（化学工程专业论文）不同培养方式长期扩增神经干细胞的比较.pdf

人连理工大学硕士学位论文 摘要 神经干细胞的体外培养方式有神经球悬浮培养和单层贴壁培养两种。为寻求适合体 外大规模扩增的培养方式，本研究对悬浮和单层贴壁方式培养的神经干细胞进行了系统 的比较。首先从e 1 4 小鼠胚胎前脑组织中获得了细胞，经a e e u t a s e w 消化和机械吹打后 形成单细胞悬液，分别以悬浮和单层的方式进行培养。经诱导分化和免疫荧光鉴定两种 培养方式培养的细胞均为神经干细胞。进而分别取体外培养时间为2 l 天、5 6 天以及1 1 3 天的悬浮和单层培养的细胞，通过荧光染色、免疫荧光以及流式细胞术等检测方法对其 生长状态、增殖能力及异质性进行了比较。结果显示，通过两种不同培养方式获得的神 经干细胞都能在长期的体外培养过程中保持良好的生长状态，但其增殖能力存在差异： 在体外培养的2 1 天和5 6 天，单层贴壁方式培养的神经干细胞的增殖能力要强于悬浮方 式培养的神经干细胞，而在体外培养的113 天两种培养方式培养的神经干细胞的增殖能 力则无显著的差别。在长期的体外培养过程中悬浮方式培养的细胞中n e s t i n 阳性细胞所 占的比例要高于单层贴壁方式，而单层贴壁培养的细胞中 j m b u l i n i i i 阳性细胞的比例则要 高于悬浮培养方式的细胞。此外，本文还确定了悬浮培养的神经球在直径2 0 0 1 i r a 时进行 传代为传代的合适时机。进一步阐明了悬浮和单层培养方式所培养的神经干细胞在增殖 能力及异质性等方面都存在着差异。对于体外大规模扩增神经干细胞而言，悬浮培养方 式要优于单层贴壁培养方式。 关键词：神经干细胞；悬浮培养；单层培养 不同培养方式长赣扩璜 经干细胞的阮较 c o m p a r i s o n o f d i f f e r e n tc u l t u r em o d ef o r l o n g - t e r me x p a n s i o n o f n e u r a ls t e mc e l l s a b s t r a c t n e u r a ls t e mc e l l s 附s c s ) c a nb ec u l t u r e di nt w om o d e so fs u s p e n s i o na n dm o n o l a y e rm v i t r o i no r d e rt of i n dt h ea p p r o p r i a t em e t h o d sf o rl a 玛e _ s c a l ee x p a n s i o no f n s c s ，w ec o m p a r e d t h en s c sc u l t u r e di ns u s p e n s i o nw i t ht h o s ec u l t t w e di nm o n o l a y e rs y s t e m a t i c a l l y f i r s t l y , t h e f o m b r a l nt i s s u ew a sr e m o v e df r o mt h ee m b r y o n i cd a y1 4 1 4 ) m i c e , t h e nt h et i s s u ew a s d i s s o c i a t e di n t os i n g l e - c e l ls u s p e n s i o nb ya c c u t a s e t ma n dm e c h a n i c a lt r i t u r a t i o n t h ec e l l sw g ；e c u l t u r e di ni x a hs u s p e n s i o na n dm o n o l a y e r t h ec e l l sc u l t u r e di ns u s p e n s i o na n dm o n o l a y e r w e r ei d e n t i f i e d 协b en s c s b y t h e a s s a y o fd i f f e r e n t i a t i o na n di m m u n o f l u o r e s c e n c e f u r t h e r m o r e ，t h en s c s c u l t u r e di ns u s p e n s i o na n di nm o n o l a y e rw e r ec o m p a r e do i lv i a b i l i t y , a b i l i t yo f p r o l i f e r a t i o na n dh e t e r o g e n e i t yb y f l u o r e s c e n td y e ，i m m u n o f l u o r e s c e n c ea n df a c so n d i v 2 1 ，d i v 5 6 a n dd i v l1 3r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h en s c sc u l t u r e di nb o t h s u s p e n s i o na n dm o n o l a y e rr e p r e s e n t e dg o o dv i a u ：i vi nl o n g t e r mc u l t u r e b u tt h e yd i s p l a y e d d i s t i n c ta b i l i t yo f p r o l i f e r a t i o ni nl o n g t e r mc u l t u r e t h en s c s c u l t u r e di nm o n o l a y e r p r e c e d e d t h o s ec u l t u r e di n s u s p e n s i o no nt h ea b i l i t yo fp r o l i f e r a t i o n0 nd i v 2 1a n dd i v 5 6 ，b u tn o o b v i o u sd i f f e r e n c eo nd i v t1 3 t h en s c s p o p u l a t i o nc u l t u r e di ns u s p e n s i o nd i s p l a y e dm o r e n e s t i n - p o s i t i v ec e l l st h a nt h o s ei nm o n o l a y e ri nt h ew h o l ep r o c e s s e so fc u l t u r e t h en s c s p o p u l a t i o n c u l t u r e di nm o n o l a y e r , h o w e v e r , d i s p l a y e dm o r e t 3 t u b u l i n l i i - p o s i f i v ec e l l st h a nt h o s e i ns u s p e n s i o n i n t h e s a m e p e r i o d a d d i t i o n a l l y , w e d e t e r m i n e d t h es u i t a b l e d l a m e t e r o f n e u m s p h e r e s t o b ep a s s e dw s sa b o u t2 0 0 n t h er e s u l t so ft h i ss t u d yf n r t h e ri n d i c a t et h a tt h ec u l t u r e dc e l l sa l e d i f f e r e n ti nb o t ht h ea b i l i t yo f p r o l i f e r a t i o na n dt h eh e t e r o g e n e i t y a n dt h es u s p e n d e dc u l t u r e m o d e e x c e l s t h e m o n o l a y e r c u l t u r e m o d e f o r l a r g e - s c a l e e x p a n s i o n o f n s c s 。 k e yw o r d s ：n s c s ； s u s p e n s i o n ：m o n o l a y e r 独创性说明 作卷郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导f 进行的研究工作 及取樽磅究成果。尽我所知，除了文中特舅翻* 戳栎注和致谢黔越方并，论文 中不包禽其他人已经发表裁撰写的研究戏果，也刁i 包禽为获留大连理工太学 或者其他照橙的学位或涯书所後蠲过的攒料。与我一同工俸的同志对本磺究 所做的贡献均已在论文中做了喇确的说明并表示了谢意。 作者签名：咎习期：必 大连理工大学硕士学位论文 号l畜 螓霉动物孛枢 枣经系绫套羞趣乎想象戆复杂经，莠量只露缀煮龌夔叁我修簧瞧力。 这些特性使得治疗神经系统的退行性疾瘸和神经系统的损伤变得尤为困难。随着憋个社 会老龄入口的逐渐增多，遮一挑战日益增大。例如，在美国每年用于治疗老年痴呆类疾 病戆费趸羲达刭1 , 0 0 0 亿荚元。嚣这一数字每年还在不叛递灌。这类疾痪无论奁经滚上 还是在情感上都给患者的家庭带来沉重的负担【l 】。 幸运的慰，胚胎和成体中枢系统中舆有自我修复能力的干细胞的发现为损伤和退行 惶疾瘸瓣治疗带来了一线藜望圜。瞧是中柩 孛缀系统串戆 牵经于缨艇资源卡分毒疆，孬 且获取于细胞的技术十分复杂，难以从病人脑中或脊髓中取姐足量的神经于细胞使之分 化成所需的神经元和胶质绷胞用以移植治疗。阏此，必须设法利用少量的神经干细胞来 源进行俸步 大蕊模蝰养，使 孛经予缀蘧褥嚣大豢罐殖，霜霹缣籍荚予细燕采分耗之特 歪， 从而为中枢神经系统疾病的治疗提供细胞来源。 成体干细胞可以从自体或同种异体取得。自体干细胞体外扩增并最终进行移植治疗 哥瞵馥笼遂镣俭理溺题。鼷楚囊髂享率经予缡蕤熬取耱卺位秘方法在技术上存在着溺题， 异体神经干细胞在短期内可自更具可操作性。并且神经细胞对于异体移植的免疫反应较 其他种类的细胞要小得多。神经干细胞的体外扩增可以提供相对大量和稳定的细胞来源 震予遴行生鹈学研究和移撩治疗f 3 l 。 神经干细胞的体外培养方式主要有嚣张：一l 中是以悬浮的方式强培养器皿中成球培 养，另一种是在经过处理的培养器皿的表面以单层贴壁的方式培养。r e y n o l d s 等大部分 学者主要采强悬浮豹方式珞养神经于缨稳辨8 。餐采用魏种方法臻葬 串经干绷麓霹，随着 申经球尺寸的增长，培养基内的营养物质渗入逐渐减少，会使 申经球内形成暗黑的核心， 内部较易出现调亡、坏死以及吞噬细胞 9 】，甚至可能出现神经球中空的情况f 1 0 j 。g a g e 等 人警采用单整貉壁静方式臻莽箨经干细黥i l l , 1 2 1 。荦层鼯蕤培养的细稳与涪养蒸接触充分， 不存在营养物质的交换困瓣问题。丽且以单层的方式培蓁更蠢利于形态学的观察秘免疫 技术的操作【l 司。但怒在单层贴壁培养过程中可能出现干细胞分化的现象 1 3 q 5 。悬浮和单 层这两琴孛培养方式备其优势，穗将同时采用这稻稀培养方式培养的神经于细胞进行系统 不同培养方式长期扩增神经干细胞的比较 的比较还未见报道。因此有必要对悬浮和单层贴壁这两种培养方式进行综合的比较，对 比其培养的细胞在活性和增殖能力及细胞异质性等方面的不同，以期得至4 适合神经干细 庭薅努大鬟凑扩臻豹蘩养方式。这对予麓决中枢享枣缝系统缨戆移穰治疗遘疆中豹绥疯来 源问题有若熏要的意义。 大连理工大学硕士学位论文 文献综述 麓藿缨辫发育分纯骚究静深入，予绥耱熬磷究与疲塌毫逐渐成为瑟豹分支学辩。当 前对中枢神经系统干细胞的研究已曦为发育神缀生物学的重要部分，也是继造血干细胞 之后，研究比较全面的另一重要的系统干细胞。胚胎与成年哺乳动物脑内均存在具有多 淘分纯漤缝虽麓够维持垂我更薪懿毒率经予缨稳，近年泉这一赢已逐濒成为神经生物学家 的共识。 在一系列实验研究的熬础上，人们已经开始尝试便用刺激神经辑生的方法来治疗神 经变犍疾痍。瑟基予捧经蘩髂缨瓣或类 孛经于缨瑰瘁供钵进行缨您移禳，簸黯上述细怼 进行永生化处理，建立稳定的细胞株，以此作为介导目的基因的载体，为神经系统伤病 提供基因诊疗的研究已经黧诸报道。蟊翦，神经干细魏研究的幅度与进度不一。对于神 经干细胞的定义，墩存在争议，大多数磷究者对于细胞的定义是借助于其它系统如血液 系统的干细胞的定义来考虑的，并提出了干细胞应具备多向性的分化潜能，高度增殖能 力并熊够送霉自我复毒4 更掰。但燕也有磺突者提出于纲腿豹定义应该依照箕器富系绞黪 不同而有所区别，就神经系统而言，神经干细胞的定义应该较为宽涎，可以指中枢神经 系统中经褥长麓捷 l 新生缁脆弱蓊体绍魏，萁定义瘦铡燕予神经干维脆豹缀脆荐生功麓， 而不应强调包括某些特定功能如多向性分化能力等。商学者认为当前神经于细胞的定义 除包括可j | 奠生成神缀元和胶质细胞的多商性干细胞之补，也旋包括浆些具裔干细胞特性 但分化力棚对局限的定向性于细胞，如少突胶质褪缨腿等。 1 1 神经千细胞在体内可能的位点 经典的发育学理论认为哺乳动物中枢神经系统神经发育局限于胚胎及出生后早期。 残钵中枢 孛餐系统长翅以来一直被谈为蹩不存在予缨臆静。邃也裁纛眯着它在受到损伤 或发生疾病聪不能够自我恢复。然而，：i 鹾年来的研究显示在成体中枢神经系统的巢些特 殊区域存在着由于细胞分化而来的神经元和胶聪细胞。胚胎和成体神经干细胞通常被定 义为爨有增氆移謇我重建熊力、其有多商务纯潜麓懿一类未努纯缅藏。a t t a m a n 和d a s 酋先证明，在成年啮齿动物前脑具露神经元形态的细胞中有d n a 合成的现象。但出于当 时还缺少细胞特异性的标记物，所以不能断言这些细胞就是神经元。1 9 9 2 年r e y n o l d s 瑟w e i s s 透过组织螭养实瑷了缢缀飚扩增为鑫静静蠲藏扩增，并 歪鳃扩增纲耱其商典鍪 不同培养方式长期扩增神经干细胞的比较 的干细胞特征，即具有多向分化潜能及自我更新的能力。单克隆培养的神经干细胞可以 诱导生成神经元，星形胶质细胞与少突胶质细胞【2 j 。随着研究的不断深入人们发现在体 内的很多位点都存在着具有神经干细胞性质的细胞，如海马、纹状体1 8 1 、脑室下区【1 8 】、 侧脑室的室管膜嘲、嗅蝌1 卅以及视网麒9 1 。 在不同的鉴定中，组织专一的神经干细胞通常位于一些特殊的位置，在那里它们周 围的环境影响它们的增殖和分化。神经干细胞的微环境是由中枢神经系统的特殊的区域 组成的，包括这些区域的细胞结构特性以及很多的细胞和分子，如细胞间联系和细胞信 号、以及邻近的脑髓流、血压和一些细胞基质等。 海马是大脑皮质最古老的部分之一，在进化过程中，对于记忆的形成起着重要的作 用。在海马齿状回的亚粒状区存在着具有干细胞性质的细胞。用b r d u 标记小鼠这个区 域的分裂细胞，大约5 0 的标记细胞分化为齿状回颗粒神经元，1 5 变成胶质细胞，其 余的标记细胞没有明显的表型p o 。在人的海马齿状回中，一些b r d u 标记细胞表达n e u n 、 神经特异烯醇酶等神经元的标志，如同小鼠实验中一样，被标记的神经样细胞形态类似 齿状回的颗粒细胞。其它被b r d u 标记的细胞表达神经原纤维酸性蛋白( g f a p ) 一 种星形胶质细胞标志。五个癌症患者( 年龄5 7 7 2 ) 在死前被注射溶于盐水的b r d u 进 行尸检研究，在最老的患者体内有许多b r d u 标记细胞，这显示海马直至生命后期都有 新生神经元的形成【2 1 1 。 侧脑室周围的前脑中也存在着具有干细胞性质的细胞，它们可从形态学上区分开来。 有纤毛的室管膜细胞存在于脑室，与之邻近的存在于室管膜下或脑室下的是混合的细胞 群体，包括迁移至嗅球的成神经细胞( 未成熟神经元) ，前体细胞和星形胶质细胞。星 形胶质细胞可以依靠它们所含有的胶质原纤维酸性蛋f l ( 6 f a p ) 来鉴定，而室管膜细胞含 有神经干细胞标志物n e s t i n ( 巢蛋白) 。最近有报道称存在于大鼠脑室下区域的星形胶质细 胞在体内起到神经干细胞的作用，这些带有星形胶质细胞标志的细胞产生神经元，表达 特异的神经标志。虽然传统观点认为星形胶质细胞是分化细胞而不是千细胞，但体外研究 证实这些星形胶质细胞事实上就是干细胞，是能够形成神经球并能被进一步诱导形成神 经元或胶质细胞的未分化细胞群体 2 2 - 2 4 1 。在成体啮齿类动物脑中另一个可能是干细胞的 是室管膜细胞。有纤毛的室管膜细胞排列在后脑室，人们一度认为他们是不分裂的细胞 大连避工大学硕士学役论文 2 5 1 ，并其有血一脑屏障的功能瞄j 。n 此成体啮齿类动物的中枢神经系统脑室下区室管膜 细胞是干细胞的观点一直不能被接受。然而，最j 琏有项研究表明，存在于成体大鼠中枢 耪经系绕虢室静窒管貘缀瞻确实吴骞予纲藏豹性联，使曩嚣令分子掭签一一荧竞蠢逗d i t 和带有l a c z 标签的腺瘸毒载体对其谶行标记。标记后的几天，在向嘴迁移带( 从侧脑室 到嗅球) 巾可看至qd i l + 和k z + 的细胞，而后在嗅球中也可看到遐螳标记的细胞。嗅球内 戆标记绥藏对襻经元绥爨特舅整蚕记t 3 m b u l i n 噩i 帮m a p 2 毒疆熬反应，这谖骥终内藏薅 大鼠的室管膜细胞从脑室沿着向嘴进移带迁移，形成嗅球神经元i 1 8 1 。 在体外进行神经球分析，显示d i l + 细胞是神经千细胞，能产生星形胶质细胞、少突 胶屡细稳黻及享孛经元。麸夔室系统分褰蹦蕊记鬃藏在努爱滠存凝下培蓁，产生亭枣经球。 大部分神缀球是d i l + ，它们能自我更新，可诱导分化产生星形胶质细胞、少突胶质细胞 和神经元。个别的从脑寂分离的d i l + 寰管膜细胞能产生具有自我更新能力的神经球，并 磊 分证影威褥经元嚣浚爨。将5 ，演滕襞渌萤圆r d u ) 麓至l 大藏饮，瓣东孛，嚷扣6 蠲，爨 显示室管膜细胞的体内分裂。溴脱氧磁苷( b r d u ) 怒d n a 的前体物质，只能熬合入分裂 细胞。通过一系列的实验显示室管膜细胞在体内分裂。形成脑室下区域的祖细胞群【1 8 1 。 然惑，在俸痰鉴定穆经予缨夔龆憝一薛疆毒争誊义戆事密，室整貘在蘸来被谈瓷是由 终端分化的细胞组成的，但是近来的研究认为它们w 以分裂为活跃的细胞和神经干细胞。 与此对应的其他的一些研究显示，在体外室管膜细胞能够长成神缀球，虽然它只是单潜 麓浆只长残荻囊绥蕤。勇努，还露缀遂称室警膜缀憝不戆分裂瓷不艇长成害枣经球，麸 两个神经发生区域获得的星型胶质细胞才是神经干细胞并能在成体的大脑中产生神经干 细胞。体内的研究显示了一个神经发缴的模型，星型胶质细胞在s v z 长成幼稚的神经祖 缯藏，最鼹发弯藏成耱经囊熬，著量髂多 夔磅突袭翳s v z 静星爱菠凌缨稳戆长成e g f 应答的神缀干细胞。在海马的齿状脑阐，星型胶质细胞经由一个中间的细胞类溅发生为 成神经细胞。 除了亵海马翡鸯羧瑟嚣秘s v z 蔽莽莲季聿经子缫您之癸，筑羧箨露努髓、麓三、第霆 脑室等部能获得的细胞猩体外也显示出了神经干细胞的特性。这然研究显示成体中枢神 经系统的神经发生比以前想象的更为广泛。依据这观点发现神经发生在整个成体时联 蚜存在，毅燕懿襻经元可骧被运送裂务个裁谴。这爨个糠爻戆发现，嚣蠢霞纛渡谈羹 不同培养方式长期扩增神经干细胞的比较 是人类认知的最高的位点，并且在这之前没有报道称在灵长目和非灵长目的大脑皮层有 神经发生。 虽然一些干细胞能被确认其在体内的位点，例如胚胎干细胞被认为是那些从囊胚的 内皮层获得的细胞团，但是更为深入的体内研究仍需要胚胎和成体的神经干细胞的细胞 标志物和准确的体内定位。 1 2 神经千细胞的生物学特性 1 2 1 神经干细胞的产生和迁移 神经干细胞的两个主要的功能是：( 1 ) 产生神经干细胞，即自我更新。也就是说两 个子细胞中至少有一个保留着干细胞的特性。这样的自我更新使得千细胞得以延续。这 也是神经干细胞得以长期生长的必要条件。( 2 ) 神经干细胞能分化成中枢神经系统的主 要的细胞类型即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞田】。但有时神经干细胞也会终止 增殖，变得静止，这时认为它不是真正的干细胞，但一旦它重新进入增殖循环，其仍有 成为干细胞的潜能。但认定神经干细胞的一个主要的难点在于，它们只有在表现出相应 的功能能力时才能进行定义，但在对它进行检测时他的特性已经改变。这使得在体外对 它们进行研究变得很困难【2 7 j 。 神经干细胞在脑室下区增值，每天有约3 0 ，o o o 个神经组细胞产生并迁移到嗅球【1 8 1 。 在脑室下区发现了两种主要的细胞，神经祖细胞和星形胶质细胞。后者形成一种所谓的 胶质管，通过这些胶质管神经上皮细胞进行迁移，最终到达嗅球的末端。这样它们到达 了嗅球的浅层并最终分化成为小颗粒神经元和球旁神经元。胶质管由表达成熟星形胶质 细胞的标记物一一g f a p 的胶质细胞组成，也包括细胞骨架蛋白n e s t i n 和v i m e n t i n p 引。这 样的胶质管的存在暗示着在中枢神经系统的发育过程中有一些幼稚的胶质细胞引导着神 经元的形成。这显示胶质管影响着s v z 的神经上皮细胞的迁移。然而，星形胶质细胞在 这一过程中确切的角色还不是很清楚。它们可能只是扮演着阻碍神经上皮细胞在到达嗅 球之前离开迁移路径的角色 2 9 1 。虽然星形胶质细胞的存在对于迁移的过程不是最根本的 要素，但是它也是促进这一过程的因子。星形胶质管和神经干细胞不但在脑室周区不共 存，在r m s 路径中也是如此，它可能只是创造一个适合神经干细胞迁移的微环境 3 0 】。 大连理= _ l = 大学硕士学位论文 艇室下隧的愍外基矮包含缀多的缨您糙会素秘蛋自多糖，这缓可能对手控铡缨憨阉 的迁移分化掇关重要。在脑室下区有脑髓流动，使得细胞间的空间变大，胞间联系减少， 存在分子相蒺的水协同运输，这对于脑室下区的生化微环境的建立也很重要i 3 ”。 缮爆造盎于细殿中款獠念，援摆纲您鸯我熨赣兹力，霹以将 g 类毂黪分类搽准；| 入 神经千细胞，将其分为长期和短期神经干细胞。但我们必须认识到( 1 ) 这只是显示了细 胞发展的潜能，而不是它在体内真实的命运，并且( 2 ) 细胞在体外发育的情况很大程度 上俊羧予墙券兹邵壤。套摆因黪壤葬条停下扶不同戆区域缮烈豹纲耱仍然表理爨了不弼 的自我更新的能力。这样就导致了对在体外显示出不同自我更新能力的细胞需要进行分 类培养1 3 0 。 2 2 神经予细胞鹣可鼙健 最然神经于细胞在体走一般只发育成神经缨胞，但是他在体乡 发育鲍潜能魄人l f 】掰 想象的还要大。基于体内移植的研究，人们对于神经干细胞的可塑性及其生存所依赖的 徽环辘有了踅好静认识。侧翔将神经予细胞移辍鼙| 海舄，便使得程这一藓域有神经发生 出现。但是羲是将海马享申经于细胞移植至其德豹区域，如脑室下区那么可以产生院海马 中更多的细胞类型。而且将其移植到成体大脑没有神经发生的区域后在那里有胶质细 胞发生。在向脑内灌注的一些生长函子翔e g f ，f g e 2 ，t g f a 存在的情况下，在脑室下区 的细胞发生了增殪，共虽囊于生长因子搜用黪不同， 枣经越细照黪愈运也会枣爨改变。 尤其魁e g f 的灌注可以导致脑室下区的细胞发生，并凰发生的胶质细胞要多于神经元细 蘸尹弼。 避来的一些磅究表竣，在适滥懿枣i 激下，害孛经于绷难能褒理出b 在髂痰戆生理条髂 更为广泛的发育潜能。研究还发现神经干细胞还能发育成其他胚层的细胞类型。有报道 称成体的神经干细胞在体肉髓发商成造斑细胞渊。一黧因子畿在体外诱导a c l 3 3 阳性的 妾s 分毒枣经组织发弯爨盘缨胞嘲。 微环境时于神缀干细胞一些潜在的寝达和广泛的发育潜自& 至关震要。酋先，只有一 些位甏的神经干细胞才其有这样酌转分化功能。只有脑室下诞的细胞而不是纹状体和大 脑皮鼷豹细臌l 进行这样的转分饯。应趣f a s c 富集p n a i o h s a i o 瓣享孛经予鲴鼹可以戢 实2 5 0 0 - - - 5 7 的转化率。攀实上只有神经干细胞而不包括星形胶质细胞和神经元细胞能 不同培养方式长期扩增神经干细胞的比较 分化成非神经细胞口“。实际上转分化显示了分化细胞通过关闭世系严格的基因并激活另 一套分化细胞的基因来获得新的细胞类型的能力。在转分化过程中有时两套抗原都存在， 但是神经干细胞广泛地发育潜能所产生的转胚层的分化则依赖于特殊的条件。在神经干 细胞移植进体内之前没有检测到造血和骨骼肌标识。并且没有检测到中胚层和外胚层的 标识，如t r o m a 一1 。但他们在移植之后发育成了这两个胚层的细胞。 近来的一些实验表明转胚层分化可能是一种完整的组织再生过程如一些爬行动物的 再生。在其尾部被切断以后神经外胚层星形胶质细胞可以发育成尾部，也可发育成中胚 层的软骨和肌细胞。这些研究表明胚芽的存在( 由去分化的细胞组成) 可能可以解释这 种现象。这也可能被认为是神经外胚层的转分化。在培养成神经球时细胞转化成骨骼肌 细胞的比率比解离成单个细胞时下降了8 0 ，当神经细胞聚集在一起时他们之间的神经一 神经信号强于使之转化为骨骼肌的信号。这样这些信号可能决定了神经干细胞的命运。 这种现象被解释为经典的“群体效应”。在体内这些信号可能存在于胞外的微环境中。这 些转变可能需要胞间的联系，当神经细胞和肌源细胞用透水的膜分离或者将神经细胞放 置于肌细胞的条件培养基中的时候这种转变将可能不会发生。神经胚层的转换至少同胞 间联系有关，也同诱导的和被诱导的细胞之间的信息交流相关d 0 l 。 1 2 3 神经干细胞特性的维持 成体动物体内的干细胞是与其他的终端分化细胞同时存在的。在造血系统中，局部 环境因子对维持干细胞处于未分化状态具有关键性的作用。在少突胶质细胞祖细胞的细 胞群落中，可能是通过n o t c h 途径起着这种作用。n o t c h 基因编码膜受体蛋白，细胞与细 胞间的作用激活其配体，可以延迟其分化进程 3 8 】。胚胎及成体少突胶质细胞祖细胞均表 达n o t c h - 1 基因，少突胶质细胞及某些神经元表达其配体。n o t c h 激活时，如何维持少突 胶质细胞祖细胞的未分化状态是今后研究的目标之一，这有助于了解n o t c h 在其他的中 枢神经系统干细胞中是否起了同样的作用。了解维持干细胞状态的作用机制对于了解成 年神经组织的再生有相当重要的意义。神经干细胞能够产生的子代细胞的类型对于研究 中枢神经系统的发育及寻求适当的细胞治疗的途径具有重要的意义。部分永生化的中枢 神经细胞干细胞株是通过v - m y c 基因导入而实现长期传代的目的，但永生化的方法在 一定程度上改变了细胞的生物学特性。成体脑室下区和海马齿状回的干细胞在体外培养 大连理工大学硕士学位论文 中可以生成神经元和神经胶质，但是它们各自在体内生成什么细胞尚不明确。明确其分 化潜能的方法之一是将干细胞移植到中枢神缀系统的其他部位再判明其分化的目标产 物。褥原代臻养懿轻骀藏室下送豹缡藏移檀入释齄攒j 脑室，这些缩瑰在辛拳经辘豹不嚣承 平上可以发生整合势分化成为神经元 4 0 l 。但是这些细胞并不整合入皮层或海马，而且仪 形成小神经元。一般认为这些细胞是中间神经元，这魑研究结果表明，脑潦下区的细胞， 可戳在圈瀑鹣繇境中迁移并分纯，餐燕荬发旁潜戆帮受至l 菜耱程度静疆翻。齄塞下区静 细胞群分离艏再进行移植，可以通过于细胞的扩增实现移植的目的。扩增的方法之一是 生长阑子刺激法。将e g f 扩增的纹状体胚胎祖细胞城皮层祖细胞移植至胚胎脑璧区后， 生长爨鬟形胶矮缨蕤占优势静鲴魏群落，这与e g f 对获度绥施静稳分亿趋商往特点相符 合。b f g f 体外扩增的海马祖细胞可以产生成熟神经元，丽不是海马 申经元【4 l 】。在上述蛇 过程中仅仅产生中间神经元，这可能与细胞分化的能力受限，或移植环境中的信号特点 有关。一量移植鲻耱进入都些具有神经袋成能力静臻驻区城，就搿激分纯成幸串经元，在 小脑内则相反。可见在神缀元的形成过稷中，局部环境内的馈号控制作用楚相当熏要的。 人们同样希缀了解神经干细胞生成多巴胺能神经元的隧力如何，在帕金森病的大鼠模型 懿纹状体内 矗入嚣貉季孛经藏傣鲴魏，这筵绍稳可淤产生多巴胺能神经元，入神经前体细 胞在e g f 和b f g f 的作用下可以在多巴胺能的纹状体存活，部分细腿星t h 分泌活性。 对大鼠的进一步研究结果表明胚胎大鼠的中脑细胞用b f g f 扩增，去除生长因子移植后 可敬蠢# 分分偬生或大董豹t h 阳谯缨胞。 2 ，4 毒枣经卡细胞农涔悫戆缨照表型 早期的形态学研究表明。在正在发育和成体的大脑的s v z 中存在很雾种的细胞类型。这 一解释在当时被广泛认同，认为在中枢神经系统是没商可以褥生的干细胞存在的。近年 寒重凝磅究了残钵s v z 懿缝橇穰不鼹类銎戆绥蕤籍戆；增鏊鞫迂移虢或褪经纲臆，缓慢 分裂的星型胶质细胞，快速分裂的祖细胞，以及室管膜细胞等。这她细胞被鉴定了基本 的细胞周期的长度、超结构、和抗原表型 4 2 1 。根据上筒提及的不同的研究照示星挺胶质 缨愍纛室譬睽绥愍怒一般懑义懿 孛经手缨瞧，褥，我辨缝绥稳绒考室篱貘缨施遣哥髓是裰 细胞或者严格限制的祖细胞。 不同培养方式长期扩增神经干细胞的比较 迁移的成神经细胞在s v z 被认为可能与暗细胞有关联。这些类型的细胞显示了一个 纺锤形细胞体具有一个或两个细胞进程。它们的细胞核显示一个具有浓缩的染色质聚集 的分散的染色体，偶尔展示细胞核的缺1 2 1 。有很多的微管分布在长长的细胞突出中。它 们是n e s t i n 免疫阳性细胞。p s a - n c a m 和t u j l 以及g f a p 和v i m e n t i n 阳性细胞1 2 5 1 。这 些细胞从s v z 迁移到嗅球，这一迁移过程不是通过放射胶质细胞或者轴突纤维引导的， 能允许成神经细胞高速( 3 0 9 m h r ) 地通过迁移链h 那。s v z 星型胶质细胞被认为含有l i g h t 细胞质，包含很少的自由核糖体，大量的g n 心免疫阳性的中间丝，显示出不规则的细 胞轮廓，有时s v z 星型胶质细胞还与室管膜壁关联展示出单个的纤毛。s v z 存在两种星 型胶质细胞，它们在超结构特性和分布上不尽相同。除了表达g f a p 以外还表达v i m e n t i n 和n e s t i n 但是不表达p s a - n c a m 和t u j l 。星型胶质细胞也表达细胞表面糖蛋白l e x 4 4 1 。 神经前体细胞显示出平滑的细胞轮廓，它们的细胞核显示出很深的缺口，及分散的 染色质。在胞浆中包含有大量的高尔基体，但是核糖体较室管膜细胞少，没有中间丝。 在s v z 的神经前体细胞被发现聚集成- - 4 , 簇，这些细胞能被抗n e s f l n 抗体所标记，并且 是g f a p 、v i m e n f i n 、p s a - n c a m 和t w l 的免疫阳性细胞。这些细胞类型同多潜能的 能长成神经元的星型胶质细胞和祖细胞有关 2 5 】。近来的研究显示这些细胞表达e g f 受 体，而e g f 可以使其转化成为多潜能的神经干细胞。并且大多数的e g f 应答的细胞在 体内和体外都表现为神经前体细胞类型【4 ”。室管膜细胞表现的特征是存在纤毛( 每个细 胞4 0 - 5 0 个) 在细胞的表面。在侧表面这些细胞同邻近的细胞相连并存在交联复合物。 它们的细胞核呈球形，细胞质低电子密度，并显示出很多的线粒体。它们是g f a p 和 v i m e n t i n 阳性，p s a - n c a m 和t u j l 阴性的细胞，它们也是l e x 免疫阳性的 4 4 1 。 1 2 5 体外培养的神经干细胞的细胞表型 体外培养的细胞，其表型也被很多的小组研究过，k u k e k o v 等人检nt 从成体的小 鼠大脑获得的神经球，结果产生了两种神经球i 型和i i 型阳。在相差显微镜下，i 型神经 球是相暗的，他们由高电子密度细胞围绕着一个核而形成。早期的i 型神经球是n e s t i n 阴性的，g f a p 和1 3 - t u b u l i n i i i 阴性，l 1 表面黏附分子阴性。它们由相暗，n e s t i n 阴性阶 段发展到相亮，n e s t i n 阳性阶段，再发展到相亮的型球。i i 型球是n e s t i n 阳性的，其 中的高电子密度细胞比i 型球少，并且能分化成神经元和胶质细胞。 大连理工大学硕士学位论文 磷究者对从大鼠胚脸获褥螅由e g f 扩增的爨浮生长鲍 枣经球纲胞进行了超缝稳靼捷 原特性的检测 4 7 1 。这些神经球被解离后进行了缎代培养，它们又能熏新长成神经球。这 显示它们能够自我蘸建。并且当把它们种至0 有霸附因子的器_ 蕊的表面并停止加入e g f 对， 它们分化成为 睾经元积胶艨细照。在这一培养过程中敬细胞钰搀害枣经于细胞积毒枣缀蘸俸 细胞，因为神经球中的某些细胞怒a 2 8 5 ( 早期胶质祖细胞的标志物) 免疫阳性的。在神 经球中发现了两种不同的越结构和抗原表型的细胞群体，v i m e n t i n 弱阳性n e s t i n 阴性 约嘻缨腿移v i m e n t i n 阳蛙n e s t i n 阳性懿嶷缨黪。这嚣秘缨飓在影悫学上都鼹暴了不援魁 的轮廓，在胞浆内脊很多自由的核糖体，适当的发育的高尔基体，粗面和平面的内质网。 它 f 】有很大的细胞桉，细胞核中分散着大量的染色质，拥有一个或两个核仁。这蹙细胞 逶过交联物掇互熬瓣聚集，表达e - c a d h e r i n 、n - c a d h e r i n 以及a - c a t e n i n 彝，c 蘸融酝。鞋 上的结果表明，克隆获得的细胞可以通过特殊的c a d h e r i n c a t e i n f l 胞骨架复合物交联在一 起聚集成球。球内酌细胞也显示出了具脊通过细胞问空间的能力和器噬的能力。在神经 球悫都霹 鬟淡测到器噬现象：将簧死亡豹缨照浆分子辫羞减弱；建壤缨藏澎戒一令巢狡 结构凇备吞噬死亡细胞：巢状结构内部的细胞出现凋亡和坏张；邻近的细胞将这燃细胞 吞噬。 这些钵步 培葬豹缨臆露在其链鲮磺究中的搓透懿缨貔没蠢愿褒体蠹瓣缨脆窍渍骥 的同源性。这些可能是由于体内和体外环境的不同所致，例如我们没有向培养基中加入 胆固醇等物质，但怒神经球内部的细胞可能通过吞噬等过程获得他们生存所需要的胆固 醇等冀毽豹营养甥震，悉这些营莽物痰霹女l 是焱体态掰不需要戆。魏乡 超结构豹研究毫 经证明培养的神经球缺乏一个明确的基本的薄层，而强体内的s v z 则有这样一个薄层。 他从疯管延伸，与s v z 所有的细胞都有广泛的联系。在与室管膜细胞交联的小球处聚集 缀多瓣售号分子拜g 】。这一慕奉戆藩层是耪经于纲燕微琢凌豹蘩要缝簸，扮演着固定察疆 控的作用。尽管有上述的很多的研究，但是神经干细胞的超结构的特征仍然是不为人所 知的，因为鉴定一个单细胞是否怒多潜能的干细胞的唯一的方法就怒分析熟自我熏建的 缝力黧多蠢分讫静滏戆。毽是这垫缨德冬天察豹骚究下瓣e 失去了分拖成予枝纲耱靛秘 会。 不同培养方式长期扩增神经干细胞的比较 。3 季牵经手缨脆豹鉴定 1 3 1 神经干细胞的标志物n e s t i n 中间丝家族像括超过5 0 零申的细胞骨架蛋囱。他 f j 通常分为6 5 n ，n e s t i n 是第v 族 静中闻丝蛋自。因为有一些雨矽 源的基因确黼，因诧有辩穗褥其归入簇串。1 9 8 9 年 m c k a yr 带领的研究组利用单赢隆技术明确了神经系统前体细胞特异性鬣白( n e s t i n ) 的 氨蕊骏序列，随厨又避一步明确了编码该蛋囱的基因序列，他 认为这种蛋白是神经系 统蘸体缀艟的标诞黉鑫，著将冀命名为 孛经上皮于缓臆蛋融。随不霹缌织系统的发育磷 究进展人们逐渐认识到n e s t i n 谯其他系统的发育组织中也得到一定程度的表达如发育中 的平，潜腿细胞和牙釉质细胞等但是在神经系统发育过程中n e s t i n 的表达始终局限在神经 干缨胞阶段。n e s t i n 静表达研究最初是在中箍 串经系统中。在中枢 串经系统的干细魏中 有袭达【4 9 】，随着干细胞的分化，n e s t i n 的表达被负调控并被其他的中间丝疆自所取代，例 如 申经元中的中嘲丝和星型胶痰绷照中的g f a p t 5 0 l 。n e s t i n 还存在于发霄中和成体的大 藉肉皮缁魔中1 5 t 1 ，在大脑受到矮伤丽发生的激鳖胶质缅施审，在各静蠢人驰大脑或中枢 神镪系统肿瘤而敬得的细胞系中均有表达【5 2 1 。此外n e s t i n 逐在非神经组织的正常的细胞 中蠢表达，例如谯胰腺侧、腿肉【5 4 】、心脏1 5 5 】、矛齿5 6 1 、以及一些肿瘤缨臆中。在一些缨 腿中n e s t i n 藏其纯的中闻丝蛋酝一同出现。n e s t i n 不麓自融单独形成中灏丝，而必须黼 维生索等其他物质共同形成中间丝。以上表明n e s t i n 不仅存在于中枢系统的干细胞中， 所以肖n e s t i n 表达不一定是神经翦钵细腿，它只是被认为怒神经组细胞的主要敦表达标 志穆。 1 3 2 神经干细胞的其他标志物 剿基藏为止没蠢特异性的秘经手纽戆嚣标卷物竣发现，这也戎荛了签定孛抠襻经系 统或神经球中的神经干细胞的主簧障碍。细胞被不同的研究者分类，实际上这些类型可 能指的是同一类的细胞。这一问题是由于不同的研究者之间缺乏一致的意见以及神经干 缨戆在落痰弱体步 不司款行兔鞠敞乏识剐不强发蠢蹬段耱经缀邃麓撩态糖_ 舞致。缀多分 子已经被一些小缎用作是中枢神经系统干细胞的标志物。除了n e s t i n ，在神经前体细胞中 的r n a 交联蛋白m u s a s h i l 在胚胎和成体的增殖的多潜能的祖细胞中都商表达【5 ”。然丽 大连理工大学硕士学位论文 m u s a s h i l 和n e s t i n 在中枢神经系统中不总是联合表达。所以也不清楚两种蛋白区分不同 类型的祖细胞。此外，m u s a s h i l 也在星型胶质细胞中有低水平的表达。m u s a s h i l 也不是 中枢神经系统的细胞所特有的，它在d , n n 皮细胞中也有表达1 5 ”。 转录因子是另外一些在神经干细胞中表达的特殊的标志物。s o x 家族的h m g b o x 转录因予在维持神经干细胞多潜能能力方面扮演着重要的角色口。s o x 一1 可能是胚胎干 细胞中最早的神经标志物，它只在神经系统中表达，并且可以标识在神经管内增殖的神 经干细胞池。此外，s o x 一1 在成体的神经细胞和体外培养的多潜能的神经细胞中也有表 达。在那里s 0 1 阳性细胞构成了n e s t i n 阳性细胞的一个亚群。这可以显示出s o x l 较n e s r t i n 在鉴定神经干细胞方面可能更具有特异性。s o x 家族的其他成员如s o x 2 和 s o x 3 等在神经前体细胞中也有表达。 特殊的细胞黏附因子可能也可以鉴定神经干细胞。他们具有一些额外的优势，因为 他们是细胞的表面抗原，所以可以被用于神经干细胞的免疫筛选。但是这要依赖于不同 的培养条件，这种分选已有报导分选出了多潜能的或者大部分的胶质祖细胞。在体内的 s v z 区表达p s a - n c a m 的细胞被认为可以迁移到嗅球并在那里分化成神经元1 2 s 。 l e w i s x ( l e x ) 也被认为是在阶段特异性的胚胎抗原s s e a - 1 或c d l 5 是胚胎多潜能细胞的细 胞表面抗原，并且也在从中枢神经系统获得的神经球内有表达。s v z 区的星型胶质细胞 有一少部分是l e x 阳性细胞，并且研究显示这些s v z 区的星型胶质细胞培养过程中能长 成神经球1 4 4 】，这种细胞被认为是真正的神经干细胞。但是在这些被认为是真正的神经干 细胞中只有1 4 的细胞是l e x 阳性，因此l e x 不能够用来鉴定神经干细胞。另外使用这 一标志物的缺点是这一标志物只在成体小鼠中才有表达，而在大鼠的胚胎的中枢神经系 统的干细胞中却没有特异性的表达。 c d l 3 3 在造血干细胞和祖细胞中有表达，它也被看作是神经干细胞免疫筛选的标志 物。这一标志物也在很多人类组织获得的干细胞中有表达 6 0 l 。它可能在鉴定干细胞的多 潜能性方面有着重要的作用。c d l 3 3 阳性细胞还在非原始的组织细胞中显示出合并和分 化的能力，这样它也可以表现出于细胞的可塑性。各种各样的干细胞表现出来的另一种 特性便是它们能排斥一些染料，如h o e c h s t 3 3 3 4 2 或罗丹明1 2 5 等。在f a c s 检测中干细 不同培养方式长期扩增神经干细胞的比较 魏裘瑗毫枣豹纲熬镩狠窝弱弱茨光表这。染惫裁夔赛 | 霉胃熊蹩由予一秘转岽嚣予a b c 滋 的原因，染色排斥和a b c g 2 的表达都可阻用来鉴定培养中的神经干细胞。 1 4 神经干细胞的分离 基于造盘予缀脆分离翡f a c s 同样可戳掰米分离 孛经千细胞举“。程遴之前我至释牵缀 千细胞的标记是蕊关重要的。对于神经干细胞来讲，在形凑学上很难对其进行区分，而 它的表嚣特异性 莉暑到目前为止还是人们广泛研究的课题，并且还没奇德到令人满意的 终莱。n e s t i n 是人们研究 e 鞍早的一稀 枣经干细胞酶涿涎，另一个窿较鬻雳的神经予绒 胞标记是m u s a s h i 家族。m u s a s h i