（发育生物学专业论文）拟南芥功能未知基因at4g32960的定位及抗逆性的初步研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 拟南芥功能未知基因彳f 够2 9 6 口的定位及抗逆性的初步研究 ( 山东师范大学生命科学学院，济南，2 5 0 0 1 4 ) 中文摘要 拟南芥，作为第一个完成全基因组测序的高等植物，到目前为止，仍有大量 功能未知的基因有待我们去探索。随着反向遗传学的发展和现代分子生物学技术 的改进，这些功能未知基因的定位、基因功能的分析，基因的表达与调控的研究 正越来越得到人们的重视。 本文旨在研究拟南芥基因组中的功能未知基因彳确筘2 9 卯的定位及其与抗逆 性有关的功能。彳确筘2 9 卯位于拟南芥第四条染色体上，基因全长1 5 6 3 b p ，该基因 所编码的蛋白序列有2 6 4 个氨基酸( 约2 9k d ) 。软件预测显示该蛋白既非信号肽， 也不是线粒体或叶绿体蛋白。通过与动物基因的比对，推测该基因可能作为一种 转录因子在植物的休眠过程起作用。 本实验室首先从1 栅网站中获得该基因全序列，通过p r 0 i n o t e r 2 o 软件分析推 测其启动子可能存在的区域，设计引物，将该启动子全序列克隆出来并连入适当 的载体p c 舳m 3 0 1 ，经过花浸染法转化进入拟南芥使其在拟南芥体内表达，由 于载体本身所带有的鼢r 基因，用除草剂筛选抗性苗，通过对报告基因的检测确 定目的基因的组织化学定位。 实验中发现该基因的组织化学定位随生长时期的不同而不同：幼苗时期，表达 部位在根部；营养生长期在根的疏导组织、叶脉、表皮毛中有表达；生殖生长期， 基因的表达转移到根的成熟区和花药中。 。 构建4 f 彳酣2 9 6 d 坷g f p 融合基因植物表达载体，并用花浸染法转化拟南芥，同 样用除草剂筛选抗性苗，通过激光共聚焦显微镜检测对彳f 邻2 9 卯进行了初步的亚 细胞定位。之后，将该融合基因连入酵母表达载体y e p l a c l 9 5 并转化酵母细胞， 同样用激光共聚焦显微镜检测带有目的基因的酵母和野生型酵母从而达到对 彳f 邻2 9 卯的亚细胞定位。实验结果显示，该基因定位在细胞质中。 将克隆得到的彳f 秽2 9 卯连入p c a m b i a 3 3 0 1 载体，构建植物过量表达载体， 转化拟南芥，除草剂筛选以获得纯合子用于下一步对基因功能的研究，并进一步 将该基因与胁魄基因的融合基因一起连入酵母表达载体y e p l a c l 9 5 ，构建酵母过 量表达载体，转化野生型酵母细胞k 6 0 1 。p c r 筛选阳性克隆，并进一步通过w e s t 锄 山东师范大学硕士学位论文 验证该基因确实在酵母体内得到表达。通过转基因酵母和野生型酵母在各种胁迫 条件下的生长情况的比较推测该基因的功能。通过比较我们发现，在高盐、高温 和低温胁迫条件下，转基因酵母的生长状况明显好于野生型酵母，而在氧化胁迫 和低盐条件下，两种酵母的生长状况没有太大差别，这说明，该基因可能参与植 物高盐和温度胁迫的调节。 同时，我们订购了彳m 筘2 9 6 d 基因的t - d n a 插入突变体阳缘d 酊j 9 ，并通过 p c r 检测获得突变体纯合子，将其与野生型拟南芥同时放在不同浓度的n a c l 、 h 2 0 2 、a b a 、高温、低温等胁迫条件下培养，我们发现高温下野生型的生长情况 要好于突变体纯合子，其他条件下突变体与野生型植株的生长情况相差不大，由 此推测该基因可能参与拟南芥高温胁迫下的生长调节，这一结果进一步验证了上 述酵母实验。 关键词：功能未知基因，组织化学定位，亚细胞定位，过量表达，突变体 分类号：q 7 8 h 山东师范大学硕士学位论文 t h el o c a t i o na n dt h ef u n c t i o n7 sp r e l i m i n a r ys t u d yo nr e s i s t a n c eo f a r a b i d o p s i s sf u n c t i o nu n k n o wg e n e 彳垂妒2 9 6 口 ( c o l l e g eo f l i f es c i e n c e ，s h 锄d o n g n o 肌a lu i l i v e r s i 坝j i n a 玛2 5 0 0 1 4 ) a b s t r a c t a r a b i d o p s i s 也a l i a n 鸟弱af i r s tc o m p l e t e d 舀m o m es e q u e n c i n go f l ep l a n t ，s of 弛 m e 他a r es t i l lal o to fu i l l w nf i l m t i o i 塔t 0u st 0e x p l o r c w i t l lr e v e r s eg e n e t i c s 锄dt l l e d c v e l o p m 锄t0 fm o d e n lm o l e c u l 缸b i o l o g yt e c l l i l i q u e si i i l p r 0 v e d ， t l l e s ef e a n l r e s 凼w l lg e n e s l o c a t i o i l i n g ，t t 坨a i l a l y s i so fg e i l e劬c t i o 玛g ee x p r e s s i o n锄d r e g u l a t i o no f r e s e a r c hi si l l c r e 勰i n g l yg a i l 1 i n gi m p o r t a n c e t h i sp a p e r 抽st 0s t u d yt l l e 1 l 【n i m 血n c t i o no nr e s i s t 甜l c e 锄dt h el o c a t i o no f 舡a b i d o p s i sg e n o m eg e l l e 彳f 锣2 9 6 晓彳形秽羽卯i si i l 加a b i d o p s i sc h r o m o s o m e4 ，i t ，s m l l l e l 咖i s15 6 3b p ，t l l eg e i l ee 1 1 c o d i n g t l l ep r o t e i ns e q u 锄c eo fa b o u t2 6 4a 珊h m i d s ( a b o u t2 9k d ) s o 胁a r ef o r e c a s t si n d i c a t et h a ti ti s tc o d i i l g 氨盯l es i 印a lp 印t i d e ， n o ri si ti i l i t o c h o n “ao rc h l o r o p l 嬲tp r o t e i n w i n lm ea i l i m a lg e i l ec o m p a r i 呜t l l eg 钮圮 m a ys p e c u l a t ea sa 屯r a n s c 邱t i o nf - a c t o ri i lp l a n td o r n l a i l c yp r o c e s s f i r s t ，w ef i n dm eg e n o m es c q u e n c e 缸吼t l l ew e bs i t ec a l l e dt a 也s p e c u l a t et h e r e m a yb ei t sp r o m o t e rr e g i o nb ym e 锄a l y s i ss o 胁a 豫p r o m o t e 坨0 ，t h e np 咖e 璐w e r e d 豁i g n e 也n l ep i 0 m o t e rs e q u e n c ew 弱c l o n e d 强de 蹦ll i l l k e dt 0t h ea p p r o p d a t ev e c t o r p c 舳i a 3 3 0 1 ，m e rs p e n d i n gd i s s e i i l i i l a t c d tt r a n s f 0 册e di i l t 0 加曲i d o p s i sw h 饥i t e x p r e s s e si i l 、，i v o ，w e h a v es e l e c t e dh e r b i c i d er e s i s 觚s e e d l i n 笋b e c a 晒eo fm e s u p e r i o r i t yo fb 盯g e n eo fv e c t o ri t s e l t t l l r o u g hg e t i ct e s t i n go nt 1 1 er 印o r tw ec a n i d e n t i 匆m el l i s t o c h 锄i s 仃yl o c a l i z a t i o no fm eg e m w ef o u n dt l l a t 也eg 吼e1 0 c a t i o no f n l eg r o w c l lp e r i o d sv a d ，：“n gs e e d l i n gp 嘶o d ，e x p r e s s e di i lm er 0 0 tp o s i t i o n ；d u r i n g v e g e t a t i v es t a g e ，i i lt h er 0 0 tg u i d a n c e ，v e i n y t r i c h o m e a n dd l l r i i l gr e p r o d u c t i v e 孕0 w t h ，g e 仃黜觚t o t h e r 0 0 t o f m e m 船a r e 舔越1 d 锄t l l e f s 础s 0 ，w ec o n s n l l c t e d 彳f 伊2 9 6 纰 p 血s i o ng 饥ee x p r e s s i o nv e c t o r a n d d i s s 训n a t e db yl a wi n t 0a r a ：b i d o p s i sn o w e r s ，w ea l s oh a v es e l e c t e dh e r b i c i d er e s i s t a n t s e e d l i n g sa n dt h e nt h r o u g l lc 0 n f o c a ll i l i c r o s c o p yd e t e c t i o no f 彳f 锣2 9 6 dc o i l d u c t e d 肌 诚t i a ls u b c e l l u l 盯1 0 c a l i z a t i o n a r e rt l i em s i o ng e l l ei n t oy e a s te x p r c s s i o nv e c t 0 i y e p l a c 19 5i t 即t e r e di n t 0y e 弱tc e l l sa 1 1 dw eu s e dc o n f o c a lm i c r 0 s c o p yf o rd e t e c t i o no f 彳f 钮寥2 9 6 ds u b c e l l u l a r1 0 c a l i z a t i o n ，t o o t w oe x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tn l eg e n e e x p r e s s e si 1 1m ec y t o p l 弱m i l i 山东师范大学硕士学位论文 c l o n e d 彳f 彳驴2 9 6 d 狮d1 珧e dt 0p c a m b 队3 3 0 lt 0 c o n s t m c tp l 趾te x c e s s i v e e x p r e s s i o nv e c t o r ，m c i l 仃觚s f b 皿i t 试t 0 心a b i d o p s i st 0o b t a i nh o m o z y 9 0 u sf o rm e f u n c t i o ns t u d y a n dm n h e rt h eg e n et o g e m e rw i t l l 日b 昭w 鹅咖s f o m e d 缸oy e a s t e x p r e s s i o nv e c t o ry e p l a c l 9 5 ，e x c e s s i v ec o n s t m c t i o no f y e 勰te x p r e s s i o nv e c t o ri n t o l e w i l d t y p ey e a s tc e l l sk 6 0 1 s c r c c i l i n gp o s i t i v ec l o n e sb yp c r ，a n dw ee v e i lc a r r i e do u t w e s t e mb l o tt 0f i 】r t h e rv e r i f i e dt h a tt t 屺蓼卿eh 弱e x p r c s s e di nv i v oi ny e 弱t t h r o u g l l m ec 伽p a r i s o no fm e 伊o w mo f 仃锄s g e l l i cy e a s t sa n dy e a s t so fm ew i l d - t y p eu n d e r v a r i o 璐s 仃e s sc o n d i t i o n sw es p e “a t et h eg e i l e s 缸1 c t i o n b yc o m p a r i t i o nw ef 0 u n d t h a tt l l eg r o w t hi l ll l i g l l - s a l t ，h i g l lt e m p e r a t u r e ，l o wt 锄p e r a t u r es t i e s sc o n d i t i o n s ，n l e g r o w mo f 仃a n s g e i l i cy e 船t ss i t u a t i o ni so b v i o u s l yb e t t e rt h a l lm ew i l d t y p ey e 弱t s ，锄d i 1 1o x i d a t i v es t r e s sa n dl o w - s a hc o n d i t i o n s ，t l l e 哥。o w 吐lo fm et w ok i n dy e 硒t sd 0n o t l l a v em u c hd i f f e r e n c e ，w h i c hi n d i c a t e st h a tt l l eg e n em a yb ei n v o l v e di i ln l ep l 枷s a 由u s t m e mo fl l i g l l - s a n ，t e m p e r a t u r es 臼e s s a tt l l es 锄et i i i l ew eo r d e r e d 彳巧驴2 9 卯g em u t a n to f a b i d o p s i st i l a l i 锄a - s 口腮j ，d 酊j 9 ，觚d 吐u - o u g t ld e t e c 血gt l l ee x p r e s s t i o n o fm eg e i l ew eh a v e 9 0 t h o m o z y 9 0 u s ，m e i lw ep l a n th o m o z y g o u si n u t a n ta n dw i l d - t ) ，p e 心a b i d o p s i st i l a l i 锄aa t t l l es a m et i m eu n d e rm e 鼢l t ，h 2 0 2 ，a b a ，1 l i 曲t 锄p e r a t u r 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学位论文版权使用授权书 ll 冬哩 _ ， 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本 人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密 后适用本授权书) 学位论文作者签名： 碎王均 导师签字： 、冬各 签字日期：2 0 0 矽年6 月 日签字日期：2 0 0g 年多月 山东师范大学硕上学位论文 一、文献综述 植物的主要代谢过程是在不稳定的环境条件下发生的，然而，植物不能运动以 躲避胁迫，也不能调节体温以抵抗冷、热胁迫，而是在自然选择中进化出一套不 同于动物的胁迫反应网。因此，植物的生长发育与环境关系更为密切，它既需要 不断的感受并适应外界变化，同时又必须保持自身内部代谢的平衡和稳定。在某 种程度上，植物具有更为复杂的信号整合网络。 土壤盐渍化在人类开始耕种之前即已存在并随着农业灌溉等人类活动逐渐加 剧。今天，大约2 0 的耕地和大约一半的灌溉田被盐渍化所影响。盐渍化成为最重 要的严重影响到社会经济发展的环境因素之一【l 】。随着我国现代化建设的进行，耕 地面积将被挤占，开发后备国土资源，特别是开发现有盐荒地将势在必行。依赖于 工程措施进行盐地改良以种植农作物，成本太高；由于淡水资源的缺乏，依赖大量 淡水的规模化盐地工程改良的可行性已经大打折扣，进行盐荒地开发的有效途径是 培育耐盐作物品系。 由于盐生植物可能具有进化上与非盐生植物截然不同的信号传导途径和调节控 制机制，因此，分离识别盐生植物耐盐相关基因的研究不仅可以丰富我们对于植物 耐盐机制的认识，而且可以为开发利用盐生植物耐盐基因资源，培育耐盐作物品种 奠定基础，日前已逐渐成为国际上植物耐盐领域的一个研究热点。植物的抗逆特性 是由多基因控制的数量性状，其生理生化过程是基因间相互协调作用的结果。 许多研究围绕提高粮食作物的耐盐性进行，但植物耐盐性是非常错综复杂的问 题。土壤中过高的盐浓度导致植物离子失衡和过高的渗透胁迫，初级伤害的结果导 致次级伤害时有发生，如氧化胁迫损伤，离子胁迫损伤等。土壤中过高的盐浓度导 致植物离子失衡和过高的渗透胁迫，初级伤害的结果导致次级伤害时有发生，如氧 化性损伤【2 3 】等。而对于具有一定耐盐能力的植物来说受胁迫诱导调控的耐逆途径也 许会给我们更多的提示，是否可以在作物耐逆的角度上缓解胁迫的危机。 目前，在植物耐盐碱胁迫的研究中无论从分子机制上，还是实验室研究亦或是 产业上对研究成果的应用都已取得了长足进展。现已开展的主要研究包括两大类： 一是成功克隆了相当数量的逆境相关物质基因；另一类研究则是在逆境胁迫的条件 山东师范大学硕士学位论文 下，基因之间通过信号传导作用，启动某些相关基因的适时表达，从而达到抵抗逆 境、保护细胞正常活动的目的。在传统的基因工程的指导思想下，单纯转一个或几 个相关基因籍以获得外来基因的相关性状的方法，已经相对成熟。 温度是影响植物生长、发育及其地理分布的又一重要的环境限制因素。大多 数热带和亚热带植物由于缺乏对低温的适应能力，当环境温度低于1 0 时就会受 到伤害，严重影响植物的正常生长、发育甚至造成死亡。据悉，低温胁迫是影响 植物的生长发育、地理分布和作物产量的主要环境因素，细胞膜是植物低温伤害 产生的主要部位，膜和膜脂分子变化是植物感应温度变化的初始信号之一。随着 突变分析和分子遗传学方法的大量应用，以拟南芥作为模式植物，已克隆了许多 低温反应基因及低温调节的转录因子基因，明确了这些基因的抗冻功能及其涉及 的多种低温调控的信号传导途径【4 】。 一、转录因子的研究进展【5 ，6 】 1 转录因子的概念 转录因子，又称反式作用因子，是一群与启动子区域中的顺式作用元件发生 特异性结合，从而保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达的蛋白 分子。当环境条件变化时植物通过一系列信号传递，激发转录因子，转录因子与 相应的顺式作用元件结合后，激活砒蛆聚合酶i i 转录复合物，从而启动特定基因 的转录表达，最后通过基因产物的作用对内、外界信号作出调节反应。植物许多 基因的表达都是由特定的转录因子与特定的瞬时作用元件相互作用调控的。 2 转录因子的结构和分类 2 1 转录因子的结构 对转录因子蛋白质结构分析表明，转录因子一般有4 个功能区即：d n a 结合 区( d n a b i n d i n gd o m a i n ) ，转录调控区( 仃孤s c 邱t i o nr e g u l a t i o nd o m a i n ) ，寡聚化 位点( o l i g o m 缸z a t i o ns i t e ) ，核定位信号( n u c l e a rl o c a t i o ns i i l g a l ，n l s ) 。d n a 结合 区域是指转录因子识别d 】姐顺式作用元件，并与之结合的一段氨基酸序列。核定 位区是转录因子中富含碱性氨基酸的结构域，转录因子进入细胞核受该段的控制。 不同转录因子中n l s 数目不同，可含l 至数个，不规则的分布在转录因子中。寡 聚化位点是不同转录因子借以相互作用的功能区，他们的氨基酸序列很保守，大 多与d n a 结合区相连并结合成一定的构象。转录因子的这些功能区决定转录因子 2 山东师范大学硕士学位论文 的功能、特性、核定位和调控作用。 2 2 转录因子的分类 目前，从高等植物中分离的转录因子有数百种，根据它们保守d n a 结合区的 不同可分为十几类，见( 表1 1 ) ： 表1 1 ： 山东师范大学硕士学位论文 3 、植物转录因子活性调控 转录因子的活性受许多因素的影响，主要有：转录后修饰、在植物细胞中的 位置及与其他蛋白之间的相互作用等。 转录后修饰对调控转录因子的活性起着非常重要的作用。转录因子的转录后 修饰主要表现在蛋白质的磷酸化修饰上，它不仅调节转录因子进入细胞核的过程 也改变转录因子的活性或与d n a 结合的能力。由于转录因子是在细胞核内发挥作 用的，因此对其进入细胞核的过程的调控非常重要。 转录因子的活性还受到与其他蛋白之间相互作用的影响。不同转录因子通过 寡聚化区域发生相互作用对它们与d n a 结合能力、结合方式以及在细胞中的位置 进行调解。 4 、植物转录因子的功能【6 】 植物生长发育过程中，感受内、外环境变化，要通过对基因的精确调控来产生 相互作用。见( 图1 1 ) ： o 4 s c = = = = = = = = = = = = = = = 3 从3 。 洱 w 碱，帮姻 l 。 琵缝援篷托蔫群荫麓拜槐 a 示t fi ia ，b 示t fi ib ，d 示t fi id ，e 示t fi ie ，f 示t fi if 图1 1 植物感受外界干旱、高盐、激素、病害及体内细胞发育信号，通过一系列传 山东师范大学硕士学位论文 递激发转录因子即反式作用因子，反式作用因子与顺式作用元件相结合后，激活 对蛆聚合酶i i 转录复合物，从而启动基因的转录表达，最后通过基因产物的作用 对外界信号在生理生化等方面做出适合的调节反应。由此可见，转录因子在基因 的表达调控中起关键作用。 转录因子通过其功能区域与d n a 及其他蛋白相互作用，激活或抑制诱导型基 因的表达。转录因子的d n a 结合区有与顺式作用元件结合的特异性，而转录因子 调节区决定了它对基因表达起激活或抑制作用。此外，核定位区和寡聚化位点也 影响其活性。揭示转录因子对基因表达调控的具体机制，尤其是对某些调控多基 因表达的转录因子的研究，为人为的调控特定基因的表达，改良作物性状，获得 较好的植物转化结果奠定了基础。 5 、转录因子与拟南芥抗逆性的研究 近几年的研究发现，转录因子在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中的应 用越来越广泛们。植物中的转录因子，有相当一部分与抗逆性相关。由于在逆 境条件下，一些逆境相关的转录因子能调节功能基因的表达和信号转导，他们在 转基因植物中的过量表达会激活许多抗逆功能基因同时表达，可以通过转化调节 基因来提高植物的耐逆性。根据与d n a 结合区域的不同，转录因子分为若干个 家族。与植物逆境抗性相关的4 个转录因子家族包括：b z 类【1 他7 1 、r k y 类 【2 ”5 1 、a p 2 e r e b p 【3 “9 】类和m y b 【5 8 】类，它们在逆境信号转导中的作用以及 目前对它们在植物抗逆基因工程改良中的研究热揭示了这一类功能蛋白在植物 抗逆中的潜在作用。 二、休眠因子的研究进展 l 、酵母中对休眠的研究 目前，对休眠因子的研究主要是在酵母细胞中进行的。静止期细胞( q u i e s c e n t c e l l ) ：指的是暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一定的生物学功能，但 在适当的刺激下可重新进入细胞周期的细胞，又称为g o 期细胞或休眠细胞，如淋 巴细胞、肝、肾细胞等。地球上6 0 的微生物细胞都处于静止期，而且不管是单 细胞真核生物还是多细胞真核生物的组成细胞它们生命中的大部分时间也是在静 止期中度过的【5 9 1 。无论是原核生物还是真核生物处于静止期的细胞都能在无任何 山东师范人学硕i 二学位论义 营养物质的条件下存活达数年之久【6 0 1 。细胞的这种增殖期和静止期的切换涉及到 很多调节过程，因此它关系到整个细胞内结构的重建和生命过程的调控。 3 0 条件下在液体培养基中培养酵母5 到7 天，细胞增殖就会进入稳定期， 酵母细胞的生长进入静止状态，在实验室中经常用这一状态来衡量培养基的饱和 度或者被培养细胞的生长状态【9 2 】，见( 图1 2 ) ： 0 9 o d 6 f c u ，出撙 幽髓i 啪 c u u u f l 翻i a l e ： c 乳l s t 鲥 图1 2 然而，是不是所有处于稳定期的酵母细胞都进入了静止期呢? 这一问题目前 还没有定论。但我们可以肯定大部分的细胞都进入了静止期，包括新产生的子细 胞。在过去十几年旱对酵母进入静止状态的调节机制的研究已经取得了很大进展， 比如，对酵母与免疫抑制剂雷帕霉素的反应的研究或者对酵母温度敏感突变体在 不适宜的温度条件下即使有充足的营养也会进入一种类似休h 民的状态的研究，如 c 如2 j 突变体川等。有关的基因产物已经通过多种途径被发现【9 2 。 过去的研究发现，有四种途径与酵母细胞进入静止期的调节有关，t o r 途径 和蛋白激酶a ( p k a ) 途径对细胞进入静止期起负调控作用。蛋白激酶c 途径( p k c ) 和s n n p 途径则起到一种正调控作用【9 2 j 。见( 图1 3 ) ： 山东师范大学硕士学位论文 n u l r i e n t - r i c hm e d i u m 、i mg l u c o 图l 一3 目前我们对这种信号调节的了解仍然很有限，还有一些未知的调节因子有待我 们去发现。 2 、植物中对休眠的研究 植物休眠是植物生长发育过程中的一个暂停现象，是一种有益的生物学特 性，是植物经过长期演化而获得的一种对环境条件及季节性变化的生物学适应性。 休眠使植物避开不利的环境条件，而在适宜的环境条件下得以继续生长，休眠期 植物对环境条件的抵抗力强，能在恶劣的季节中存活下来，表现为一种十分重要 的适应性，通过这种适应性物种得以不断生存、发展和进化。植物的休眠特性不 仅对物种的保存繁衍方面具有特殊的生物学意义，而且在农业生产中具有一定的 经济意义。 休眠是一个十分复杂的现象，被称为“生命的隐蔽现象 。众多的研究者对休 眠进行了许多研究和探索，在种子休眠的研究方面取得了很大的成果，但在植物 体休眠方面起步较晚、研究较少，休眠的诱因尚不清楚。近年来随着新技术、新 方法的出现，在植物体休眠的研究上取得了很大的进展【6 2 】。 2 1 、植物休眠的分类 1 、根据休眠的诱因分： ( 1 ) 生态休眠指由于环境条件引起的休眠，如营养亏缺、水分胁迫、光照、氧 气不足、温度不适宜等。 ( 2 ) 类休眠指由植物外部结构所控制的休眠，为生长限制因子，即休眠结构( 组 7 山东师范大学硕士学位论文 织或器官) 以外的生理因素如( 顶端优势、光周期反应、激素) 所调节，即使在 环境条件有利时亦保持休眠，但若除去相邻器官( 叶或芽) 的限制源，则休眠结 构会迅速恢复生长。 ( 3 ) 内休眠指由植物外部结构控制的休眠，为休眠结构本身的生理因素( 如低 温需要，光周期反应) 所调节，即使环境条件有利，并且也没有附近器官的限制， 休眠结构亦不能生长，此时外源生长激素的影响极其微弱。 2 、根据植物休眠的生理活性分： ( 1 ) 自然休眠指即使给予适宜的生长环境条件仍不能萌芽生长，需要经过一定 的低温条件，解除休眠后才能正常萌芽生长的休眠。植物只有正常进入自然休眠 才能进行以后的生命活动，完成各个物候期，也只有进行休眠才能保证植物体在 不良的季节生存下去。 ( 2 ) 被迫休眠指由于不利的环境条件( 低温、干旱等) 的胁迫而暂时停止生长 的现象，逆境消除即恢复生长。在自然休眠结束后，由于当时的温度较低而不能 萌发，生长是处于被迫休眠状态。不过，这种自然休眠与被迫休眠不易从外观上 加以辨别，解除休眠通常是以芽开始活动为标志。 2 2 影响休眠的因素 l 、外因 植物进入休眠期的时间和休眠的深度因树种、品种不同而有别，休眠期的长短 与其在原产地形成的对冬季低温的适应能力有关，又与树龄、树势甚至组织结构 差异有关，如花芽比叶芽休眠早，萌芽也早，幼年树比成年树进入休眠期晚。日 照长度也影响芽的休眠，暗期变长会促进芽的休眠：温度对芽的休眠产生深刻的 影响，落叶树进入自然休眠期后需要一定限度的低温期才能通过休眠。研究认为 日照长短和温度是影响植物休眠最主要的生态因子。此外，水分、营养状况等也 影响芽的休眠。 2 、内因 植物体内部激素的变化是影响植物体休眠的内因。植物芽中存在发芽抑制物 ( 如a b a ) 和发芽促进物( 如g a 、c t k ) ，它们对种子的休眠和萌发有调节作用。 目前一般认为g a 是萌发必需的，在调节芽萌发中起着“原初作用 ，抑制物起着 “抑止作用”，而c t k 起着“解抑作用 。植物产生休眠不仅是由于抑制物的存在 也可能是由于g a 和c t k 的缺乏，其中g a 是主要的调节因子，只有a b a 等抑 g 山东师范大学硕士学位论文 制物存在时c t k 的存在才是必需的。目前认为，树木进入休眠前，随着叶片及芽 鳞片的老化，脱落酸显著增加，g a 与c t k 逐渐减少；反之在自然休眠解除过程 中a b a 逐渐增加。有报道认为，桃李、梅等果树含有的氰酸与苦杏仁苷，葡萄含 有的有机酸和生物碱等物质会起增效作用，从而有利于树体进入休眠。 2 3 休眠的调控 休眠期的开始和结束的早晚，在农业上具有非常重要的意义，因此，生产上常 采取多种措施对植物的休眠期进行调控。 1 、打破休眠 ( 1 ) 氨基氰( h 2 c n 2 ) 姚立平( 1 9 9 7 ) 用1 3 的h 2 c n 2 处理葡萄休眠芽，使 发芽时间明显提早。在巴西，用1 和1 5 的氨基氰处理“嘎啦 苹果，侧芽和 顶芽的萌发明显提高。p e t r i ( 1 9 9 0 ) 报道，油与h 2 c n 2 合用，对打破苹果芽的休 眠有明显增效作用。 ( 2 ) 二硝基邻甲酚( d n o c )南非栽培苹果，用d n o c 打破休眠已是生产上的 常规措施，油与d n o c 合用能产生良好效果。 ( 3 ) 激素d o n o h 0 、毗d k e r ( 1 9 5 7 ) 对2 年生桃喷布1 0 0 0 - 4 0 0 0 i i l k g g a 3 对 打破休眠有显著效果。用于打破休眠的激素有细胞分裂素、乙烯等。 ( 4 ) 其他化学药剂w e a v e r ( 1 9 6 3 ) 报道用硫脲打破休眠有很好效果。另外研 究发现硝酸盐类、具有s h 机能的物质( 如胱氨酸、l 9 7 谷胱甘肽) 、亚麻仁油、 矿物油、鲸油、乙醚、二氯乙烯、氯仿等有打破休眠的效果。 ( 5 ) 物理方法研究认为低温5 8 打破休眠最有效。高温亦可打破休眠， b o r c a c h ( 1 9 2 8 ) 把枝条插入3 0 一4 0 温水中1 2 h 可打破休眠。h o u s s a n d ( 1 9 8 0 ) 把葡萄插条用5 0 水处理3 0 1 1 血可解除其根芽的休眠。另外，冷库处理、人为加 长光照、变温处理也可打破休眠。 2 、促进休眠 在植物幼年期或旺盛生长期，需促其正常进入休眠，可使用生长抑制剂或其 他药剂，以抑制其营养生长。如葡萄使用抑芽丹、矮壮素或b 9 ，核桃使用硫酸锌 均可促进休眠，减少初冬冻害。 3 、延长休眠期 马铃薯、洋葱、大蒜用适当浓度的生长调节剂( 如青鲜素、b 9 ) 处理，可延 长储藏期，而不降低品质。树木在通过自然休眠期以后如遇回暖天气，有利于萌 9 山东师范大学硕士学位论文 芽活动，这时若遇春寒，将会出现冻花冻芽现象，为避免以上灾害，果树秋季使 用多效唑，早春使用g a 3 、2 ，4 d 等可延长休眠，防止早春冻害。 4 、推迟进入休眠 对花期早的树木适当推迟进入休眠期，不仅可延长营养生长期，而且可以延 迟次年萌芽和开花的物候期，避免早春冻害。主要采取后期施氮或喷低浓度的生 长促进剂如g a 3 。 三、对于未知基因及其蛋白功能的鉴定的研究背景和目的 基因组研究计划包括全基因测序为目标的结构基因组学和基因功能鉴定为目 标的功能基因组学。功能基因组学是利用结构基因组所提供的信息，发展和应用新 的实验手段，系统分析基因的功能。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以 建立生物体高分辨遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶 段，是利用结构基因组学提供的信息，以高通量、大规模实验方法及统计与计算机 分析为特征，系统地研究基因功能吼6 4 1 。 对于未知功能基因，随着被克隆基因的日益增多，对基因功能的研究也显得 日益迫切，这就是科学家们正在考虑的基因组序列和结构弄清楚之后的任务( 后 基因组计划) 【6 5 1 。 传统的遗传学研究方法对于研究未知基因的手段大致可以分为“正向遗传学” 方法与“反向遗传学 方法两类。正向遗传学是指，通过生物个体或细胞的基因 组的自发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状变化，然后从这些特定性状变 化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。 反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变特定的基因或蛋白质，然后再去寻 找有关的表型变化惭】。例如基因剔除技术或转基因研究，反应低聚物和能与1 1 1 5 斟a 反应并阻止蛋白质合成的酬技术【6 7 】。简单的说，正向遗传学是从表型变化研 究基因变化，反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。随着越来越多生物的基 因组序列被阐明，研究基因功能的反向遗传学已成为生物学领域的热点。反向遗 传学所运用的技术也在不断地发展与成熟，如基因敲除、反义核酸等均对基因功 能鉴定起到一定的作用。尤其是近五、六年内兴起的砌蛆干扰技术，其作为一种 简单有效的代替基因敲除的反向遗传学的研究工具，在后基因组时代寄生虫的大 规模基因功能研究中，具有广阔的应用前景。 l o 山东师范大学硕士学位论文 本实验所要研究的基因彳f 锣2 9 卯是通过与动物中基因比对而得到的。在动 物中该基因是一种具有休眠因子功能的转录因子，因此推测，在植物中该基因可 能具有类似的功能。利用反向遗传学的方法，首先获得该基因全序列和c d n a 序 列，并对其做结构上的改造或缺失从而达到对该基因进行定位和功能的研究。 四、绿色荧光蛋白g f p 简介 无论是在原核生物还是真核生物中，报道基因都已作为一种便利的标记广泛 应用于观察体内基因表达和蛋白定位。然而，常用报告因子，如p g l u c u r o r l i d a s e ( g u s ) 【吲，p g a l a c t o s i d 弱e( l a c z ) 【6 9 1 ，氯霉素乙酰基转移酶( c a t ) 【7 们，荧 光素酶( l u c i 蠡玎弱e ，【，u c ) 【7 l 】或者需要外源底物伴随因子或者需要抗体。因此， 它们的应用有时受到底物吸收、产物渗漏、细胞固定和细胞渗透等问题的限制， 在多细胞有机体中尤为明显。尽管一个玉米调控基因r ( k ) 通过激活活体组织 内花青素生物合成通路已被用作一个细胞自发标记，这一调控因子在不同植物体内 似乎受到细胞类型和发育阶段的影响【7 2 1 。因此，一种本身具有信号的惰性报道因 子，如生物体发光蛋白才有可能成为一种通用的细胞水平的标记因子【7 3 1 。 g f p 是来源于水母( 彳p g “d 聊订c 幻，缸) 的绿色荧光蛋白，由于具备许多突出 特点，因此被广泛应用于活体细胞作为报告基因。例如，g f p 的表达是细胞自发 性的，而且没有细胞类型特异性和细胞定位特异性；g f p 的激发只需要蓝光或者 紫外光以及氧分子，而不需要任何其他外源的底物【j 7 4 1 ；构建g 】阳与目的蛋白的融 合蛋白非常方便，而且加了荧光标签的目的蛋白的原始功能和定位不会被破坏【6 9 1 。 目前，水母g f p 已经在许多异源生物体内，如大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、哺 乳动物【7 4 1 和高等植物【7 5 】得到了表达。 在活体植物细胞中g f p 能够正常表达，利用荧光显微镜或者共聚焦显微镜都 可以检测到它的自发荧光，而且可以有效地与液泡和叶绿体的自发荧光区别开来。 g f p 的检测快速、简单、经济，而且不需要额外的基因产物、底物或协同因子。 利用g f p 可以直接测定报道蛋白的表达水平，而不必间接地去检测酶活性或抗体。 就目前蛋白在植物细胞中的表达水平而言，利用荧光计从细胞提取物( 1 0 0 0 0 0 细 胞) 中定量荧光是很困难的。然而，利用成像系统即可完成这一任务【7 们。g 】阳蛋 白与c a t 和g u s 的稳定性相当，其绿色荧光在s d s p a g e 之后仍然可见1 7 7 1 。另 外，g f p 对于光致漂白具有明显的抗性，因此可以很方便的用于荧光激活的细胞 山东师范大学硕上学位论文 类型。蛋白在细胞中的自发表达避免了底物吸收和渗透的相关问题。作为一种蛋 白标记，g 】阳消除了其他标记存在的小的渗漏的产物对蛋白的亚细胞定位和转运 的干扰。在玉米叶肉原生质体中大量表达g f p 对细胞的毒性影响非常小。 为了发射出明亮的绿色荧光，g f p 蛋白要进行翻译后修饰以形成一个环化的 三肽生色团：丝氨酸脱氢酪氨酸甘氨酸。这一三肽与g f p 多肽共价结创7 引。g f p 的绿色荧光在多种异源有机体中都曾检测到，因此推测在所有的有机体中都存在 一种通用的酶参与生色团的形成【7 4 1 。然而，最近对大肠杆菌的研究表明，该三肽 自身具有环化和氧化的催化活性【_ 7 9 】。显然，生色团的自我催化形成进一步促进a 阳 成为一种通用的报道因子。 s h e 饥等以g f p 为报道因子检测植物细胞中的热诱导基因表达情况，很方便 的在单个细胞中看到了基因的热激应答反应。同时，他们还将g f p 与光诱导的和 a b a 诱导的启动子融合在一起，看到了光和a b a 对g f p 表达的影响【7 6 】。所以g f p 可作为一种强大的工具来研究植物细胞的基因调控和信号传导途径。g 】