细菌学检验17HLA检测.ppt

第十七章HLA分型检测技术,主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)：指脊椎动物某一染色体上编码主要组织相容性抗原、控制细胞间免疫识别、调节免疫应答的一组紧密连锁的基因群。主要组织相容性抗原(majorhistocompatibilityantigen，MHA)：MHC编码的基因产物，存在于所有有核细胞的表面。能引起快而强的排斥反应。,人类MHC：HLA复合体位于第6号染色体短臂上。人类的主要组织相容性抗原HLA（humanleukocyteantigen，人类白细胞抗原）代表个体组织特异性的、引起强烈而讯速器官移植排斥反应的同种异型抗原。首先发现于白细胞表面，且白细胞是进行此类抗原研究的最适宜材料来源。,位置第6号染色体短臂，约长4000kb基因组成自着丝点起，依次为类基因、类基因、类基因,HLA-类分子：包括HLA-A、B、C分布：所有有核细胞(含血小板和网织红细胞)表面。但成熟的红细胞、神经细胞、滋养层细胞不表达HLA-分子。以淋巴细胞密度最高。,HLA-类分子：包括HLA-DP、DQ、DR主要分布于抗原提呈细胞（APC）表面。其表达水平与细胞分化及抗原刺激有关。某些情况下，活化的T细胞、胸腺上皮细胞、血管内皮细胞等也表达。,LMP（lowmolecularweightpeptide）低分子量多肽基因包括LMP2和LMP7两基因，编码产物蛋白酶LMP2和LMP7，参与内源性抗原的加工,TAP（transporterassociatedwithantigenprocessing）抗原加工相关转运体基因包括TAP1和TAP2两基因编码产物TAP分子参与内源性抗原肽的转运,HLA-类基因,位于HLA-、类基因之间补体基因C4A、C4B、C2、Bf21-羟化酶基因CYP21A、CYP21B热休克蛋白基因HSP70细胞因子基因TNF、LTA、LTB,HLA复合体的遗传特点,单元型遗传共显性表达高度多态性连锁不平衡,共显性表达（Codominance）,两条同源染色体上的一对等位基因共显性表达，都能编码相应的分子,高度多态性（Polymorphism）,多态性一群体概念，指一随机婚配的人群中，在一特定基因座位上以稳定频率出现的两种或两种以上的基因产物复等位基因共显性表达,ThenumbersofHLAallelescurrentlyofficiallyassignedbytheWHONomenclatureCommitteeforFactorsoftheHLASystemasofAugust2000.,PolymorphisminMHCClassIgenes,D.uk/HIG/index.htmlOctober2003,998alleles(657inJuly2000),PolymorphisminMHCClassIIgenes,D.uk/HIG/index.htmlOctober2003,668alleles(492inJuly2000),连锁不平衡（Linkagedisequilibrium）,指在某一群体中，不同座位上某两个基因出现在同一条单元型上的频率与期望值之间有显著差异的现象,HLA的多态性通过一系列特异性抗体确定。检测方法有血清学分型、细胞学分型和分子生物学分型方法。HLA分型使HLA复杂的多态性更得以显露，推动了HLA与群体及自然选择关系的研究，促进了对疾病本质的认识。HLA分型应用于器官移植、法医鉴定、遗传学研究探讨与疾病的相关性等领域。,一、原理：抗原抗体反应方法：微量淋巴细胞毒试验或称补体依赖的细胞毒试验(micro-complementdependentcytotoxicity，CDC)分型抗原：SD抗原(serologicallydefinedantigen)，包括HLA-A、B、C、DR、DQ。,第一节HLA血清学分型法,CDC试验原理：当特异性抗体与淋巴细胞表面HLA分子结合，激活补体，使细胞溶解。在显微镜下可见细胞被活性染料着色。标准血清+淋巴细胞抗原抗体复合物+补体溶解细胞+染料（台盼蓝、伊红）计数死细胞数,微量细胞毒试验判定标准,二、技术要点1CDC试验的关键在于获得标准抗血清。与ABO血型抗体不同，主要获自经产妇。2抗血清种类应覆盖本民族、本地区80以上的抗原。其中每一高频3份以上，低频2份以上。3类抗原，仅分布于B细胞或巨噬细胞表面，故检测类抗原应分纯B细胞。,4、注意下列假象粒细胞和单核细胞能够非特异性地吞噬染料而造成着染假象，应注意细胞形态的区别。血小板与淋巴细胞竞争，结合HLA抗体而导致假阴性结果，可用玻璃珠脱纤维抗凝。红细胞沾染易致假阳性。单克隆抗体复合物不能激活补体，不能用于CDC，可改用ELISA、FCM。,三、临床应用1HLA配型可用于器官移植与相关疾病的诊断研究。2HLA交叉配型即用CDC法检测受体血清有无针对供者HLA的抗体，以监测排斥反应的发生或估价受体的敏感性。3群体反应性抗体的检测(Panelreactiveantibody，PRA)PRA用于判断器官移植时受体的敏感程度，可用4060人混合T、B细胞，检测受者血清抗体阳性百分数，高PRA血清受体对所接受的移植物构成威胁。,方法：混合淋巴细胞培养(mixedlymphocyteculture，MLC)混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction，MLR)分型抗原：LD抗原(1ymphocytedefinedantigen)：包括HLA-D、DP,第二节细胞学分型法,MLC试验方法：反应细胞（受者淋巴细胞）+刺激细胞（供者或已知标准株淋巴细胞）不处理双向（丝裂霉素c或x线照射预处理）单向（目前仍使用）反应管混合培养观察反应细胞对刺激细胞发生应答、转化（涂片、染色、3H-TdR刺激指数SI）,结果与评价：,1阴性分型法纯合子分型细胞试验(homozygoustypingcell，HTC)纯合子是指细胞内一对同源染色体上两个HLA单倍型完全相同，只表达一种LD抗原，可从近亲婚配的子代中寻找。,试验：将一组HTC作刺激细胞，作单向MLC。结果：待检与刺激细胞的LD不同发生反应待检与刺激细胞的LD相同不反应要找的就是相同细胞故为阴性分型法。SI2，DNV(doublenormalizedvalue)10%，受抗供,还可进一步作T、B细胞淋巴细胞毒性交叉配型细胞交叉配型阳性视为移植的禁忌症B细胞交叉配型对于弱类抗体更敏感,2、流式细胞法交叉配型(flow-cytometrycrossmatching，FCC)供者淋巴细胞+受者血清共育用流式细胞仪检测3、混合淋巴细胞培养供受者淋巴细胞单或双向MLC检测HLA类抗原相容性4、自身交叉配型（autocrossmatching）受者血清受者细胞细胞毒试验若阳性可致与供者的交叉配型出现假阳性,交叉配型阳性表明受者预存抗供体的抗体作受体选择时：组织配型差，交叉配型阴性，仍可移植组织配型好，交叉配型阳性，不宜移植交叉配型常用于肾移植而不用于心、肝、肺等,二、HLA与AID(自身免疫性疾病）寻找与某些疾病相关的HLA型别，研究其发生的遗传背景，这些疾病中以AID居多胰岛素依赖性糖尿病：华人DR9，白人DR4强直性脊柱炎：B27SLE：