流式细胞仪分析技术应用ppt课件

实验室流式细胞仪单细胞分选技术,1,流式细胞术(flowcytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。,2,流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。,细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量,流式细胞术的特点,3,（1）液流系统（2）光学系统（3）数据处理系统,1.流式细胞仪的基本结构：,4,通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。,细胞分选原理,5,压电晶体,产生机械振动,不充电,充电,（一）分选基本原理,6,分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。,（二）分选的技术要求,7,参数：FS,SS,FL数据显示方式（单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图）设门分析技术,第二节数据的显示与分析,8,FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少,一、参数,9,单参数直方图双参数直方图:点图二维等高图假三维等高图三参数直方图多参数分析,直分析方图,设门分析:REGION和GATE设置,二、数据显示方式,10,由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（一）单参数直方图,11,单参数直方图,细胞相对数量,12,双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（二）双参数直方图,13,1.双参数直方图点图,14,2.二维等高图,由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。,15,二维等高图,16,3.假三维等高图,17,（三）三参数直方图,18,多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。,（四）流式细胞仪的多参数分析,19,Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。,根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。,三、设门分析技术,20,A淋巴细胞B单核细胞C中性粒细胞,A、B、C均为任意门,21,线性门,22,样本制备标记染色液相芯片技术质量控制,第四节流式细胞仪免疫分析的技术要求,23,外周血淋巴细胞样品的制备分离单个核细胞培养细胞的样品制备蛋白酶消化机械吹打使贴壁细胞脱落洗涤尼龙网过滤,一、免疫检测样品制备,24,新鲜实体组织单细胞悬液的制备机械法酶处理法化学试剂处理法表面活性剂处理法单细胞悬液的保存深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）,25,1PhosphateBufferSalineorHBSS(Ca/Mg+free)1mMEDTA25mMHEPESpH7.01%FetalBovineSerum(Heat-inactivated),SortingBuffer,26,淋巴细胞：1xHBSS(withCa+/Mg+)含1%FBSHBSS配方中的阳离子可增加细胞的生存力。由于这些细胞并非易于聚集，即便配方中沒有EDTA也不会造成问题。,较黏着的细胞(stickycells)：提高EDTA到5mM并使用透析过的FBS(againstCa+/Mg+freePBS)。某些细胞在活化会比较黏著而EDTA可抑制此作用,27,贴壁型细胞株(Adherentcells)：以Trypsin处理后去准备单细胞悬液时，待细胞变圆(切记不可过度作用)，便以5ml含5%血清培养液收取细胞，并均匀地打散细胞悬液。离心后，用sortingbuffer调整细胞浓度。如果需要的话，可以提高EDTA的浓度(至5mM)以避免細胞重新黏聚。,含有高比例死細胞的样本：Sortingbuffer加5mMMgCl2以及2550g/mLDNAaseI(SigmaD-4513)或是Sortingbuffer加0.83mMMgCl2以及20UDNAaseII(SigmaD-4138)。这些配方可減少因死细胞释放出來的DNA所造成的细胞黏聚现象。,28,尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素PE-Cy5/APCFITC-Isotype:设置阴性对照门,去除抗体非特异性吸附的影响2/CD34-PE;FITC-Isotype:单阳管对照,设置补偿3/CD38-FITC;PE-Isotype:单阳管对照,设置补偿4/CD34-PE;CD38-FITC:检测分选管,48,适当的制备方式处理红细胞实体组织来源标