所产p 甘露聚糖酶都是诱导酶( 陈权军等， 2 0 0 7 ) ，只有向培养基中加入d 甘露聚糖( 如角豆胶或槐豆胶) 时，才能大量合 成b 甘露聚糖。通常的液体产酶培养基都是将d 甘露聚糖直接作为碳源，而氮 源则分为2 种，一种是无机氮源：如尿素，( n h 4 h s 0 4 等；一种是有机氮源：如 蛋白胨，酵母粉等。而对于具体的不同微生物，其合成p 甘露聚糖酶的培养集中 还需要一些特殊的物质，如无机盐，金属离子( 李剑芳等，2 0 0 2 ) ，在a s p e r g i l l u s n i g e rn c h 1 8 9 的产酶培养基中则要加入t w e e n8 0 ( l i na n dc h e r t , 2 0 0 4 ) ，一些嗜 碱性微生物则对培养基的p h 和n a c l 浓度有比较高的要求( 马延和等，1 9 9 1 ) 。 本课题中所用的g 7 b 菌株在弱酸环境中有利于其p 甘露聚糖酶的合成。 1 4 33 - 甘露聚糖酶的酶活力测定 由于作为底物的甘露聚糖本身存在着的多样性，其水解产物也存在不小的差 别，因此b 甘露聚糖酶活力的测定目前尚未像淀粉酶或纤维素酶的测定那样形成 比较统一的方法。目前很多报道当中对b 甘露聚糖酶活力的测定，是以不同种类 甘露聚糖做底物，其中大多是以角豆胶，刺槐豆胶和魔芋粉为底物，其聚合度， 纯度和浓度都不完全统一，测定酶和底物的混合物在一定时间内还原糖的增加情 况，以此间接的反映p 甘露聚糖酶酶活力。同时不同底物和p 甘露聚糖酶结合能 力相差很大，因此不同底物对酶的活力影响很大，在不同报道中p 甘露聚糖酶活 力的定义也不尽相同，这种情况使得各文献报道的菌株之间产酶水平的可比性不 普鲁兰类酵母g 7 b 菌株8 甘露聚糖酶的研究 高。内切型b 甘露聚糖酶的酶解产物多为甘露低聚糖和少量甘露糖单糖，所以携 现有的酶活测定法及酶活定义，其酶活水平将普遍比外切型p 甘露糖糖苷酶低。 因此测定方法和活力单位定义标准的统一是目前急需解决的问题。 目前较为普遍的b 甘露聚糖酶酶活力定义是：一定反应体系中每分钟产生1 0 p m o l 还原糖量( 一般以甘露糖计) 所需的酶量为一个活力单位。 较为普遍的p 甘露聚糖酶酶活力测定方法是：取一定稀释度的酶液0 1 “，加 入0 9 面一定浓度的甘露聚糖( 溶于一定p h 的缓冲液中) ，最适反应温度下作用 1 0m i n , 沸水浴煮沸1 0r a i n 终止反应。同样条件和反应体系下，加入沸水浴煮过 灭活的酶液作为空白对照，测定还原糖的生成。 目前，测定还原糖含量的方法很多，比如：d n s 法( 张惟杰，1 9 8 7 ) ，刚果 红染色法( h i l h o r s te ta 1 ，1 9 9 4 ) ，s o m o g y i - n e l s e n 法( s p i r o ，1 9 6 6 ) ，斐林法和葸 酮法( 肖畴吁等，1 9 9 6 ) 。由于s o m o g y i - n e l s e n 法，灵敏度比较高，因此本文中选 用这种方法测定还原糖。 1 5p 一甘露聚糖酶的性质和分离纯化 1 5 1p 一甘露聚糖酶的性质 近几年，随着对p 甘露聚糖酶研究的不断深入和酶纯化方法的改进，许多微 生物所合成的b 甘露聚糖酶已经被分离纯化，这也更进一步加深了人们对p 甘 露聚糖酶组成，结构，功能和性质的了解。不同菌株之间的b 甘露聚糖酶的酶学 和理化性质并不相同，但由于所产大都是胞外酶，其纯化步骤也是相近的。首先 将发酵液收集，离心除去菌体后，收集含有p 甘露聚糖酶的蛋白的发酵液，用各 种理化方法浓缩后得到粗样品，再用缓冲液溶解样品后透析，进一步利用凝胶过 滤，离子交换和吸附层析进一步分离得到纯化后的酶样品。另外亲和层析，高压 液相色谱和电泳在分离纯化过程中也是经常被采用倒。尽管p 甘露聚糖酶可能有 多个不同的组分，各组分性质也不尽相同。一般来说只要分离方法和条件选择适 当，都能获得单一的b 甘露聚糖酶蛋白，甚至已经有关于获得了肛甘露聚糖酶 的结晶的报道( 朱秸等，2 0 0 7 ) 。 6 普鲁兰类酵母g 7 b 菌株b 甘露聚糖酶的研究 不同微生物来源的p 甘露聚糖酶的分子量、最适反应p h 、等电点、最适反 应温度、酶动力学常数、底物专一性都有着一定的差异。许多文献报道了不同来 源的d 甘露聚糖酶的分离纯化及性质研究，如马建华等报道的枯草芽孢杆菌株所 产p 甘露聚糖酶最适反应p h 为6 4 ，最适反应温度为5 0 ( 马建华等，1 9 9 9 ) 。 朱劫等报道的黑曲霉w m 2 0 1 所产d 甘露聚糖酶最适反应p h 为5 5 ，最适反应温 度为6 0 ，蛋白等电点p i 为4 0 ，蛋白质分子量为4 0k d a ( 朱劫等，2 0 0 9 ) 。陈一 平等报道的芽孢杆菌株m 5 0 所产p 甘露聚糖酶最适反应温度为5 0 ，最适反应 p h 为6 0 ，在p h5 o 7 05 0 以下酶稳定；同时f e ”，a l 3 + ，e d t a ，h g ：+ 对酶有 抑制作用，而b a 2 + ，m n 2 + 对酶有激活作用( 陈一平等，2 0 0 0 ) 。田亚平等报道的黑 曲霉w x 9 6 所产的b 甘露聚糖酶的最适反应温度为5 5 ，最适反应p h 为5 5 ，在 p h4 5 8 o ，温度为4 5 条件下稳定；c a 2 + 对酶有激活作用，a 矿，p b 2 + 对酶有抑 制作用，等电点p i 为3 8 ，蛋白分子量为5 1k d a ，以魔芋粉和瓜尔豆胶为底物时的 k m 分别为1 4 2 m g m l 和1 0 2 m g m l ，经测定酶蛋白分子中，酸性氨基酸a s p ，g l u 的 含量较高( 田亚平等，1 9 9 8 ) 。 真菌来源b 甘露聚糖酶的最适反应p h 偏酸，最适反应温度一般在5 5 7 5 。而细菌来源的d 甘露聚糖酶最适p h 却常见为中性或偏碱性，相比于真菌有 较好的稳定性，最适反应温度为4 5 7 0 ，等电点在2 5 6 5 之间，对重金属 例子和巯基修饰物比较敏感。在真菌和某些放线菌中，p 甘露聚糖酶有一定程度 的糖基化，而在细菌中糖基化的现象却很少。表1 1 中列出了一些微生物所产的 b 甘露聚糖酶及其酶学特性。 7 普鲁兰类酵母g 7 b 菌株1 3 甘露聚糖酶的研究 表1 - l 部分微生物p - 甘露聚糖酶的性质 t a b1 - 1c h a r a c t e r i z a t i o no fb - m a n n a n a s ef r o ms o m em i c r o o r g a n i s m a r m i l l a r i e l l at a b e s c e n s e j l 2 0 9 8 b a c i l l u ss u b t i l i sm 9 6 0 2 s c l e r o t i u m ，d 蜘f f t h e r m o t o g an e a p o l i t a n a 5 0 6 8 t r i c h o d e r m ar e e s e i b a c i l l u ss u b t i l i sw y 3 4 b a c i l l u sa l c a l o p h i l u s n 1 6 5 p e n i c i l l i u mo x a l i c u ms o 3 5 4 o _ 6 o 5 8 3 3 6 8 6 9 3 5 6 o 6 o 9 0 - 10 o 5 o 3 7 4 9 4 5 3 2 3 5 5 1 4 6 5 2 2 5 4 0 7 8 9 3 53 82 4 5 4 1 92 7 3 - 3 6o 7 72 0 5 6 50 2 33 8 5 l - 3 9 6 7 69 7 0 3 2 2 _- 3 4 7 2 9 - a d e m a r ke t a 1 1 9 9 8 姚冬生等， 2 0 0 6 李文玉 等，2 0 0 0 g u b i t ze t a 1 ，1 9 9 6 a r c a n de ta i 1 9 9 3 d u f f a u de ta 1 ， 1 9 9 7 s t a l b r a n de t a j 1 9 9 3 j i a n g e ta 1 ， 2 0 0 6 e m ie ta l 。 1 9 7 2 马延和，1 9 9 l k u r a k a k ee t a 1 ，2 0 0 6 1 5 2 常用的分离蛋白方法 酶的分离纯化是酶学研究的基础，最终的目的是提高酶样品的纯度或比活 力。因此分离纯化将粗样品中的杂蛋白去除，分离出需要的酶蛋白的同时，还要 保留酶蛋白的完整性和生物学活性，同时在这个过程中尽可能的提高酶蛋白的回 收率和纯度。 1 ) 根据酶分子量大小的不同来分离蛋白 经常采用的方法有透析、凝胶过滤法、超滤离心等。 透析在纯化中极为常见，可以通过透析使硫铵沉淀法获得的蛋白粗样品复 性，同时也可除去蛋白样品中的盐类( 脱盐或置换缓冲液) 、有机溶剂和低分子量 8 鲐 如 他 鼹 s ! 酪 普鲁兰类酵母g 7 b 菌株1 3 甘露聚糖酶的研究 的抑制剂等。透析膜的截留分子量有一定范围，目前市面上的透析膜从3 0 0 0 d a 到1 5 0 0 0 d a ( 以球形蛋白计算) 都有，如果目的酶分子量小于1 0 0 0 0 d a 则不建议 使用透析袋，在透析过程中目的蛋白有渗漏的危险。 超滤也是也是一种膜分离过程，一般用于浓缩和脱色。 凝胶过滤( g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ) 又称凝胶层析、分子筛层析或排阻层 析，是根据蛋白质分子大小分离纯化最有效的方法之一。在分离纯化过程中，根 据目的酶蛋白分子量的大小选择合适的凝胶型号，使要分离酶蛋白的分子量在凝 胶的有效工作范围之内。选择不同分子量的凝胶分离酶蛋白，能够脱盐，置换缓 冲液，除去热源和分子量差别比较大的非目的蛋白。 2 ) 利用蛋白溶解度的差别来分离各种蛋白质 蛋白质溶解度受外界因素的影响，其中溶液的p h 、离子强度、介电常数和 温度是影响蛋白溶解度的主要几个因素。因此适当改变条件，可达到将目的蛋白 从蛋白混合液中分离出来的目的。当环境p h 达到等电点时，蛋白质的溶解度最 小，因此通过调节蛋白溶液的p h 可以沉淀分离出目的蛋白。蛋白由于其表面所 带电荷不同，水化膜厚度不同，不同蛋白的盐析浓度也不同，根据不同蛋白盐析 浓度的不同可分级分离蛋白，硫酸铵沉淀是盐析法沉淀蛋白常用到的方法。同样， 不同蛋白在有机溶剂中的溶解度也有很大不同，控制有机溶剂的浓度也可分离蛋 白质，但高浓度的盐或有机溶剂往往会对蛋白的活性有一定影响，因此往往会结 合透析方法来除去盐和有机溶剂的影响。 3 ) 根据蛋白电荷性质差异来分离蛋白 不同蛋白暴露在分子外表面的侧链基团的种类和数量不同，在一定的p h 值 和离子强度的缓冲液中所带的电荷不同，因此根据电荷的不同可分离纯化目的蛋 白。 蛋白电泳不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段，也是研究 蛋白质性质很有用的方法。等电聚焦电泳分辨率很高，当蛋白分子等电点p i 相差 0 0 2 p h 以上时，就可以利用等电聚焦电泳将其分离出来。 离子交换层析过程中，可以通过改变蛋白质溶液中的盐离子强度、p h 和离 子交换柱的填料，从而影响蛋白质对不同的离子交换填料的吸附容量，蛋白质因 吸附容量不同或不被吸附而分离。洗脱可采用两种方式洗脱：一种是保持洗脱剂 9 普鲁兰类酵母g t b 菌株口甘露聚糖酶的研究 成分不变，另外一种则是逐渐改变洗脱剂的盐度或p h ，后一种方法又可以分为 梯度洗脱和分段洗脱两种。梯度洗脱一般效果好，分辨率高。 4 ) 根据蛋白疏水特性分离纯化蛋白 蛋白质多数疏水性氨基酸残基经过折叠后都藏在蛋白质的内部，但也有一些 露在表面，这些表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了不同蛋白质与 疏水柱填料结合能力存在差异，利用这种差异能进行蛋白分离。 疏水性层析柱所用到的填料比较廉价，而且经过这种层析柱纯化后的酶蛋白 具有生物活性，因此在蛋白分离纯化工作中疏水性层析法常被用到。层析时高浓 度盐水溶液中蛋白质在层析柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱下 来，故特别适用于硫酸铵溶液沉淀分离后蛋白溶液，可直接进样到层析柱上。 1 6p 一甘露聚糖酶的应用 目前，在国内外的食品，医药，饲料和工业等领域中，p 一甘露聚糖都具有极 其广泛的应用价值，但由于其分子量大，遇水后具有非常高的膨胀性和粘性，应 用于饲料中具有抗营养作用，从而使其应用受到限制。但当甘露聚糖经过1 3 - 甘露 聚糖酶降解，成为2 1 0 个聚合度的相对小分子量的甘露低聚糖时，其性质和生理 生化功能都会发生变化，从而具有独特的生理活性和功能。 1 6 1p 甘露聚糖酶在食品行业中的应用 在食品行业中，甘露低聚糖的制备主要是以魔芋胶、瓜儿豆胶和角豆胶等为 原料，经过1 3 甘露聚糖酶降解后而获得。这些具有特殊生理功能的甘露低聚糖作 为功能性糖类，人体并不能消化吸收，但可以被人体肠道中有益细菌吸收，有利 于人体肠道双歧杆菌和乳酸菌的生长( 秦湘红，张群芳，2 0 0 3 ：张力华等，2 0 0 6 ) ， 由此改善肠道内菌群结构，提高消化系统功能和机体的抗氧化能力，所以在食品 中添加一定量的b 甘露聚糖酶，可降低营养物质在肠道内的蓄积，调节肠道内环 境，减少肠道内有害微生物，使肠壁变薄，改善营养物质的消化吸收。另外，甘 露低聚糖还是一种水溶性膳食纤维，能降低人体内血清胆固醇和三脂酞甘油的含 量，从而起到保护肝脏的作用。甘露低聚糖在进入人体后，并不会引起血糖水平 的波动，因此可以作为甜昧剂用于糖尿病和高血压患者的保健食品。甘露低聚糖 1 0 普鲁兰类酵母g 7 b 菌株b 甘露聚糖酶的研究 还是一种防龋齿、低腐蚀性的功能性甜昧剂，它不能被链球菌发酵生成不溶性葡 聚糖，从而使得口腔内微生物缺少沉积、产酸和腐蚀的场所，有利于人体的口腔 健康( 张升晖等，2 0 0 5 ；马俊等，2 0 0 6 ；龙德清等，2 0 0 3 ；李坚，2 0 0 5 ；孙沈鲁等， 2 0 0 3 ；向进乐等，2 0 0 4 ) 。 b 甘露聚糖酶还可以降低咖啡和可可提取物的粘度( h e c ke ta 1 ，2 0 0 5 ) ，在 速溶咖啡的生产有着比较重要的应用价值。 1 6 21 3 - 甘露聚糖酶在饲料行业中的应用 甘露聚糖广泛存在于自然界中，在植物性饲料原料中它是除纤维素、木聚糖 之外，分布最广泛、含量最高的一类半纤维素，而且可以在一些植物( 如魔芋、 槐豆等) 中大量积累。同时甘露聚糖也是豆科植物种子和酵母细胞壁的主要成分。 而这些含有甘露聚糖的原料又被大量应用于饲料行业中，由于鱼类和畜禽等单胃 动物消化酶系中不含1 3 甘露聚糖酶，因此这些甘露聚糖就被认为是一种抗营养因 子( 何秉旺，1 9 9 9 ) ，不能被动物机体所吸收利用。因此向含有甘露聚糖的饲粮 加入外源酶1 3 甘露聚糖酶来消除抗营养作用已日益为人们所重视( 吕松乔， 2 0 0 4 ) 。现己证实，利用1 3 甘露聚糖酶降解植物性饲料的甘露聚糖具有诸多功1 1 - ( 1 ) 破坏植物性饲料细胞壁结构，使营养物质能与消化酶充分接触。+ 一“ ( 2 ) 促进动物生长，提高饲料转化率( s a n a ie ta 1 ，1 9 9 2 ；j a c k s o ne ta 1 ，1 9 9 9 ；d a s k i r a n e t a l 2 0 0 4 ) 。 ( 3 ) 提高动物内源酶( 如胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等) 的活性； ( 4 ) 减少甘露聚糖对微量元素的吸附，提高其的生物利用率( 陈小兵等，2 0 0 5 ； p e t t e ye ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 ( 5 ) 降低动物肠道内容物的粘稠度，减少粪便排泄，减少环境污染。 ( 6 ) 酶解产物甘露低聚糖能够改善禽畜肠道微生物菌群和提高肠道粘膜完整 性，提高禽畜的抵抗力。这些低聚糖可以作为饲用抗生素的替代品，它没有抗药 性，没有药物残留，是我国禽畜产品出口和解决药物使用等非关税壁垒的有效手 段( 张晓军等，2 0 0 5 ；乔新君等，2 0 0 6 ；李兴鸣等，2 0 0 6 ) 。 普鲁兰类酵母g 7 b 菌株b 甘嚣聚糖酶的研究 1 6 3p - 甘露聚糖酶在石油行业中的应用 目前，国内油气田开发中9 5 以上压裂液采用了植物胶压裂液体系，在传统 的石油压裂解过程中，使用生物聚合物如瓜胶，魔芋胶等这些甘露聚糖作为压裂 液来增加粘度，但开采结束后由于压裂液的粘度过大阻碍了工作液的返排，降低 了石油开采效率、破坏了环境，同时残留下来的聚合物以及破胶过程的不彻底均 会对地层产生损害j 降低地层的渗透率。而利用b 甘露聚糖酶降解瓜儿胶制备新 型的低分子量瓜儿胶压裂液则具有多方面的优点：可以不用破胶剂，返排率高， 对地层损害大幅降低，同时减少了水中不溶物含量以及水和化学试剂的用量，减 少了环境污染，裂缝导流能力也得到很大提高( 王丽伟