基于可视化蛋白芯片的抗体分析方法研究.doc

基于可视化蛋白芯片的抗体分析方法研究 作者：于辙, 刘志红, 吴英松, 高建恩, 孙启鸿, 李明, 印莉萍, 许丹科【摘要】 目的: 建立一种基于蛋白芯片技术的抗体分析新方法。方法: 将待分析的抗体制备成抗体芯片, 并与生物素标记的抗原反应, 然后经银增强法显色, 获得可直接观察的微阵列芯片可视化反应结果。结果: 实验中分析了10种18株抗体的活性和特异性的强弱, 其中6株抗体具有较强的特异性。其中, C013、 HPSB007、 HPSB007分别对球蛋白和白蛋白的最低检测浓度可达0.4 g/L。结论: 该方法具有通量化前景, 且具有微量化、 操作简便快捷和结果可视化等特点。 【关键词】 抗体芯片 银增强显色法 抗体检测Abstract AIM: To establish a novel method for antibody analysis based on visual protein microarray. METHODS: The antibodies spotted on the aldehydemodified slides were incubated with corresponding antigens labeled by biotin, followed by silver enhancement detection method, and the chromogenic images were scanned by CCD camera. RESULTS: The affinity and specificity of each antibody was assayed by this method and six antibodies were found to have higher specificity than the others. A detection limit of 0.4 g/L was obtained for antiglobulinC013, antialbumin HPSB007, and antialbumin HPSB007. CONCLUSION: This method is simple, fast and visual. In addition, it needs less sample amount than traditional immunoassay and has potential to achieve high throughput.Keywordsantibody array; silver enhancement detection; antibody assay抗体是蛋白质研究的重要工具之一, 目前在抗体筛选中主要是依赖于传统的ELISA方法1-3。近年来, 在抗体筛选过程中已有引入蛋白芯片技术的报道, de Wildt等4用带有抗体基因的高密度细菌阵列筛选重组抗体, 何为等5制备抗体芯片筛选不同株的抗白蛋白、 抗球蛋白, De Masi6和Love7等在高通量的单克隆抗体（mAb）制备与筛选中引进了通量化的抗原芯片系统, 进行克隆抗体的筛选。 本研究中采用蛋白芯片技术并结合银增强检测方法, 初步建立了基于抗体芯片技术的抗体活性和特异性的可视化分析, 实验对10种18株抗体的活性和特异性强弱及检测限作了相应研究, 获得了初步满意的结果。1 材料和方法1.1 材料 八针手动芯片点样仪(VP478, 美国V&P Scientific公司), CCD芯片扫描仪（美国Photometrix公司）, 微量透析器、 透析器用超滤膜（1 kD）（美国Sigma公司）, GenePixTM Pro3.0芯片图象分析软件,醛基化玻片(美国CEL Associates公司), 牛血清白蛋白（BSA）、 生物素琥珀酰亚胺酯、 胶体金标记链亲和素、 银增强试剂A、 B(美国Sigma公司), 鼠IgG（华美生物工程公司）, 10种抗原及18株抗体为南方医科大学生物技术学院和北京蛋白质组研究中心抗体工程实验室提供, 其他试剂为国产分析纯试剂。1.2 方法1.2.1 标记抗原 抗原用PBS(pH7.4)稀释成0.5 g/L, 再与10 g/L生物素琥珀酰亚胺酯室温条件下作用4 h, 1 mol/L NH4Cl终止反应, 将反应液加入微量透析器, PBS(pH7.4)缓冲液中透析过夜, 得到的溶液-20条件下保存。1.2.2 抗体芯片制备 小型八针手动点样仪将抗体点到醛基化玻片, 通过抗体上的氨基与玻片表面的醛基反应实现样品的固定。将待测抗体（10种18株）分别用PBS(pH7.4)稀释成0.5 g/L, 同时鼠IgG与生物素标记的鼠IgG分别作阴性与阳性对照, 制备成抗体芯片, 点样示意图见图1(A)。制备好的抗体芯片4条件下保存备用。1.2.3 抗体芯片的反应与检测 0.5 mL/L Tween 20的PBS（pH7.4）缓冲液作洗液, 清洗制备好的抗体芯片3次。加入10 g/L BSA作封闭液, 室温条件作用45 min, 用洗液清洗芯片3次。以1 g/L BSA溶液稀释生物素标记抗原至一定浓度, 取120 L加入至抗体芯片。室温孵育1.5 h后, 用洗液清洗芯片3次, 并与胶体金标记链亲和素室温作用1 h, 用洗液清洗芯片后加入银增强试剂A、 B混合液, 显色20 min, 去离子水冲洗芯片, 终止显色。1.2.4 统计学处理 采用GenePixTMPro3.0软件提取数据, 数据处理用灰度值进行比较。2 结果2.1 抗体活性的测定 将固定有10种18株抗体的芯片分别与10种生物素标记的抗原（即生物素标记的巨球蛋白、 触球蛋白、 IgM、 白蛋白、 球蛋白、 铜蓝蛋白、 胰蛋白酶、 IgA、 血红蛋白和纤维蛋白）反应, 并经胶体金和银增强法显色, 抗体芯片经CCD芯片扫描仪检测可获得相关图像, 实验重复3次。图1(B、 C)为抗体芯片与281.3 g/L浓度的巨球蛋白、 触球蛋白的反应结果。从图1（B）中可以看出, 抗体芯片上的抗巨球蛋白S1pgA007与巨球蛋白有较强结合反应, 而其他抗体则基本无阳性信号; 图1（C）中为抗触球蛋白S1pgA012、 抗触球蛋白S1pgA012、 抗触球蛋白050110与触球蛋白的反应结果, 说明了3株抗体均有较强结合力。图1 抗体芯片点样示意图与281.3 g/L巨球蛋白、 触球蛋白同抗体芯片的反应结果图（略）Fig 1 The sketch map of antibody array and results of 281.3 g/L MG and Hp reacted with antibody arraysA2, R2: Mouse IgG, negative control; B2: AntiMG S1pgA007; C2: AntiHp S1pgA012; D2: AntiHp S1pgA012; E2: AntiHp 050110; F2: AntiIgM S1pgA014; G2: AntiIgM S1pg6B3; H2: AntiAL HPSB007; I2: AntiAL HPSB007; J2: AntiGlob C013; K2: AntiCP HPSB014; L2: AntiCP S2B010; M2: AntiCP S2B014; N2: AntiCP DFH03; O2: AntiTPS S1pgA032; P2: AntiIgA HPS3C008; Q2: AntiIgA S1pgA010; S2: AntiHB 050110; T2: AntiFIB AFG072. U2: Mouse IgG labeled by biotin, positive control.为了进一步考察各株抗体对应相应抗原的检测限, 实验中首先计算了各个抗体的灰度阈值, 灰度阈值=(G阴性/G阳性)+2SD100。采用了不同稀释浓度的抗原与抗体芯片进行反应, 并将测定结果与灰度阈值相比较, 得出各种抗体检测抗原的检测限结果, 其中球蛋白的检测限可达0.44 g/L, 白蛋白可检测到0.45 g/L, 3株触球蛋白抗体均能检测到4.4 g/L浓度的触球蛋白, 上述抗体反映出较强的亲和力。而其他的抗体对抗原的检测限相对偏高, 抗巨球S1pgA007、 抗IgM S1pgA014均检测到17.6 g/L的相应抗原; 抗IgA S1pgA010、 抗IgA HPS3C008分别检测到17.6 g/L、 70.3 g/L的IgA; 铜蓝蛋白的检测限仅为112.5 g/L, 胰蛋白酶的检测限为140.7 g/L, 血红蛋白与纤维蛋白的检测限均为450 g/L; 抗IgMS1pg6B3只能检测到1.13 g/L的IgM, 说明了它们较弱的亲和性。2.2 抗体的特异性 特异性是评价抗体的重要指标之一, 抗体芯片同生物素标记的抗原反应可以直接检测出抗体的特异性。18株抗体中, 抗巨球S1pgA007、 抗IgMS1pg6B3、 抗球蛋白C013、 抗铜蓝蛋白HPSB014、 抗铜蓝S2B010和抗胰蛋白酶S1pgA0326株抗体特异性强, 与无关抗原没有交叉性, 而其他12株抗体特异性弱, 与相应的抗原及无关抗原均有非特异性反应。3 讨论 与传统ELISA方法相比, 蛋白芯片具有一次实验就能完成对多个分析物检测的特点, 本研究中建立了一种以蛋白芯片技术直接分析适用于制备抗体芯片的抗体方法。将手动式小型点样仪与可视化检测方法相结合, 操作简单, 成本低, 实验中的CCD芯片扫描仪也可用平板扫描仪代替, 适合于一般实验室中的日常需要。且样品用量少, 并可以同时考察多个抗体的相关特异性, 因此蛋白芯片已经成为一项通量化免疫分析的新技术。相比于通常的荧光检测方法, 本实验中采用银增强显色检测技术8, 9, 其原理是利用胶体金催化银离子在还原剂的存在下还原成银原子, 形成可见的黑色沉淀。采用上述方法, 本实验以10种肝脏相关蛋白抗