（生理学专业论文）产河豚毒素菌株rg3b6、rg33b的分离纯化及其发酵产物中河豚毒素的检测.pdf

摘要 河豚毒素( t e t r o d o t o x i n ，邢【) 是一种剧毒的生物碱类天然神经毒素，最初是从豚科鱼的卵巢 和肝脏中提取得到的。t i x 为典型的n a + 通道阻断剂，它能够与肌肉、神经细胞膜上钠离子通道 受体结合，抑制动作电位的传导。t r x 除用作神经生理学、肌肉生理学的工具药外，还具有相当 强的镇痛作用，并极有可能成为新的局部麻醉药和戒除药物依赖性的药物，而且具有不成瘾的特 点，这就使t t x 的应用范围得到进一步扩展。目前市场上的t i x 主要来源于河豚鱼的卵巢和肝 脏组织，如果能经微生物发酵生产t t x ，不仅可以满足市场的需求，而且对于保护河豚鱼免受因 河豚毒素的开发而濒危灭绝有着重要的生态价值。 关于 i t x 的起源问题一直存在较多争议。从首次从河豚鱼体内分离到t r x 以后的很长一段 时间内，人们一直认为t r x 是河豚鱼自身分泌产生的生物毒素，虽然进行了大量的组织学研究， 但在河豚鱼体内并未找到分泌 i t x 的腺体和导管。研究发现，t r x 还广泛分布于河豚鱼之外多 种脊椎动物及无脊椎动物的体内或体表。t i x 在与河豚鱼无亲缘关系和食物链关系的多种动物体 内的发现，使得t i x 的起源问题引起研究者的广泛兴趣与关注。尽管研究者已从多种海洋细菌 的发酵产物中检测t r x 及其类似物，但都没有真正获得微生物来源的t 1 l k 的结晶，因此无法从 结构与功能上系统地研究和确证其与组织来源的t r x 的完全一致性。已经证实，河豚鱼的卵巢 和肝脏的毒性高于河豚鱼其它组织与器官，而这种毒性的差异是否与不同组织中的产 i t x 菌的 分布及产t i x 能力的不同有关，尚无文献报道。 本论文以采集于我国渤海的红鳍东方豚为研究对象，对其不同组织器官中的微生物进行分离 纯化。并对其中两株产t t x 的优良菌r g - 3 3 b 、r g - 3 8 6 进行了种属鉴定，对其发酵产物中的t t x 进行分离与纯化，并将生物检测与化学检测相结合，对微生物源t t x 的结构和生物学功能进行了 研究。结果表明：( 1 ) 河豚鱼的卵巢、肝脏、肠道中存在可产生t t x 的细菌与放线菌，河豚鱼不 同组织毒性的差异与其中产t t x 菌株的产毒能力有关；( 2 ) 培养特征、生理生化特征、1 6 sr d n a 序列分析表明，r g - 3 3 b 为达松维尔拟诺卡氏放线菌r g - 3 8 6 为梭形芽孢杆菌，其中达松维尔拟 诺卡氏菌发酵产生t r x 的报道在国际上尚属首次；( 3 ) 获得微生物源的t 1 l k ，并从结构和生物 学功能的角度证实，微生物发酵产生的t r x 与河豚鱼组织中的t r x 是一致的，这一结果为i t x 的微生物起源假说提供了有力的实验依据。 总之，本论文首次对河豚鱼体内产t r x 菌的分布、微生物源1 t x 的分离与纯化进行了研究， 获得微生物源的1 t x 。并从结构和功能上证实其与组织来源的t r x 相一致，为通过微生物发酵 生产即提供了一种新思路，同时也为t i x 的微生物起源假说奠定了坚实的实验基础。 关键词：河豚毒素；产河豚毒素菌；达松维尔拟诺卡放线菌；梭形芽孢杆菌；红鳍东方豚。 i a b s t r a c t t e t r o d o t o x i n ( t r x ) i so n eo f t h em o s tp o t e n tl i o n p r o t e i un e u r o t o x i n st h a tb l o c k ss o d i u mc h a n n e l s a n dt h u si n h t h i t st h ep r o p a g a t i o no fa c t i o np o t e n t i a l s 砸w a sw i d e l yu s e da sa l l i m p o r t a n t p h a r m a c o l o g i c a lr e a g e n tf o rn e u r o b i o l o g i e a lr e s e a r c h ar e c 2 n ts t u d ys h o w e dt h a t 侬m a yb eo n eo f t h em o s tp r o m i s i n ga n a l g e s i c ，d e t o x i f i e a t i o na g e n ta n dl o c a la n e s t h e t i ci nt h ef u t u r ew h i c hi sc u r r e n t l y u n d e rp h u s ei ic l i n i ct r i a l s a l lt h e s ew i l li n c r e a s et h em a r k e tr e q u i r e m e n tf o rt i x c o n v e n t i o n a l l y , t t xi s p u r i f i e df r o mo v a r i e sa n dl i v e r so fp u f f e r f i s ha n dt h ey i e l di sl i m i t e d i s o l a t i o no f t i x - p r o d u c i n gb a c t e r i aw i l lm a k ei tp o s s i b l et op r o d u c el a r g eu m o u n to f 砸i nv r ow i t h o u t d e s t r o y i n gt h ep u f f e rf i s hr e s o u r c e t h eo r i g i no f 砸i so l l eo ft h em o s tc e n t r o v e r s i a lt o p i c s s i n c em w a so r i g i n a l l yd i s c o v e r e d a n di s o l a t e df r o mc e r t a i ns p e c i e so ff i s hb e l o n g i n gt ot h eo r d e ro ft e t r a o d o n t i f o r m s ，f o ral o n gt i m e ， p u f f e rf i s hw a st h o u g h t t op r o d u c ea n da c c u m u l a t e 嗽w i t h i nt h e i rb o d y l o to fr e s e r c hw a sc o n d u c t e d b u tn og i a n ds t r u c t u r ew a si d e n t i f i e d f u r i l l e m o m t i xa n di t sa n a l o g sw e r ed e t e c t e di ns e v e r a lp h y l a o fv e r t e b r a t e sa n di n v e r t e b r a t e s t h ew i d ed i s t r i b u t i o no ft 1 xa n l o n gg e n e t i c a l l yu n r e l a t e da n i t a a l s m a d et h et r u co n g mo ft r xo n eo ft h em o s ti n t e r e s t i n ga n dc o n t r o v e r s i a lt o p i c s t r x - p r o d u c i n g b a c t e r i ah a v eb e o nr e p o r t e dt ob ei s o l a t e df r o md i f f e r e n tt 1 l k - b e a r i n ga n i m a l sb u tn ob a c t e r i a l p r o d u c t i o no f 似w a sa c h i e v e d i th a sb e e nk n o w nf o rm a n yy e a r st h a tt h et o x i c i t yo ft h eo v a r i e sa n d l i v e r so fp u f f e rf i s hi sm o r ep o t e n tt h a nt h a to fo t h e ro r g a n s ，b u tw h e t h e rt h ea n a t o m i c a lv a r i a t i o no f t o x i c i t yi sd u e t ot h ed i f f e r e n td i s t r i b u t i o no f t t x - p r o d u c i n gb a c t e r i ai sn o tk n o w n i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h r e es p e c i e m e no ft h ef e m a l ep u f f e rf i s hf u g ur u b r i p e sw e r ec o l l e c t e df r o m t h eb o h a is e ao fc h i n af o rt h ei s o l a t i n ga n ds c r e e n i n go ft h et r x - p r o d u e i n gb a c t e r i a o u rr e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a t ( 1 ) t h ed i s t r i b u t i o no f i t x - p r o d u c i n gs t r a i n sa n dt h eb a c t e r i a lp r o d u c t i o no f xi s c l o s er e l a t e dw i t ht h et o x i c i t yo fe a c ht i s s u ei np u f f e rf i s h ；( 2 ) b a s e do nm o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n s ， p h y s i o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d1 6 sr d n aa l i g n m e n t ，t h et w ot r x - p r o d u c i n gs t r a i n s w e r ei d e n t i f i e da sn o c a r d i o p s i sd a s s o n v i l l ea n db a c i l l u sf u s i f o r m i i , i no u rk n o w l e d g en o c a r d i o p s i s d a s s o n v i l l ew a st b ef i r s tt i m ew h i c hw a sr e p o r t e dt op r o d u c er r ；( 3 ) b a c t e r i a lp r o d u c t i o no ft i xw a s a c h i e v e da n di d e n d i f i e db yt h ec h e m i c a la n db i o l o g i c a lm e t h o d s o u rr e s u l t ss u p p o r t e dt h ep o s t u l a t i o n o f b a c t e r i a lo r i g i no f t r x i ns u m m a r y , t h ed i s t r i b u t i o na n dt o x i c i t yo ft i x - p r o d u e i n gb a c t e r i ai np u f f e rf i s hf u g ur u p r i e s w a si n v e s r i g a t e d b a c t e r i a lp r o d u c t i o no f 砸w a s p u r i f i e da n di d e n t i f i e db yb i o l o g i c a la n di n s t r u m e n t a n a l y s i s o u rr e s u l tw i l lm a k ei tp o s s i b l et 0p r o d u c et r xv i af e r m e n t a t i o na n dg i v es o l i dg r o u n do nt h e p o s t u l a t i o no fb a c t e r i a lo r i g i no f 砸m o r er e s e a r c hi sn e e d e dt oe l u c i d a t et h em e c h a n i s mo fm s y n t h e s i sa n dt h er o l eo f t i xi nb a c t e r i a i i k e yw o r d s ：t e t r o d o t m a n ；t e t r o d o t o 】d n p r o d u c i n gb a c t e r i a ；f u g ur u b r i p e s ；n o c a r a o 邺i s d a s s o n v i l l e i ；b a c u l u s f u s i f o r m i s 英文缩写中文对照 堕堕塑菱塞全整 ! 兰全整一 a o a ca s s o d a 垃o no f o 伍d a l 柚a l y i c a lc h e 吐s t s 分析化学家协会 b s ab o v i s 唧ma l b u m i n 牛血清白蛋白 c fc d n v e 巧i n nf a v o r 转换园子 d a p d i a 而n o p i m e l i ca c i d 二氨基庚二酸 c t x c i g u a t o x i n 西加鱼毒素 e s l m s e l e c 廿0 r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y 电喷雾质谱 f a b s m触砒o mb o m b 盯d m c n tm a s ss p e c t r o m e t r y 快原子轰击质谱 f b s f e t a lc a l f s e m m 胎牛血清 g c - m sg a s c h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e , c t r o m e t r y 气谱质谱联用 g t x g o n y a u t o x i n 沟膝藻毒素 h p l c h i g hp c r f o r m a n c cl i q u i e dc h r o m a t o g r a p h y 高教液相色谱 h r ph o b e r a d i s hp e m x i d a s e 辣根过氧化物酶 i c rm s 曲l i eo fc c a rr e s c r c h 美肿瘤研究所 i r i n f r a e ds p c c t r o m c t r y 红外波谱 k l h k c y h o l e l l m p e t h e m o c y i | 1 匙孔虫戚血蓝蛋白 l c - f l dp 惦t 咖u 瑚h q u 蛳f f t a t o g r a p h y f l u o x c s e c n td 吐e c t l o n 柱后衍生荧光检测 l c - m s l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t l l a s ss p e c t r o m e t r y 液相质联用 m e s o d a p m e d i 枷i n o p i m e l i ca c i d 内消旋= 氨基庚二酸 m t t 3 - 1 4 ，5 一d i m e t h y t t h i a z o l - 2 - y t ) - 2 ，5 _ d i p h e n y t t e t r a z o t l u mb m m 试e 噻唑兰 m u m o 眦e u m t 小鼠单位 o d o p t i c = ld e n s i t y 光密度值 p c r l y m e e c h a i lr c a c t i o n 聚合酶链式反应 n m rd r o t o nn u c l e a rm a g n e t i cr c s o n a n c es p e c t r o m e t r y 核磁共振 s t xs a x i t o x 曲 石房蛤毒素 t c b at i s s u ec i 】l t i l r cb i o a 鹞a y 组织培养法 t d at 蛐o d 0 k 硎 河豚酸 t ic t h i n 1 a y e re h m m a t o g r a p h y 薄层色谱层析 t i xt e t r o d o l o 缸n 河豚毒素 u vu n r a v b l e t 紫外 w s t - i 2 - ( 4 一i o d o p h e n y l ) 一3 一“一n i t r o p h c n y l ) - 5 ( 2 , 4 - d i s u l f o p h c n y l ) 2 h - t c t r a z o l i n m 四噻唑钠 v i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 碱一：沁亿乏碱蜷轹扒彳阻犯 蝴：矽年其) | 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 和拐 时间：年月日 中国农业大学博士学位论文第一章河豚毒索的结构及生物学功能 第一篇文献综述 第一章河豚毒素的结构及生物学功能 占地球面积7 1 的海洋里生活着的海洋微生物高达1 0 0 万种以上，在海洋这一特殊生活环境 中( 高盐、高压、缺氧、缺少阳光等) 的海洋生物，在其生长和代谢过程中，产生并积累了大量 具有特殊化学结构并具有特殊生理活性和功能的代谢产物。河豚毒素( t e t r o d o t o x i n ，t i x ) 作为最 初从豚科鱼体内发现的一种天然非蛋白类神经毒素，除用作神经生理学、肌肉生理学等学科的工 具药外，还具有相当强的镇痛、局部麻醉、戒除药物依赖性等多种生物学功能。目前，开发利用 海洋生物资源、发现新的天然活性物质及天然药物开发已成为海洋生物研究的趋势与热点，也是 世界各国竞相研究的一个重要领域和发展方向。 1 河豚毒素( t t x ) 的发现 河豚的毒性，在我国两千多年前的古典医著中就已有记载。“神农本草”是我国虽早记录有关 河豚毒素的典籍。明朝李时珍著“本草纲目”中有“河豚江湖海河皆有之，海中者大毒江中者次之”， “肝及子有大毒”，“河豚有大毒，味虽珍美，食之杀人”的记载。其基本观点与现代科学关于河豚 鱼的毒性的说法是基本一致的。河豚鱼的研究在日本特别活跃，从明治初年即已开始，深根辅能 著的“本草和名”，源顺著的“倭名内聚钞”，寺岛良安著的“和汉三才图绘”，曲亭马琴著的“羁旅 漫录”，小野必大著的“本草食鉴”等著作中，都提到河豚毒素。这与河豚鱼在日本被奉为美食有 很人的关系。河豚毒素的研究最初主要集中于河豚毒素在河豚鱼体内的分布、对各种动物的毒性 及其在食品卫生学中的作用等方面。 2t t x 的化学结构 河豚毒素的化学研究始于近代。1 9 0 9 年，日本学者t a h a r a 从河豚鱼的卵中制备出了纯度为 0 2 的粗素，并命名为t e t r o d o t o x i n ，简写为1 t i x 。之后，t s u d a 与k a w a m u r a 从河豚的卵巢中分 离出t t x 结晶( t s u d aa n dk a w a m u r a ，1 9 5 0 ) ；m o s h e r 等从加州蝾螈的卵子中分离得到了一种称为 t a r i c h a t o x i n 的生物毒素，后来证实这种毒素与河豚鱼体内的t 1 x 属同类毒素( m o s h e re la 1 ，1 9 6 4 ) 。 1 9 6 4 年，在东京召开的第四届国际天然产物大会上，美国的w o o d w a r d 小组( w o o d w a r d ，1 9 6 4 ) 、 e t 本的t s u d a 小组( t s u d ae ta 1 ，1 9 6 4 ) 、g o t o 和h i r a t a 小组( g o t oe ta 1 ，1 9 6 5 ) 分别独立地测定了河豚 毒素结构，确定了其分子式为c 1 1 h 1 7 0 s n 3 。i t x 结构的发现引起了与会药物学家、化学家、毒理 学家的广泛关注。k i s h i 等首次通过化学方法合成了外消旋结构的t t x ( k i s h ie ta 1 ，1 9 7 2 ) 。 1 1 x 是一种剧毒的天然神经毒素( y a s u m o t oa n dm u r a t a ，1 9 9 3 ) 。为氨基全羟基喹唑啉化台物， 分子量3 1 9 1 7 。t r x 化学结构式见图1 1 ，结构式中含有一个碳环，一个胍基，六个羟基，在c - 5 和c 一1 0 位有一个半醛糖内酯连接着的环，其化学组成中氧原子含量高，所有碳原子均具有不对称 取代，这在已发现的天然产物中极为少见。正是由于1 1 x 独特的化学结构，t 1 x 从被发现之初就 引起人们的关注。 a 图卜1t t x 化学结构式( 图b 中蓝色代表n 3t t x 的理化- 陛质 b 红色代表氧：白色代表氢；灰色代表碳) t 理化性质比较稳定，为无色、无臭、无味、针状或菱形结晶，不溶或微溶于水，不溶于 无水乙醇、乙醚、苯等有机溶剂，在含有稀酸的水溶液中极易溶解，t 1 x 在溶液中存在如下三种 结构即t t x 、半缩醛型t t x 、内酯型x 的动态平衡，见图1 - 2 ( y a s u m o t oe ta 1 ，1 9 8 8 ) 。t t x 呈 弱碱性，p k a 8 7 ，在中性及酸性条件下相对稳定，在碱性条件下不稳定易被还原，例如在k o h 溶液中，在1 0 0 下加热1 0 m i n 后，被分解为荧光物质2 氨基一6 羟甲基8 羟基喹唑啉，这也是 1 t i x 化学检测法的理论基础。t 1 x 结晶无明确的融点，2 4 0 开始碳化，但在3 0 0 以上也不分 解。其胍基及附近的c 4 、c 一9 、c 一1 0 碳原子上的羟基为邢( 毒性的活性基团。 h 。敏。公。趣。 图卜2t t x ( 上) 、半缩缩醛型t t x ( 左) 、内酯型t t x ( 右) 的动态平衡 1 1 x 具有多种衍生物，不同的衍生物其毒性亦不相同，已经从动物组织中分离到的t t x 衍 生物及其毒性详见表1 - 1 。 2 矽巍 蝌 中国农业大学博士学位论文第一章河豚毒素的结构及生物学功能 表1 - 1 动物组织中分离得到的t t x 及其衍生物( h w a n g , 2 0 0 3 ) 1 铀l e1 1t a n di t sd e r i v a t i v e si s o l a t e df i r 0 1 3 1 1a l l i l n a l s 4t t x 的作用机理及生物学功能 4 1t t x 中毒 t t x 中毒多是由于误食有毒河豚鱼或含有t t x 的海产品引起，有的则是因喜食河豚鱼，但未将 其毒素去除干净而引起中毒( f i e l d ，1 9 9 8 ；l a ue ta 1 ，1 9 9 5 ；l i ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。河豚鱼肉味鲜美，蛋白含 量很高，营养丰富，在日本，河豚鱼被奉为美食，而且以肝脏为佳品，素有“拼命吃河豚”的说 法，但其卵巢、肝脏等内脏器官却富含t t x ，由于t t x 化学性质稳定，一般的烹饪手段难以破坏， 因而日本也成为t t x 中毒多发的国家，可以说人们对t t x 的最初认识就是从食用河豚鱼中毒开始 的。1 9 6 0 年以前，日本每年因食用河豚鱼而中毒者达1 0 0 多人，死亡率6 0 ( k a o ，1 9 6 6 ) 。近年来， 日本卫生署对河豚鱼的加工、烹饪、可食用的河豚鱼的种类等均作了严格的规定。t t x 中毒的发 生大大下降( m a h m u de ta 1 ，2 0 0 0 ) ( 详见表l2 ) 。同时，日本也是t t x 相关研究最多的国家，这与 日本人爱吃河豚鱼有一定的关系。t t x 中毒在日本之外的其它国家和地区，如新加坡( c h e we t a 1 ，1 9 8 3 ) 、泰国( k a n c h a n a p o n g k u l ，2 0 0 1 ) 、马来西亚( k a ne ta 1 ，1 9 8 7 ；l y n ，1 9 8 5 ) 、香港( s u ne t a 1 1 9 9 4 ) 、台湾、朝鲜、孟加拉国( a h a s a ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 、美国( l a n g e ，1 9 9 0 ) 、澳大利亚( s o r o k i n ，1 9 7 3 ) 、 中国内地某些地区( c h e l ac ta 1 ，1 9 9 9 ；h o we ta 1 ，2 0 0 3 ；s u ie ta 1 ，2 0 0 2 ) 也有发生，但相对较少 ( n o g u c h ia n de b e s u ，2 0 0 1 ) 。 除由细菌产生的蛋白质毒素外，t t x 为毒性极强生物毒素之一，其毒性比氰化钾强1 2 5 0 倍。 r d ( 对小鼠的l d 。为8 7 m k g ( 腹腔注射) ，成人( 5 0 k g ) 最小致死剂量( m l d * ) 为1 0 ，o o o m u ，相 当于2 m g ( n o g u c h ia n d e b e s u ，2 0 0 1 ) 。河豚鱼中毒多在食后1 0 4 5 m i n ( 也有报道在3 6 h ) 感觉不适， 出现中毒的症状决定于人的体质和吃下去的毒素量的多少。f u k u d a 等将t r x 中毒的临床症状划分 为四个阶段( f u k u d aa n d t a n i ，1 9 4 1 ) 。第一阶段，为中毒初期，患者感觉发热、嘴唇、舌尖及肢端 感觉麻木，头部出现不适，有的出现头痛、腹痛。第二阶段，出现不完全麻痹，呕吐，不能运动， 知觉及语言出现障碍，呼吸困难、血压开始下降。第三阶段，运动中枢完全麻痹，身体松弛，出 现血绀，意识开始丧失，呼吸更加困难。第四阶段，意识完全丧失，呼吸停止以至死亡。从整个 3 中国农业大学博士学位论文第一章河豚毒素的结构及生物学功能 中毒症状来看，运动麻痹与死亡之前意识仍然清楚是t t x 中毒的重要特征。死亡通常发生在发病 后4 8 小时，严重者在食用后1 5 小时死亡。8 小时未死亡者一般可恢复，但常会留下关节痛等后 后遗症。 通常根据河豚鱼组织中t t x 的含量将其毒性分为四级，1 0 9 以下致死，p t t x 含量在1 0 0 0 m u g 以上者为剧毒；1 0 9 以下不致死，i i p t t x 含量( 1 0 - 1 0 0 0 ) 删g 为强毒；1 0 0 9 以下不致死，r p t t x 含 量为( 1 0 1 0 0 ) 删g 为弱毒；1 0 0 9 以下不致死，u p t t x 含量小于1 0 m u g 可视为无毒。 表1 - 2 日本近年发生的河豚毒素中毒事件( n o g u c h ia n de b e a n , 2 0 0 1 ) t a b l e1 - 2p u f f e rp o i s o n i n gi n c i d e n t si nj a p a nf r o m1 9 8 7 - 9 6 4 2t t x 中毒的防治措施 m a t s u m u r a 等用1 1 x 单克隆抗体对小鼠t 1 x 中毒的保护作用进行了研究，结果表明，6 2 # g 单 克隆抗体对小鼠 i t x 中毒的保护率达6 0 ，1 2 5 a g 时的保护率为1 0 0 ( m a t s u m u r a ，1 9 9 5 a ) 。值得注 意的是，该作者是将t 1 x 与单抗在体外等体积混合后并宝温孵育3 0 m i n 后再给小鼠腹腔注射得到 的结果，这种保护作用在1 1 x 与抗体分别注射的情况下是否存在，还不得而知，而只有在这种与 t 1 x 中毒相似条件下得到的研究结果才能更好的体现其治疗与应用前景。r i v e r a 等人的实验结果 则对此疑虑提供了确切的证据，充分说明了1 1 x 单克隆抗体对小鼠t r x 中毒有很好的保护作用 ( r i v e r a e ta i ，1 9 9 5 ) 。实验中，小鼠尾静脉注入单克隆抗体( t 2 0 g 1 0 ) 5 0 z g ，3 0 r a i n 后每只小鼠腹 腔注射1 1 x1 印g k g ，有半数的小鼠( 3 6 ) 存活，如增加单抗用量至1 0 毗g 瓜g ，则全部攻毒小鼠 得以存活；未注射抗体组则全部死亡；如每只小鼠先经尾静脉注射5 0 0 z g 单抗，3 0 m i n 后每只小鼠 灌服1 1 x 3 5 p g ，则处理组小鼠全部存活，而对照组在3 0 - 7 5 r a i n 内全部死亡；若给小鼠灌服致死剂 量的t 1 x 后1 0 1 5 m n ，尾静脉注射1 1 x 单克隆抗体发现，低剂量t 1 x 单抗( 3 0 、6 0 、1 2 靴只) 能明显延长小鼠存活时间，高剂量组( 5 0 0 , u g ) 小鼠全部存活。该研究结果提示1 1 x 单克隆抗体 有望成为t t x 中毒的解救剂。由于t r x 是小分子物质，其抗体制备相对困难，临床应用也受到了 限制。尽管现在已有商品化的单克隆抗体出售，但价格十分昂贵。 最近有多个研究表明，4 氨基吡啶对n x 中毒有拮抗作用。4 氨基吡啶是钾离子通道的阻滞 4 中国农业大学博士学位论文第一章河豚毒素的结构及生物学功能 剂，能延缓钾离子内流，延长动作电位。使突触前末梢钙离子内流增多，从而增加突触前乙酰胆 碱的释放，增强肌肉的收缩作用，同时4 氨基吡啶还具有一定的刺激呼吸及兴奋中枢的作用。研 究报道，豚鼠给予致死剂量的t r x 或s t x ，在膈肌收缩出现部分抑制后开始使用呼吸机，于腻肌 自主收缩消失后立即注射4 氨基吡啶，可迅速逆转动物的膈肌收缩抑制，抑制低血压及心率过缓， 各生理指标迅速恢复到正常水平甚至更高( c h a n ge ta 1 ，1 9 9 7 ；c h e ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。但4 一氨基吡啶毒副 作用大安全剂量范围小，能否用于t 1 x 中毒的临床救治还需要进一步研究( b e n t o n ，1 9 9 8 ) 。 总之，t r x 中毒发病时间快，死亡率高，目前为止还未能找到特异性的解救药物。主要采取 对症治疗措施。早期可催吐，洗胃，用2 的碳酸氢纳中和胃内毒素，活性碳能有效地与1 t i x 结合， 抑蒂4 毒素的吸收；呼吸困难者可注射可拉明等，必要时可切开气管。因1 1 x 在碱性条件下不稳定， 也可静脉注射碳酸氢纳降低血中t 1 x 含量，我国一些学者认为在其它支持疗法的配合下，早期大 剂量应用莨菪碱类药物有较好的疗效。国外报道，可逆性胆碱脂酶抑制剂如新斯的明，藤喜龙等 在t 中毒后能增强肌肉的收缩能力，可早期使用。但这些药物均无严格的临床对照，目前还没 有一种药物被公认为是有效的。因此食用河豚鱼必须掌握科学的烹饪加工方法，同时应加强宣传， 使人们充分认识到其毒性及危害，执行严格的检疫是十分必要的。对于进行河豚鱼加t 的企业， 应加强卫生防疫监督，并对加工过程中的去毒方法进行培训，有条件的，应对加工过程中的河豚 鱼毒性进行监测，防止中毒的发生。 4 3t t x 作用机理 t r x 是一种剧毒性的胍胺类海洋生物毒素，为典型的n a + 通道阻断剂，它能选择l 生与肌肉、 神经细胞的细胞膜表面的钠离子通道受体阻断电压依赖性钠通道，从而阻滞动物电位，抑制神 经肌肉间兴奋的传导( k a o ，1 9 6 6 ；n a r a h a s h i ，1 9 7 4 ) ，导致与之相关的生理机能的障碍，主要是肌肉 和神经的麻痹。构效关系表明，t 的活性基团是1 ，2 ，3 位的胍胺基和附近的c 4 ，c 一9 ，c 1 0 位的羟基，胍基在生理p h 值下发生质子化，形成正电活性区域与钠通道受体蛋白的负电性羰基 相互作用，阻碍离子进入通道( a n d r e a sa n dw e r n e r , 2 0 0 0 ；k a o ，1 9 8 们。 粤骂一_ 媲曼，净熊罨 图卜3 钠通道受体结构示意图 5 ，丁，l|孙f一 煎芦；匡 0舒l；jj；f，i；t 膨一 ，则姆，一 难戆， 。幽弘。，瀣谭。只现。 弩、 中国农业大学博士学位论文第一章河豚毒素的结构及生物学功能 钠通道为存在于大多数可兴奋性细胞膜表面上的孔状跨膜蛋白( 图i - 3 、1 4 ) ，是一种由a 、 b 1 、b 2 三个亚基组成的复合体，其中a 亚基2 6 0 k d a , 对维持钠离子通道功能具有重要意义，为通 道的功能单位( c a t t e r a u ，1 9 9 2 ；r a b e ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。a 亚基由四个同源区组成( i 、i v ) ，每 一同源区包括6 个a 螺旋的跨膜片段( s 1 8 6 ) ，钠通道受体至少有六个特异性靶分子结合位点， 图卜4 钠通道受体空间结构 包括位于膜外侧的t t x 接合位点；胞内侧的两个磷酸化结台位点( p k a 、p k c ) 、一个电压感受 位点( v o l t a g es e n s o r s ) 、一个门控通道失活位点( i n a c t i v a t i o ng a t e ) 。邢【是与钠通道a 亚基跨膜片 段s 5 与s 6 之问的受体部位结合发挥其生物学作用的。由于钠通道受体位于可兴奋细胞膜外侧， 钠通道外口附近，所以只有当毒素应用于膜外侧时才能阻止钠离子进入细胞内，毒素与受体结合 后，阻止钠离子接近通道外口，使其不能通过通道进入细胞，从而不能发生去极化。有趣的是 1 1 x 特异性地作用于钠通道，而对钙钾通道无直接影响，对神经肌肉接头的突触及胆碱酯酶的释 放也无直接作用，因此被确定为钠通道研究的首选的化学标记物。单通道记录结果显示，1 1 x 阻 断钠离子通过是一种全或无的方式，毒素和通道是一种1 ：1 的关系，即一个t 1 x 分子堵塞一个钠 通道，毒素与钠通道的结合是可逆的，并受各种阴阳离子的影响，如n a + 、i 【+ 、m 9 2 + 、c a “等带 正电荷的阳离子可与t 1 x 竞争钠通道受体( h m ，1 9 7 5 ) 。 钠通道是电压门控性通道( v o l t a g e g a t e ds o d i u mc h a n n e l ，v g s c ) ，根据其对1 1 x 的敏感性可 分为t 敏感型( 1 s ) 和i t x 耐受型( t 1 x - r ) 两种类型，分别介导着激活阈较低失活较 快的快钠电流和激活电压高失活较慢的慢钠电流。越来越多的研究表明，1 1 x r 钠通道在疼痛发 生机制中发挥着重要的作用。t y x - r 通道主要有n a v l 5 、n a 。1 8 和n a 。1 9 三个类型。n a 。1 5 主 要分布于心肌组织，n a i l 8 和n a 。1 9 在正常情况下分布于背根神经节和三叉神经中。最近的研究 表明，1 1 x n a 。1 8 对神经损伤及炎症相关的慢性疼痛有特殊作用，在炎症部位及神经损伤部位出 现t t x - r 钠通道n a 。1 8 的累积，可能成为慢性疼痛的原因( l y ue ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 t i x 对钠通道的阻滞具有选择性，神经细胞上的钠通道对1 1 x 的敏感性比心肌、骨骼肌上 的钠通道要高得多，这种差异与两种类型的钠通道在不同组织的分布有关。t t x 只阻滞动作电位 6 中国农业大学博士学位论文 第一章河胨毒素的结构及生物学功能 的传导，而对静息电位、静息膜电位的延迟恢复作用不明显( u b r i c h t e ta 1 ，1 9 8 0 。 4 4t t x 在生物医学上的应用 1 1 x 的药理学研究，从日本学者田原良纯提纯得到纯度为0 2 河豚毒素就已开始，但直到 二十世纪六十年代，1 1 x 的化学结构阐明之后，有关其药理作用的报道才逐渐增多。t 1 x 的药 理作用有以下几个方面( 王艳等，2 0 0 2 ；陈素青等2 0 0 1 ) ： 镇痛作用：s c h w a r t z 等对x 的局部镇痛作用进行了研究( s c h w a r t ze ta 1 ，1 9 9 8 b ) 。t 1 x 的镇 痛作用比普鲁卡因和可 因强l o 万倍，而且持续时间长，临床上1 1 x 的针剂可以代替吗啡、杜 冷丁、阿片类药物和南美箭毒等，用_ 丁二治疗神经痛、关节痛、肌肉痛、麻风痛以及创伤、烧伤引 起的疼痛，一般生效较吗啡、杜冷丁迟，镇痛时问长达1 2 2 0 h ( l pe ta 1 ，2 0 0 0 ) 。此外1 1 x 还可 用于癌症晚期镇痛( i n t e r n a t i o n a l w e x t e c h n o l o g i e s ，i n c ) 。 医学工具药：n x 在很低的浓度下能选择性的抑制细胞膜表面的钠离子通道，而对钾离子、 钙离子无影响，这种专一性使其成为神经生理学、肌肉生理学研究领域中很有用的药理学工具药 ( l i ue ta 1 ，2 0 0 3 ；x i a oa n dh a n g ，2 0 0 3 ) 。 局部麻醉药：河豚毒素局部麻醉作用比一般的局麻药强。在豚鼠皮内注射 i t x 时的局麻作 用比普鲁卡冈强1 6 万倍。国外已有将河豚毒素与普通局麻药配伍而作为局麻药的专利出售。值 得注意的是1 1 x 的麻醉作用是通过作用于细胞膜表面的钠离子通道引起的，1 1 x 本身没有粘膜 穿透力，冈此并没有表面麻醉作用( s c h w a r t ze ta 1 ，1 9 9 8 b ；s c h w a r t ze ta 1 ，1 9 9 8 c ) 。 戒除药物依赖性：据说以河豚毒素为主要有效成分的戒毒药高效、安全、无毒副作用，戒毒 有效率平均达9 8 ，而且未见成瘾报道( i n t e r n a t i o n a lw e xt e c h n o l o g i e sl n c ) 。 其它作片 ：用作止瘁剂对于皮肤瘁症、痒疹、疥癣、皮炎等止痒而促进其痊愈。也可作为 呼吸镇静剂，治疗气喘和百日咳等症；用作解痉剂，可用于松弛肌肉痉挛、胃痉挛和其它痉挛， 特别对于破伤风痉挛有特效；用作尿意镇静剂，对遗尿症有良效；由于河豚毒素具有充血作用， 对阳痿和妇女性欲缺乏等亦有效，但有膀胱及尿路疾病者应忌用，因为毒素能使其膜充血或强度 淤血；河豚毒素有独特的降压作用，可考虑在临床上用于抢救高血压病人；x 有明显的抗心率 失常活性，与其它抗心率失常药配合使用时，可提高心率失常的治疗效果( 陈宁庆，2 0 0 1 ) 。 尽管t r x 具有多种生物学功能，其剧毒性限制了它在临床上的应用，相信随着科学技术的 发展，对t 1 x 的研究会更加深入，只要确定适当的剂量、给药途径、适应症及药物的配伍禁忌， t 1 x 的临床应用还是可彳亍的。 5 河豚鱼的t t x 耐受与t t x 结合蛋白 众所周知，t 1 x 是剧毒的非蛋白质类的神经毒素，小鼠l d 5 0 为8 硒啦g ，人的致死剂量为 2 m g 5 0 k g ，t t x 在河豚鱼或其它含n x 的动物体内的含量远高于按其体重推算的致死剂量，然 而如此高的1 对河豚鱼本身为什么没有危害，河豚鱼是如何耐受这种剧毒的化学物质的呢? 这是令许多科学家感兴趣的话题。河豚毒素对1 1 x 的耐受性的研究始于二十世纪