（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥雄性不育基因ms1829的定位.pdf

华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 摘要 花药及花粉发育是植物发育生物学的一个重要研究领域，花药及花粉发育异常 会导致雄性不育。很多高等植物中都存在着雄性不育现象，从雄性不育突变体中克 隆相应基因并研究该基因在花药及花粉发育过程中的作用是研究花药及花粉发育分 子机理的一个重要方法。 本研究以模式植物拟南芥的一个雄性不育突变体e m s l 8 - 2 9 为材料，对突变体进 行了形态鉴定、遗传分析和细胞学观察。形态学观察发现该突变体花丝短、花粉粒 异常、果荚短小、不结实，突变体和野生型植株正反交结果表明雌蕊育性正常。遗 传分析表明，e r o s l 8 - 2 9 的不育性状是由单位点隐性基因突变所导致，将此基因命名 为m s l 8 - 2 9 。对野生型拟南芥和e m s l s - 2 9 突变体不同发育时期的花药制作石蜡切片 观察，在花药发育的早期、中期，突变体和野生型的花粉发育和花药结构没有明显 的差异，但在花粉发育的晚期，即花粉成熟期，在突变体中出现了很多畸形的花粉， 而野生型的花粉几乎全部正常。 根据图位克隆的方法，利用f 2 群体将m s l 8 - 2 9 基因定位于第三条染色体分子标记 w d 和m s j 之间大约3 5 0 k b 区间内，但在该区间已经有报道存在一个花粉发育相关 基因a t 3 9 1 5 4 0 0 。为了确定与本研究定位的雄性不育基因是否为同一个基因，用p c r 方法从突变体e m s l 8 - 2 9 中扩增了该基因并测定其序列，测序结果表明该基因中没有 核苷酸发生改变，因j t t m s l s - 2 9 ：f l i 可能是一个引起雄性不育的新基因。目前正在进一 步缩小突变基因的定位区间，从而克隆该基因，并对基因的功能进行研究。本项研 究为克隆m s l 8 - 2 9 基因并对进行其深入的功能分析奠定了基础。 关键词：图位克隆；花药发育；连锁分析；拟南芥；雄性不育 拟南芥雄性不育基因m s l 8 - 2 9 的定位 a b s t r a c t a n t h e ra n dp o l l e nd e v e l o p m e n ti so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta r e a si n p l a n t d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y t h ed e f e c t i v ed e v e l o p m e n to fa n t h e ra n dp o l l e nm a yr e s u l t i n m a l es t e r i l i t y m a n ym a l e - s t e r i l em u t a n t sh a v e b e e ni d e n t i f i e di nm a n yh i g b e rp l a n t s i ti s a l le f f i c i e n ts t r a t e g yt oi n v e s t i g a t et h em o l e c u l a rm e c h a n i s m so fp l a n ta n t h e ra n dp o l l e n d e v e l o p m e n tb yc l o n i n gg e n e sf r o mm a l e s t e r i l em u t a n t sf o l l o w e db yf u n c t i o n a la n a l y s i s i nt h i ss t u d y , a na r a b i d o p s i sm a l es t e r i l em u t a n te m s l 8 - 2 9w a so b t a i n e da n dt h e c o r r e s p o n d i n gg e n ew a sm a p p e d 1 n l ep h e n o t y p ew a sc o n t r o l l e db yar e c e s s i v eg e n ei n s i n g l el o c i , n a m e dm s l 8 2 9 n em u t a n te m s l s - 2 9s h o w ss h o r t e rf i l a m e n t sa n dl e s s m a t u r ep o l l e ng r a i n sc o m p a r e dt ow i l dt y p e a n dt h ef e m a l ef e r t i l i z e ri sn o r m a lb y r e c i p r o c a lc r o s s p a r a f f i ns e c t i o n ss h o wn oo b v i o u sd i f f e r e n ts t r u c t u r e so fa n t h e ra n d p o l l e nw e r eo b s e r v e d ，h o w e v e r ，i nm a t u r ep o l l e np h a g e ，t h e r ea r em a n ys t e r i l ep o l l e n si n m u t a n ta n t h e r sw h i l ea l m o s ta l lp o l l e n sw e 佗n o r m a li nw i l dt y p ea n t h e r m s l 8 - 2 9h a sb e e nm a p p e dt oar e g i o no f7 0 0 k bl o c a t e do nc h r o m o s o m e1 i iu s i n g m a p - b a s e dc l o n i n g ag e n e ，a t 3 9 1 5 4 0 0 ，r e l a t e dt om a l es t e r i l ew a sr e p o r t e d ，a n dn o s e q u e n c ed i f f e r e n c ee x i s t sb e t w e e nt h eg e n ei ne m s l 8 2 9a n dp u b l i cs e q u e n c e a sn o o t h e rm a l es t e r i l eg e n e sh a v e b e e nr e p o r t e di nt h i sr e g i o n ，w eb e l i e v et h a tm s l 8 - 2 9c o u l d b ean e wm a l es t e r i l eg e n e i nt h i sr e g i o n ，m o s to fg e n e sw e r ep r e d i c t e da su n k n o w n p r o t e i n s t h ef u r t h e rw o r kt oi d e n t i f ym s l 8 2 9i sb e i n gu n d e r t a k e n t h em o l e c u l a r c l o n i n ga n d f u r t h e rf u n c t i o n a la n a l y s i sw i l lp r o v i d ef u r t h e ri n s i g l l to fa n t h e rd e v e l o p m e n t k e y w o r d ：m a p b a s e dc l o n i n g ；a n t h e rd e v e l o p m e n t ；l i n k a g ea n a l y s i s ； a s a b i d o p s i st h a l i a n a ；m a l es t e r i l e 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 乏 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均己在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名： 互丹励 时问：洲7 年多月2 0 日 学位论文使用授权书 本入完全了解。华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存汇 编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：互， 幽 导师签名：蔓。l 蔫乙彳壹广 签名日期：研年6 月和日 签名甘期： p 7 年f 月劲甘 注：请将本袁直接装订在学位论文的扉页和目录之闻 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 文献综述 1 1 拟南芥遗传学和分子生物学研究的模式植物 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 是十字花科植物，成熟个体株高约2 5 c m 。由于 个体小，可在很小空间内种植大量植株。拟南芥生命力较强，植株可播种在装有蛭 石、土和珍珠岩的小花盆中，也可种在含培养基的培养皿中，等长到一定时间后再 移入大花盆中，这样也可以更好地控制生长环境，在筛选突变体时可排除环境条件 的影响。拟南芥的结种量很大，单株结实量可达上万粒，非常便于遗传分析和扩增 种子库。拟南芥的生长周期短，播种后2 - 3 天就开始萌发，2 5 天左右抽苔开花，4 5 天左右可以收到第一批成熟的果荚，而全株完全成熟约需两个月时间。相比其它作 物，拟南芥的生长周期是非常短的，也有利于遗传分析。 拟南芥是一种典型的自花授粉植物，因此人工诱变后可以在子二代中直接筛选 变异株的纯合子。同时根据遗传分析需要人工杂交也很容易完成。人工诱变拟南芥 很容易产生大量突变体，这些突变体的获得在揭示植物生长发育规律方面起了非常 重要的作用( m e i n k ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 。诱变的方法有多种，可通过物理( 辐射) 诱变， 化学( 如e m s ) 诱变，以及用t - d n a 和转座子a c d s 等系统产生插入突变体，这 些不同方法得到的突变体为基因克隆和结构与功能的研究创造了有利条件。 拟南芥是基因组最小的植物之一，其单倍体基因组只有1 3 0 m b 左右。基因组中 高度重复、中度重复及低度重复d n a 的比例较低，其中高度重复顺序只占 1 0 一1 5 ，中度重复只占7 5 左右，低度重复顺序只占1 左右，而余下的近8 0 的d n a 基本上是单拷贝的结构基因( 王年等，2 0 0 1 ；k a u le ta 1 。2 0 0 0 ) 。这一特点对 分子生物学家来说，意味着可以比较容易地克隆和研究感兴趣的基因，特别是有关 植物生长和发育的基因。由于在基因组中编码某一具特定功能产物的基因拷贝只有 1 个，如果其中某个基因的产物参与了植物个体形态发育过程，当该基因变异时， 丧失的功能得不到额外拷贝基因的补偿，就会导致很显著的植物个体形态变异，这 也是为什么在人工诱变拟南芥种子后，可以获得大量形态各异，种类各别的和涉及 植物发育各个过程的突变体的原因。这些突变株为研究各基因在植物发育中的功能 及其调节提供了良好的材料，因此拟南芥也被称为植物界研究的“果蝇”( 毛健民等， 2 0 0 1 ) 。 植物生长发育的信息及与环境相互作用的信息都是由它的基因组来编码的，为 了全面的了解植物，我们需要读懂它们的这些遗传信息。在1 9 世纪8 0 年代，研究 的重点是棉花，花生，大豆等经济作物，通过对这些作物的研究以期对植物的基础 原理进行全面的了解，但通过这些植物彻底全面的了解植物的生理及发育机理，困 难非常大，转向于一种模式植物的研究则可能成为一种捷径。 拟南芥雄性不育基因m s l 8 2 9 的定位 拟南芥虽然不具有直接的经济价值，但由于其具有一些独特的生物学、遗传学 特性，而成为植物分子遗传学研究中最受欢迎的模式植物，研究拟南芥的各种基因， 了解其发育过程中或在某种环境条件下基因的表达、调控，有助于进一步了解其它 植物，并有助于在理论上揭示物种的进化，而受到基础理论科学家的青睐。选用拟 南芥作模式材料并从中克隆与性状发育有关的基因，然后再应用到其它植物中去， 这样比在其它植物中进行研究更容易、更直接。同时可能将拟南芥基因组中与光合 作用、呼吸代谢、贮藏物质合成、器官形态建成、干物质积累、抗病抗逆等有关的 基因逐一分离出来，再通过转基因技术转入到主要的农作物和经济植物中，从而获 德巨大的经济效益。这样就可以通过拟南芥中相应基因的研究来了解其它植物中重 要基因的功能。拟南芥作为模式植物为全世界的植物科学家提供更多的信息，也加 速了植物界的研究( 刘慧娟，2 0 0 5 ) 。 拟南芥基因组全序列测定完成后，在拟南芥基因组中大约有2 5 0 0 0 个基因，其 中只有很少的一部分基因知道了功能，大部分基因的功能还是未知的( a r a b i d o p s i s g e n o m ei n i t i a t i v e , 2 0 0 0 ) 。近年来，随着植物发育基因克隆技术的不断发展，将有越 来越多的拟南芥发育基因被克隆。 1 2 花药发育 1 2 1 花器官的结构 花是植物的主要生殖器官，主要由四个部分组成：花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊。 雄蕊是花中的重要组成部分，显花植物中的雄性生殖过程是在雄蕊中发生的( e s a ue t a 1 。1 9 7 7 ；b e d i n g c re ta 1 ，1 9 9 2 ) 。这一过程包括二倍体的细胞经减数分裂形成单倍体 的雄配子即小孢子，小孢子经有丝分裂形成多核的含精细胞的花粉粒。 雄蕊是由花丝与花药两部分组成的，花丝是中空的管状结构，将雄蕊和花托连 接在一起，具有运输水分与营养物质的功能。花药是雄蕊中最重要的组成部分，含有 与花粉粒形成及释放相关的生殖与非生殖组织，从而保证传粉与受精过程的顺利完 成。 1 2 2 拟南芥花药的发育过程 对于模式植物拟南芥已经详细研究了花药的形态发生，可分为1 5 个时期 ( s t a g e ) 。每一个时期都有详尽的描述和重要的细胞学特征为标志( 表1 ) ( s a n d o r s e t a 1 ，1 9 9 9 ) 。烟草的花药发育包括两个阶段( p h a s c i 和p h a s e l i ) ( 见图1 ) ( g o l d b c r g e ta 1 ，1 9 9 3 ) ，相1 ( p h a s e d 包括( 7 ) 至( 1 ) 期( s t a g e ) ，主要发生雄蕊原基细胞 的决定、组织分化及减数分裂和小孢子产生，完成前期发育的花药含有很多特化的 细胞和组织，包括位于花粉囊中央的小孢子四分体。相2 包括1 至1 2 期，主要涉及 花粉粒的发育，花药膨大并通过花丝的伸长将花药推到适当的高度以协助授粉及花 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 药开裂等。花药形成和花粉释放受严格的时间调控。近几年对花粉发育的研究，在 分子和细胞水平上都有很大的突破( g a s s e re ta 1 ，1 9 9 1 ；m c c o r m i c ke ta 1 ，1 9 9 1 ；d a w e a n df r e e l i n g1 9 9 2 ；a a r t sc ta 1 ，1 9 9 3 ；p r e u s se ta 1 ，1 9 9 3 ；g o l d b c r ge ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 图1 花药发育过程 f i g u r e lag e n e r a l i z e do v e r v i e wo fa n t h e rd e v e l o p m e n t 一般认为在拟南芥花药发育中有四个比较明显的阶段：第一个阶段( p h a s e d 是在花药原基中进行细胞分裂从而形成花药全部组织，雄蕊原基中l 1 、l 2 和” 层细胞决定、分解，孢子细胞分化为初级母细胞与初级造孢细胞，进一步分化为二 级母细胞。此时花药呈四角形，维管束细胞开始分化；第二个阶段( p h a s e l l ) 花药 形态建成，绒毡层细胞显现出典型分泌细胞的形态，小孢子母细胞经过减数分裂形 成了含有单倍体小孢子的四分体，随后胼质层壁破裂，小孢子从四分体中释放出来 ( 见图2 ，s t a g e 6 8 ) ；第三个阶段( p h a s e l i i ) 主要是小孢子发育成含有三细胞的花 粉粒，花药增大，该过程涉及绒毡层降解和药隔的分化与降解( 见图3 ，s t a g e9 - 1 2 ) ； 第四个阶段( p h a s e w ) 是成熟花粉的释放，主要涉及花丝延伸，花药开裂、孔开裂 等，此时隔膜退化形成了含有两个室的花药，裂口的细胞死亡，花粉粒从药室中释 放了出来，完成了整个花药发育过程( 见图3 ，s t a g e1 3 1 4 ) 。 3 拟南芥雄性不育基因m s l 8 - 2 9 的定位 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 3 雄性不育 1 3 1 雄性不育的概念 所谓植物雄性不育( m a l es t e r i l i t y ) 是指植物体中雄蕊由于受到某些内、外因素 的影响而发育不正常，不能产生正常功能的雄配子花粉，但这些因素对雌蕊发 育的影响很小或无影响，雌蕊能正常发育和受精，这种不育现象在植物界是很普遍 的。据报道，已经在4 3 个科1 6 2 个属6 1 7 个物种中发现雄性不育( 陈明等，2 0 0 3 ) 。 图2 拟南芥花药发育的前8 个时期( s a n d e r se ta 1 1 9 9 9 ) f i g u r e 2p r i o re i g h ta n t h e rd e v e l o p m e n t a lp h a g e si na r a b i d o p s i s ( s a n d e r se ta 1 ，1 9 9 9 ) 植物雄性不育分为遗传性不育和非遗传性不育。遗传的雄性不育现象是由染色 体和基因控制，也有的是基因与环境互作的结果，可以通过亲代到子代一代代遗传 下去。不遗传的雄性不育是由不良环境造成的，如高温、低温、干旱、冻害、营养 拟南芥雄性不育基因m s l 8 2 9 的定位 不良等使植株的某种功能失调而造成雄性不育，这种不育特性不能代代相传。根据 它们的作用机理可把雄性不育分为细胞核雄性不育( n m s ) 、细胞质雄性不育( c m s ) 和生理不育。核不育主要是受核基因控制的，又可分为隐性单基因雄性不育、隐性 多基因雄性不育和显性单基因雄性不育三种类型。胞质不育是指自然界存在一些特 殊的不育细胞质，当核基因组缺乏抑制其表型的恢复基因时，植株表现为雄性不育， 反之，在存在恢复基因的核背景下则雄性可育，即c m s 是细胞质基因和核基因互作 的结果。生理型雄性不育主要是由环境条件、物理的或化学方法诱导的不育( 刘慧 娟2 0 0 5 ) 。 图3 拟南芥花药发育的第9 - 1 4 期( s a n d e r se ta 1 1 9 9 9 ) f i g u r e 29 t h - 1 4 t ha n t h e rd e v e l o p m e n t a lp h a g e si na r a b i d o p s i s ( s a n d e r se ta i ，1 9 9 9 ) 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 3 2 植物雄性不育产生的原因 雄性不育主要是植物雄性器官异常，其产生原因为( 王咏星等，2 0 0 2 ) ： ( 1 ) 雄蕊发育受抑制 在有花植物中，雄蕊和雌蕊都有向两性发育的可能性，只是在发育过程中一种 性别的发育受到了抑制，而使另一种性别发育，这种性别抑制是受遗传控制的，环 境条件可以对其表达程度产生影响。研究发现，在核基因组和胞质基因组中都有性 别抑制基因。这种突变体无花药产生，雄蕊常变成花瓣状或花药顶端变成柱头状。 ( 2 ) 小孢子囊发育不正常 这种雄性不育在许多雌雄同株或同花的植物中发现，并己证明是受核内单隐性 突变基因支配的，其反应规范受环境的影响较大。这种突变表现为花药组织在其分 化早期退化，形成微小而退化的雄蕊或进一步发育成瘤状物。 ( 3 ) 孢子体形成不正常 这种突变在番茄，香豌豆等植物中均有发现，并且证明是由遗传控制的。其发 生的原因是孢原细胞分化不正常，引起花药壁和造孢细胞发育不正常，因而不能形 成正常的孢子体。 ( 4 ) 小孢子体形成不正常 这种类型的雄性不育最为广泛，在许多植物中都有发现。这些突变有的是受核 基因控制的，有的是受核基因和质基因共同控制的。这种突变发生在从减数分裂到 小孢子形成的整个过程。主要表现为：减数分裂被花粉母细胞的有丝分裂所代替； 细胞质分裂受到抑制；减数分裂启动延迟或失去了同步性。 ( 5 ) 小孢子的成熟受阻 这种情况一般都是由核基因与质基因相互作用决定的。表现为由于缺少花药壁 的形成，四分孢子形成后不分开，最终使小孢子退化，或是绒毡层过早的退化，释 放出油状小液滴或周缘原团，使之形成互相粘连的花粉粒。 ( 6 ) 成熟花粉粒死亡 在一些植物中，花粉粒形成的过程未发现任何不正常的表现，但花粉粒成熟后 很快死亡，这种突变受核基因控制，其原因尚不清楚。 ( 7 ) 花药不开裂 这种突变一般是受多个核基因控制的，往往有正常的花粉形成，但花药不能开 裂，或花药顶端缺乏散粉孔，这种雄性不育通常称为功能性雄性不育突变。 7 拟南芥雄性不育基因m s l 8 - 2 9 的定位 1 3 3 植物雄性不育基因 在花药发育过程中有大量的基因表达，据估计仅特异性表达的基因就有3 5 0 0 个 左右( s a n d e r sc ta 1 ，1 9 9 9 ) ，而其中6 0 1 0 0 个基因为花粉发育所必需的，其中任何 一个基因的突变都会导致雄性不育( w i l s o ne ta 1 。2 0 0 1 ) 。 根据目前拟南芥中克隆的雄性不育基因情况( 表2 ) ，这些基因按照功能大体上 可以分为以下三类：第一类，与茉莉酮酸合成有关。茉莉酮酸是植物体内广泛存在 的一类生长调节物质，与花药开裂、果实成熟、根的生长以及植物对昆虫和病原体 的抵抗有关( c r e e l m a ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 。而以，f a d 7 及而棚三个基因一起突变( m c c o n n e ta 1 ，1 9 9 6 ) ，以及d a d l 基因( i s h i g u r oe ta 1 ，2 0 0 1 ) ，o p r 3 d d e l 基因( s a n d e r se t a 1 ，2 0 0 0 ；s t i n t ze ta 1 i ，2 0 0 0 ) ，a o s 基因( p a r ke ta 1 ，2 0 0 2 ) 的突变都会引起拟南芥植 株花药开裂推迟而导致雄性不育。当用茉莉酮酸( j a s m o n i ca c i d ) 处理这些雄性不育 突变体时，这些突变体又恢复育性。通过这些突变体及其相应基因的克隆，阐明了 拟南芥体内茉莉酮酸这一植物重要的信号分子在体内的合成途径。 表2 拟南芥中的雄性不育基因 t a b l e 2s o m em a l es t e r i l eg e n e si na r a b i d o p s i s b 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第二类雄性不育基因与转录因子相关。m s l 突变体是最早见于文献报道的拟南 芥雄性不育突变体。m s i 基因( a t 5 9 2 2 2 6 0 ) 的克隆及序列分析表明，该基因具有 p h d f i n g e r 结构域( p h d f m g e rm o t i f ) 。在许多生物体中都发现具有p h d f i n g e r 结 构域的蛋白( y a n g e ta 1 ，2 0 0 3 ) ，尽管他们的作用不同，但都参与转录调节作用，因 此推测m s l 基因在花药发育过程中起转录调节作用( w i l s o ne ta 1 ，2 0 0 1 ) ，而m s 5 s p l 基因( a t 4 9 2 0 9 0 0 ) 编码的蛋白质与具有m a d s 盒( m a d sb o x ) 的转录因子相关( y a n g c ta 1 ，1 9 9 9 ；g i o v e re ta 1 ，1 9 9 8 ；s c h i e f t h a l e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。a t m y b 2 6 是一类r 2 r 3 m y b 型转录因子，其所调节的下游与花药的开裂相关( s a b i n ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。这些结果表 明小孢子发育过程中转录调节作用基因的突变会导致雄性不育。 第三类雄性不育基因与花粉形成过程中减数分裂相关，所克隆的基因包括s y n l ( b a ie ta 1 ，1 9 9 9 ) ，a s k i ( y a n ge ta 1 ，1 9 9 9 ) 及 | 墨协l l e n l e s s 3 ( g l o v e re ta 1 。1 9 9 8 ； s a n d e r se ta 1 ，1 9 9 9 ) 。除这三类雄性不育基因外，还有其他一些雄性不育基因如e m s l ( a t 5 9 0 7 2 8 0 ) 基因编码l r r r p k ( 1 e a c i n e r i c hr e p e a tr e c e p t o rp r o t e i nk i n a s e ) 。e m s l 突变体中，产生大量的小孢子母细胞，而缺少绒毡层细胞，表明该基因参与控制花 药中体细胞和生殖细胞的分化( z h a oe ta 1 2 0 0 2 ) 。 正铭基因控制花粉壁的形成，该 基因的突变可能导致花粉和柱头不能识别而不育( a a r t se ta 1 1 9 9 3 ) 。 雄性不育对植株本身来说是一种不利性状，但在自然界中也是植物在进化过程 中一种生存的方式。一种植株自身雄性不育，而它的雌性是正常的，只有接受外来 花粉，才能受精结实，产生杂种，杂种在生长势和适应性方面具有强大优势，人们 利用这一现象提高农作物的产量、质量和抗性。植物雄性不育是植物杂种优势利用 的工具，具有重要的生产利用价值。 植物雄性不育特性既有核基因控制，又有核外细胞质基因控制，表现为核质互 作的遗传现象，因此，雄性不育是研究植物的线粒体遗传、叶绿体遗传和核质互作 遗传现象的极好材料，可以把性状遗传、细胞遗传和分子遗传相结合进行研究，同 时雄性不育与育性基因的表达有密切关系，可以利用其突变体进行植物发育生物学 研究和育性基因的表达调控研究，因此植物雄性不育研究是近年来植物遗传学研究 的一个热点( 朱英国等，2 0 0 0 ) 。 9 拟南芥雄性不育基因m 5 1 8 2 9 的定位 1 4 图位克隆的研究进展 1 4 1 图位克隆的原理 图位克隆( m a p b a s e dc l o n i n g ) 首先在1 9 8 6 年由剑桥大学a l a nc o u l s o n 提出， 是一种依据突变表型进行遗传分析的正向遗传学基因克隆方法。其基本原理是功能 基因在基因组中都有较稳定的基因座，通过寻找与突变性状相连锁的已知物理位置 的分子标记来进行基因定位，即通过确定突变体表型与基因组d n a 序列的分子标 记间的连锁关系，将未知的基因定位于物理位置己知的分子标记附近，最终确定未 知基因在基因组d n a 上的很小的已知区间中，分析该区间中所有基因，找出可能 的基因并进行克隆和鉴定。用该方法分离基因无需预先知道基因的d n a 序列，也 无需预先知道其表达产物的有关信息。近些年以图位方法克隆基因已取得诸多成果， 数十个与农业生产密切相关的作物基因已被成功的克隆( m o n n ac ta 1 ，1 9 9 7 ；s i m o n s e ta 1 ，1 9 9 7 ；g r a n te ta 1 ，1 9 9 5 ；l a h a y ec ta 1 ，1 9 9 8 ；k o n c ze ta 1 ，1 9 9 2 ) ，这对理解具有重 要农艺性状的基因功能发挥了重要作用。而随着拟南芥基因组测序工作的完成，各 种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努 力已经大大减少了。 目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。在这个过程中，我们 从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。这和反向遗传学的方法正好相反。 图位克隆能实现，关键在于全基因组测序计划的完成和各种分子标记的发现。这些 数据被储存在专门的数据库中( 表3 ) ( l u k o w i t ze ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 表3 拟南芥网络资源 t a b l e3t h e a r a b i d o p s i si n t e r n e tr e s o u r c e 网站网址 s u p p l e m e n t a lm a t e r i a lf o rt h i sp a p e rh t t p ：c a r n e g i e d p b s t a n f o r d e d 恤t h o d s p p s u p p l h t m l n o n g h a m s t o c kc e n t r e ( u k ) h t t p ：n a s c n o t t a e u k r e c o m b m ti n b r e dm a p h n p ：h a s t 。n o l l ，a c u k n e w _ r i _ m a p h t t r d o h i os t o c kc e n t e r ( u s a ) h t t p ：a i m s c p s n l s i l e d u a i m s t a i rd a t a b a s e h o m e p a g e h t t ) ：a v w w a r a b i d o p s i s o r g r e c o m b i n a n ti n b m dm a p ( m i r r o rs i t e ) h t t ：a c w w a r a b i d o p s i s o r g ，c g i b i n m a p s r i i n t m m a p c a p sm a r k e r s h t t ) ：w w w a r a b i d o p s i s o r g a b o u t c a p s h t m s e q u e n c et a b l e h t tj ：w w w a r a b i d o p s i s o r g c g i - b i n ，m a p s s e q t a b l e ，p l s n pc o l l e c t i o n h i t ：a v w w a r a b i d o p s i s o r g s n p s h t m l c e r e o nc o l l e c t i o no fp o l y m o r p h i s m h t t 。：w w w a r a b i d o p s i s o r g c e g e o n ! ! 坚婴坚! ! 堡 ! ! p ；i 丝! ! 巴! ：! i ! ：! 匹! ! ：! ! 堕兰! 上垫鱼堕! 坚：! ! 型 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 t i g r ，g e n o m ea n n o t a f i o m d a 纽b a s eo f l e rs c q u e n o k a s u z ad n ar e 辩a r c hi n s t i t u t e ， m i p sg e n o m ea n n o t a t i o n s h t i p 洲w w w i g r o r g t d b a t 删s i n d e x h t m l h t t p ：w w w t i g r o r g t d b a t g e n o m e l e r h t m l h t t p ：w w w k a z u s a o r j p k a o s h t t p ：w e b s w n l i p s b i o c h e m m p g d e p r o j t h a i s i n sd a t a b a s eo ft r a n s p o s o ni n s e r t i o n s h t t p ：a v w w j i c b b s r c a c u k s a i n s b u r y - l a b m e h t m 1 4 2c o l l e r 的多态- 性及检测 在拟南芥中的图位克隆，在很大程度上得益于对c o l 生态型测序的完成，因为 它是在研究拟南芥时最常用的生态型。 实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。实质上，分子标记 是一个特异的d n a 片段或能够检出的等位基因，对其有效地利用即可达到图位克隆 基因之目的。迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选( w a n g e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 其中最为常用的是简单序列长度多态性( s s l p s ) ( l u k o w i t z e ta 1 ，2 0 0 0 ： c h o ee ta 1 ， 2 0 0 2 ；g o n z a l e z g u z m a ne ta 1 ，2 l x r 2 ) ，和单核苷酸多态性( s n p s ) ( r a f a l s k ie ta 1 ，2 0 0 2 ) 以及插入删除( 1 n d e l s ) 。 s s l f 是基于p c r 的分子标记，在拟南芥基因组中有较多分布，而且是共显性的， 它的检测非常直接，但是我们需要设计引物来检测假定的s s l p 标记；对s n p s 标记的 检测也比较直接，它是拟南芥不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差别，这些差 别的核苷酸通常位于不编码区域( p e t e r se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。最常见的用于检测s n f s 标记 的方法主要是剪切扩增多态性序列( c a p s ) ，它也是基于p c r 的。另外，一种更为 有效的方法衍生的c a p s ( d c a p s ) ( n a m c ta l ，1 9 8 9 ；m i c h a e l sa n da m a s i n o ，1 9 9 8 ) 可 把任何已知的点突变作为分子标记，只要在p c r 是引入不配对的引物，使扩增的序 列在一个生态型中具有限制性酶切位点，而在另一生态型中没有，以形成多态性。 i n d e l s 是指一生态型相对于另一个生态型具有一个或几个核苷酸的插入或删除的差 异。 在拟南芥中，对有1 5 0 1 个b a c s 克隆共1 2 3 m b p 的c o l 全基因组序列同l e t 序 列进行了比较，共鉴定出5 6 ，6 7 0 个多态性位点，其中有3 7 ，3 4 4 个s n p s ，1 8 ，5 7 9 个 小i n d e l s ( 小于或等于1 0 0 b p ) ，7 4 7 个大的i n d e l s ( 大于1 0 0 b p ) 。平均每3 3 k b 有 一个s n p ，每6 6 k b 有一个l n d e l 。这两类多态性位点遍布基因组，在每个b a c 中 都有很多这样的多态性位点用于遗传作图，可以通过网页获得拟南芥多态性数据 库。在i n d e l s 中长度变化范围多数为1 - 3 8 k b ，平均大小为1 7 5 b p 。虽然大约1 0 的 i n d e l s 同s s l p 有关，但是多数i n d e l s 是非重复序列。9 3 的i n d c l s 小于1 0 0 b p ， 适合于用p c r 电泳为基础的方法进行检测。从目前的检测技术来看，几乎全部s n p s 和i n d e l s 均可转变为分子标记，因此在拟南芥中用图位克隆所需的高密度的分子标 记不再是限制因素。 拟南芥雄性不育摹因m s l 8 - 2 9 的定位 1 4 3 图位克隆技术流程 因为有了拟南芥的基因组序列和高密度的遗传标记，图位克隆过程就变得相对 直接。图4 例举了一种高效的拟南芥图位克隆方法。从基于c o l 和l e t 遗传背景的 突变体出发，有可能在大约一年时间内找出与这个突变相关的基因，这其中主要耗 时间的是五个植物( 拟南芥) 的生长周期( 我们假定每个周期为两个月) 。 图位克隆分离植物基因的技术流程基本上可以分为以下几步( g e o r g e ta 1 ，2 0 0 2 ； j a n n y c ta 1 ，2 0 0 3 ；w o l 龟a n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) ： ( 1 ) 将突变体与另一种生态型进行杂交，收获f l 代。f l 代种下，进行表型与基 因型的分析。根据f 1 代中出现的表型或缺失的表型可以判定突变体是显性或是隐性 突变体。 ( 2 ) 突变体群体的建立。为了将某一基因进行定位和精确的作图，需要建立起较大 的f 2 代遗传群体。以这些材料的叶子或其他器官的d n a 为模板进行基因型分析， 利用5 条染色体中的2 0 个分子标记，其平均遗传距离为2 0 c m 。根据三点杂交的 原理可以把基因与某一分子标记连锁起来，并定位于2 0 c m 的区间内。当这一2 0 c m 区间定位后，进一步寻找分子标记把这一区间缩小到4 c m 左右。1 5 0 个植物材料就 可以保证把基因定位于4 c m 的区间。 删蝴 f l 辟。瞒 删蚴 蚺渤 潮f ，h “q 鳓 炉蝴1 5 0 略口吩0 v 0 0 t 站f 髀“糖 娃f 。口眺 蝴哟n 叼 讲雠y p 。f j 。目b d 轴r 诵7 口3 + 等雠睡 由删女舻 ekf f ；i n 事瞄钟侧吣蝴g l i 二i i - l h ，徽_ 删| 。扩i t e4e m 镕醴o t j i i ；li ；! i 妇罐4 黼弦铂目”1 2 吃 糍耄一 鬻背黜一 4 0 协，e 蟠j 蜘 娜蛔a n 掣“簟 删| 。i | ? = ： 图4 图位克隆过程示意图( j a n d e re ta 1 。2 0 0 2 ) f i g u r e 4 t h e p r o c e s s o f m a p b a s e dc l o n i n g ( j a n d e r e t a l ，2 0 0 2 ) ( 3 ) 通过候选基因克隆的序列与已知的基因序列的同源性比较，以推断其功能。 ( 4 ) 筛选突变体库，比较候选基因序列在野生型和突变体植株之间的序列差异。 1 2 |；执；甜l；d燃 o孵鳇： 孵i i 州辨 x l -_-。-ko， 叫 口iil馈ii njii 兰蒜 ，一23一一5一一7一i一一一一住 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 ( 5 ) 进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预 期的表型变化。功能互补实验是最直接、最终鉴定基因的方法。利用新兴的r n a 干扰( r n a i ) 也可有效地确定目的基因。 1 5 本研究的目的与意义 随着人类基因组计划、拟南芥基因组计划及水稻基因组计划的完成，科学研究 进入后基因组时代。全基因组测序的完成为我们打开了生命的篇章，而如此庞大的 核苷酸序列代表什么? 具有怎样的作用? 一系列的问题值得去探讨、研究。 雄性不育是高等植物生命活动中的一个普遍现象，与雄蕊、花药和花粉的发育 密切相关。在这一生命现象中大约有3 5 0 0 个特异的基因参与( s a n d e r se ta 1 1 9 9 9 ) ， 但是这些基因怎样起作用? 它们之间存在着怎样的相互作用? 以及植物中花粉发 育是怎样发生的等等一系列问题还不清楚。雄性不育基因的克隆有利于人们对这些 组织和器官发育进行深入研究，花药发育的研究对于理解植物个体发育的各个方面 都有重要借鉴意义。近年来，花药发育研究所取得的进展得益于模式植物遗传学的 发展，特别是拟南芥花药发育突变体的分离鉴定，此外，随着分子生物学的发展， 克隆了很多花药特异表达基因，不仅对花药发育的理解提供线索，也为利用反向遗 传学研究花药发育提供必不可少的背景资料。雄性不育又是生产上杂交育种的基 础，因此雄性不育现象的研究及不育基因的克隆既具有理论意义，又有潜在的应用 价值。 本研究以模式植物拟南芥的一个雄性不育突变体e m s l 8 - 2 9 为材料，对突变体 进行了遗传分析、细胞学观察，在其全基因