（病原生物学专业论文）抗华支睾吸虫成虫抗原mcab的制备及其功能的研究.pdf

徐州医学院硕士学位论文 缩略词 b s a c a 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文全称 b o v i n e s e r u ma l b u m i n a n t i g e no f c l o n o r c h i ss i n e n s i s d m s o d e m e t h y ls u l f o x i d e e l i s a e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e ma s s a y f p l cf a s tp r o t e i nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h e p e s h y d r o x y e t h y lp i p e r a z i n ee t h a n e s u l f o n i c 脚 h t i g g m c a b n c o d p a g e p b s p e g h i 冲 s d s 瞄s t b s t m b 中文全称 牛血清白蛋白 华支睾吸虫抗原 二甲基亚砜 酶联免疫吸附试验 快速蛋白液相色谱 羟乙基哌嗪乙磺酸 h y p o x a n t h i n e - a m i n o p t e r i n t h y m i d i n e次黄嘌呤氨基喋吟胸腺嘧啶 h y p o x a n t h i n e - t h y m i d i n e i m m u n o g l o b u l i ng m o n o c l o n a la n t i b o d y n i t r o c e l l u l o s e o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e p o l y e t h y l e n eg l y c o l h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e n - t r i s h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e 次黄嘌呤胸腺嘧啶 免疫球蛋白g 单克隆抗体 硝酸纤维素膜 光密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 聚乙二醇 辣根过氧化物酶 十二烷基磺酸钠 n 一三羟甲基氨基甲烷 t r i s - b u f f e rs a l i n e ir i s 缓冲盐溶液 t e t r a m e t h y 1b e n z i d i n e 四甲基联苯胺 后，使免疫小鼠脾细胞具有稳定分泌抗华支睾吸虫抗体的能力。在融合剂p e g 的 作用下将免疫小鼠脾细胞与s p 2 0 骨髓瘤细胞进行融合，获得杂交瘤细胞。在h a t 和h t 选择培养基的培养条件下，以间接e l i s a 法对获得的杂交瘤细胞进行克隆 化筛选。对稳定分泌抗华支睾吸虫m c a b 株采用动物体内诱生的方法进行制备。 以饱和硫酸铵沉淀法和f p l c 法对获得的单抗腹水进行纯化和纯度鉴定。以间接 e l i s a 法对单抗腹水进行效价测定、亚类测定及特异性检测，d o t - b l o t 法检测单抗 免疫学活性。用i f a t 进行单抗对虫体的识别部位观察，用免疫组化观察单抗与感 染小鼠肝脏组织中抗原的结合。 结果经过动物免疫、细胞融合、选择性培养，克隆化筛选后获得l 株稳定 分泌抗华支睾吸虫成虫抗原的单克隆抗体株，命名为d 1 0 ，该细胞生长良好，稳 定性好，经过连续传代2 0 次，一7 0 冰箱保存后复苏仍然具有良好生长状态及稳 定分泌抗体的能力；用此株单抗制备小鼠腹水液，纯化后腹水蛋白浓度为 2 2 m g m 1 ，抗体效价检测达到1 ：2 0 0 0 0 0 以上，单抗亚类鉴定显示为i g g ，类，f p l c 法观察见纯化单抗d 1 0 的洗脱峰只有一个单一峰，而且对称性好，纯度达到9 0 以上os d s - p a g e 电泳显示单抗的重链分子量为5 0 k d a ，轻链分子量为2 6k d a 。e l i s a 法检测其与猪囊尾蚴、弓形虫、疟原虫和日本血吸虫抗原无交叉反应。 免疫荧光实验观察到单抗d 1 0 能与华支睾吸虫虫体的表皮及虫卵结合。免疫 2 徐州医学院硕士学位论文 组化显示单抗d 1 0 可与病变肝脏组织中汇管区及周围间质中的抗原结合。 结论( 1 ) 获得稳定分泌抗华支睾吸虫成虫抗原单克隆抗体株1 株，命名为 d 1 0 。( 2 ) 单克隆抗体d 1 0 具有较好的纯度和免疫学活性，特异性强，为华支睾吸 虫病的研究及华支睾吸虫病诊断抗体的研制奠定了基础。( 3 ) 单克隆抗体d 1 0 能 与感染华支睾吸虫小鼠病变肝脏组织发生特异性结合，为进一步探讨华支睾吸虫 感染的免疫致病机制提供了新的实验工具。 关键词华支睾吸虫；成虫抗原；单克隆抗体； 徐州医学院硕士学位论文 p r e p a r a t i o na n df u n c t i o no fm o n o c l o n a l a n t i b o d i e sa g a i n s t c t o n o r c h i ss b t e n s i s a b s t r a c t o b j e c t i v e t oe x p l o r em o n o c l o n a la n t i b o d i e s ( m c a b s ) w i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n d s p e c i f i c i t ya g a i n s tc l o n o r c h i ss i n e n s i sb yh y b r i d o m at e c h n o l o g ya n dl a yaf o u n d a t i o n f o r e s t a b l i s h i n gaq u a l i t ym e t h o do fs e r o d i a g n o s i sa n de p i d e m i o l o g i c a ls u r v e yo f c l o n o r c h i a s i ss i n e n s i s m e t h o d s ( 1 ) g u i n e ap i g sw e r ei n f e c t e d 埘t l lm e t a c e r c 撕a e so fc l o n o r c h i s s i n e n s i sw h i c hc o l l e c t e df r o mt h ei n f e c t e dp s e u d o r a s b o r ap a r v e ，t oo b t a i nt h ea d u l t w o r ma n dp r e p a r ea n t i g e no fcs i n e n s i s ( c a ) ( 2 ) t h r e er o u n d so fb a s i ci m m u n i z a t i o n a n dab o o s t e ri m m u n i z a t i o no fb a l b cm i c ew e r et a k e n 晰n lc a ( 3 ) t h es p l e e nc e l l so f i m m u n i z e dm i c ew e r ef u s e d 、矶t l lm y e l o m ac e l l ss p 2 0u n d e rt h ea c t i o no fp e gi no r d e r t og e tt h eh y b r i d o m ac e l l s ( 4 ) t h ec l o n e so ft h eh y b r i d o m ac e l l sw e r es c r e e n e db y e l i s a ( 5 ) m o n o c l o n a la n t i b o d i e sw e r ec o l l e c t e df r o mt h ea s c i t e sa f t e rh y b r i d o m ac e l l s s e c r e t i n gs t a b l ya n t i - c am c a bb e i n gi n j e c t e di n t ot h ea b d o m i n a lc a v i t yo fb a l b cm i c e ( 6 ) t h em c a b sw e r ep u r i f i e df r o ma s c i t e s 研t l la m m o n i u m s u l f a t ep r e c i p i t a t i o nm e t h o d a n di d e n t i f i e db yp f l c ( 7 ) t h ei m m u n o l o g i c a la c t i v i t yo ft h em c a bw a si d e n t i f i e db y d o t - b l o ta n dt h et i t e ra n ds p e c i f i c i t yo ft h em c a br e a c t i o n 诹t l lt h ea n t i g e n so fc s i n e n s i s ，c y s t i c e r c o s i s ，t o x o p l a s m a ，p l a s m o d i u mv i v a sa n ds c h i s t o s o m a j a p o n i c u m w e r ed e t e c t e db ye l i s a ( 8 ) i f a ta s s a yw a su s e dt oi d e n t i f yt h el o c a l i z a t i o no ft h e m c a br e a c t i n gw i t ht h es e c t i o no fa d u l to fcs i n e n s i sa n di m m u n o t f i s t o c 蛐w a su s e d t oi n v e s t i g a t et h ed i s t r i b u t i o no fa n t i g e no fcs i n e n s i si nt h el i v e ro f i n f e c t e dm i c e r e s u l t so n eh y b r i d o m ac e l ll i n en a m e dd10 谢t 1 1l l i g ht i t e ro fr e a c t i o nt oc s i n e n s i sa n t i g e nw a so b t a i n e ds u c c e s s f u l l yb yh y b r i d o m at e c h n i q u e i ts t i l lh a st h e a b i l i t yo fs e c r e t i n gm c a bs t a b l ya f t e rs e r i a lp a s s a g e2 0t i m e s t h em c a bw a sp u r i f i e d f r o mt h ea s c i t e sw h i c hb ep r e p a r e df r o md10l i n e t h ec o n c e n t r a t i o no ft h ep r o t e i no f m c a bd 1 0w a s2 2m g m l ，a n dt h ef i t e ro fm c a bd 1 0 谢t l lc aw a s1 ：2 0 0 0 0 0 t h e i s o t y p eo fm c a bd 10w a sd e t e r m i n e dt ob ei g g1a n ds h o w e do n l yo n ee l u t i n gp e a k i n v e s t i g a t e db yf p l c 、析t l lt h ep u r i t yo fo v e r9 0 t h er e s u l to ft h es d s - p a g es h o w e d t h a ti t sm o l e c u l a rw e i g h to fh e a v yc h a i nw a s5 0 k da n dl i g h tc h a i nw a s2 6 k d t h eh i g h 4 ， - 徐州医学院硕士学位论文 i m m u n o l o g i ca c t i v i t yw a so b s e r v e db yd o t - b l o ta n dn oc r o s sr e a c t i o n sw e r es e e nw h e n m c a bd 1 0 r e c o g n i z e d 、析t 1 1a n t i g e n so f c y s t i c e r c o s i s ，t o x o p l a s m a ，p l a s m o d i u mv i v a s a n ds c h i s t o s o m aj a p o n i c u m t h em c a bc o u l dr e a c t 、析t ht h ee p i d e r m i so fa d u l tw o r m a n dt h ee g go fcs i n e n s i sb yi f a ta s s a ya n dc o u l dc h a t c ht h ea n t i g e nl o c a t e di np o r t a l a r e a sa n dt h es u r r o u n d i n gi n t e r s t i t i u mo ft h el i v e ro fi n f e c t dm i c e c o n c l u s i o n ( 1 ) o n eo fm o n o c l o n a la n t i b o d i e s ( m c a b ) a g a i n s tc l o n o r c h i s s i n e n s i sn a m e dd 1 0w a ss u c c e s s f u l l yo b t a i n e d ( 2 ) t h em c a bd 1 0w o u l db ew i t h a d v a n t a g e si nh i 曲p u r i t ya n di m m u n o l o g i ca c t i v i t y ，s p e c i f i c i t y ，w h i c hm i g h tl a ya f o u n d a t i o nf o rt h ed e v e l o p m e n to fd i a g n o s i so fc l o n o r c h i a s i ss i n e n s i s ( 3 ) t h em c a b d10w o u l db eau s e f u lt o o lf o rt h es t u d yo ft h ep a t h o g e n i cm e c h a n i s mo fc l o n o r c h i a s i s s i n e n s i s k e yw o r d s c l o n o r c h i ss i n e n s i s ；a n t i g e no fa d u l tw o r m ；m o n o c l o n a la n t i b o d y ； 5 徐州医学院硕士学位论文 前言 华支睾吸虫( 肝吸虫) 是寄生在人、狗、猫、猪等胆管内的寄生虫，主要流 行于中国、韩国及日本等东亚地区，约有三千万人感染【l 】。目前我国华支睾吸虫 感染者已有1 2 4 9 万【2 】，感染率比1 9 9 0 年上升了7 5 ，且有增加趋势，其中广东、 广西和吉林等地区的感染率则分别上升了1 8 2 、1 6 4 和6 3 0 。华支睾吸虫成虫感 染宿主，可引起胆管的炎症反应，肝脏与胆囊的组织损伤及功能改变，出现胆囊 炎、胆管炎、胆管肝炎、胆结石和肝硬化，甚至诱发肝胆管癌1 3 】，严重危害人民生 活健康，防治工作刻不容缓，而提高对华支睾吸虫病的诊断水平是开展流行病学 调查、进行临床检测和防治的重要环节。感染者确诊的依据是病原学诊断，即从 粪便中找到华支睾吸虫卵，但由于成虫排卵量少、虫卵小，极易漏检，加之粪检 工作量大、工作效率低、群众难以接受等因素，病原检查固有的缺陷愈加突出， 难以满足大规模普查需要。随着华支睾吸虫病防治工作的进展，免疫诊断在临床 辅助诊断和疫区流行病学调查中占据愈来愈重要的地位，研制开发快速、方便、 敏感性高、特异性强的肝吸虫病诊断工具是及时治疗患者的重要保障，也是国家 2 0 0 6 年- 2 0 1 5 年全国重点寄生虫病防治规划要求重点开发的研究项目。 迄今为止，华支睾吸虫病的免疫学诊断仍面临着许多问题，假阳性、假阴性 和交叉反应仍是影响诊断结果的主要问题。目前常用的免疫学诊断方法主要有皮 内试验( d ) 、酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 、间接血凝试验( i h a ) 、间接荧光抗 体试验( i f a t ) 、免疫酶染色试验( i e s t ) 、免疫金银染色( i g s s ) 、双抗体夹心e l i s a ( d a s e l i s a ) 、亲和素生物素化酶复合物e l i s a ( a b c e l i s a ) 等【4 】，主要分 为检测抗原和检测抗体两类。抗体检测法，其敏感性和特异性大多较好，但由于 治愈后抗体在血清中长期存在，难以区分现症感染和既往感染，且无法考核疗效。 抗原检测则可有效的区分现症感染和既往感染，可以考核疗效，但主要问题是敏 感性不够。寻找敏感性高特异性强的探针是解决这一难题的策略之一，单克隆抗 6 徐州医学院硕士学位论文 体为此提供了有力的技术工具。 1 9 7 5 年英国科学家k o h l e r 和m i l s t e i n f 9 1 成功建立了单克隆抗体技术，也因此 两位学者在1 9 8 4 年获得诺贝尔医学和生理学奖。单克隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d y ， m c a b ，简称单抗) 技术是将产生抗体的单个b 淋巴细胞同肿瘤细胞杂交，获得既能 产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，即杂交瘤细胞，并以此生产抗体的技术。 单克隆抗体具有性质纯、效价高、特异性强、少或无血清交叉反应等特点，另外 单克隆抗体使用永生的杂交瘤细胞株来分泌抗体，因此不需要不断免疫动物。也 正由于它上述的性质，使它在许多学科领域得到应用，尤其在一些感染性疾病和 肿瘤的诊断方面，主要通过鉴定病原体或肿瘤抗原来诊断人是否患有疾病。目前 单抗已占生物药品市场的2 0 的份额，成为其最重要的发展领域1 0 。1 3 1 。 m c a b 已广泛应用于寄生虫病的临床与实验研究，如虫种、虫株的鉴定与分型， 分析、纯化抗原和制备目的抗原，保护性免疫，疫苗研究和免疫诊断等。尤其在 检测宿主体内的循环抗原方面，m c a b 已成为极为有用的工具，为寄生虫病的现症 诊断、虫荷估计、疗效考核和预后判断提供了新的手段。国内已有报告采用单克 隆抗体的双抗体夹心斑点e l i s a 和单抗斑点金银染色法检测疟原虫循环抗原，阳 性率分别达8 5 一- - 8 6 7 和9 0 - 9 3 3 ，敏感度可达5 个原虫1 0 6 红细胞水平，具 有很高的特异性和稳定性【1 4 】。单克隆抗体用于血吸虫虫卵抗原、循环多糖抗原及 特定分子量抗原检测等，均取得满意结果【1 5 】。用制备的抗弓形虫重组蛋白抗原l ( s a g l ) 的人源化单克隆抗体f a b 片段被动免疫感染了弓形虫速殖子的小鼠，可 见其明显降低了小鼠病死率，表明针对s a g l 的人源化单抗f a b 段可能适用于对 弓形虫病的免疫预防1 6 1 。用肝片吸虫的重组蛋白酶b 3 ( r c a t b 3 ) 免疫动物制备的单 抗与其他寄生虫无交叉反应，可以做为诊断肝片吸虫的诊断抗体【1 7 1 。单克隆抗体 用于其他寄生虫病，如斯氏狸殖吸虫病、丝虫病、囊虫病和黑热病等抗原检测均 显示出良好的应用前景。 鉴于杂交瘤技术的日渐成熟和普及以及在多种寄生虫病中的研究和应用，我 们借鉴了单抗技术应用在其它寄生虫病研究中的成功经验，用华支睾吸虫成虫抗 7 原免疫动物，制备抗 特异性强的检测肝吸 工具，为诊断试剂盒 徐州医学院硕士学位论文 材料和方法 l材料 1 1 试剂 1 1 1 福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂s i g m a 公司 1 1 2 h a t 选择培养基s i g m a 公司 1 1 3 h t 选择培养基s i g m a 公司 1 1 4 华支睾吸虫病人阳性血清哈尔滨医科大学提供 1 1 5聚乙二醇( p e g ) 1 5 0 0m e r c k 公司 1 1 6 二甲基亚砜( d m s o )a m r e s c o 公司 1 1 7d m e m 培养基 g i b c o l 公司 1 1 8 新生胎牛血清杭州四季青公司 1 1 9 碱性磷酸酶标记的羊抗人i g g中山金桥公司 1 1 1 0 四甲基联苯胺( t m b )s i g m a 公司 1 1 1 1 抗体亚类试剂盒 s i g m a 公司 1 1 1 29 6 j ：l 酶标板 c o m i n g 公司 1 1 1 3 其他试剂均为国产分析纯试剂。 1 2 主要仪器设备 高速低温离心机( 5 8 0 4 r 型，德国e p p e n d o r f ) 4 c 冰箱( b c d - 2 0 6 a 型，新飞公司) 净化工作台( s w 二c j 2 f 型，苏州安泰空气技术有限公司) 电热恒温干燥箱( d h g 9 2 4 1 a 型，上海贺德实验设备有限公司) 恒温水浴箱( h h - 4 2 型，常州国华电器有限公司) 隔水式电热恒温培养箱( d h p 9 1 6 2 型，上海一恒有限公司) 磁力搅拌器( 8 5 1 型，常州国华电器有限公司) 微量天平( f a l 0 0 4 n 型，上海精密科学仪器有限公司) 9 徐州医学院硕士学位论文 酸度计( p h s 3 c 型，上海天达仪器有限公司) 微型蜗旋混合器( w h 2 型，上海沪西分析仪器厂) 微波炉( w p 7 0 0 型，格兰仕) 手提式压力蒸汽灭菌( y x qs g 4 1 2 8 0 型，上海华线医用核子仪器有限公司) 快速蛋白液相色谱仪( a k t ae x p l o r e1 0 0 型，美国通用电气公司g e ) 分子筛层析柱( s u p e r d e x7 5 型，美国通用电气公司g e ) 紫外分光光度计( 7 5 2 型，上海第三分析仪器厂) 微小蛋白电泳槽( 5 2 5 b r 型，美国b i o r a d 公司) 蛋白电泳仪( 0 4 3 b r l 5 4 9 型，美国b i o r a d 公司) 半干转仪( 2 2 l b r 3 4 8 4 7 型，美国b i o b a d 公司) 加样器( 德国e p p e n d o r f 公司) 不锈钢筛网( 上海黄浦区陆顺兴工厂) c l i n i b i o 酶标仪( 奥地利a s a y 公司) 1 3 主要试剂配置方法 1 3 1 人工消化液 胃蛋白酶 7 9 h c ll m l n a c l1 0 0 0 m l 1 3 2 饱和硫酸氨溶液 ( n h 4 ) 2 s 0 4 4 0 0 9 4 2 5 9 d d h 2 0 ( 5 0 - - 6 0 ) 5 0 0 m l 搅拌5 m i n ，趁热过滤。冷却后以浓氨水( 1 5 nn h 4 0 h ) 调p h 至7 4 。配制好的饱 和硫酸铵溶液，瓶底应有结晶析出。 4 贮存。 1 3 3h a t 选择培养基 d m e m 基础培养液 19 8 m l 1 0 徐州医学院硕士学位论文 胎牛血清 5 0 h a t 4 贮存。 1 3 4h t 选择培养基 d m e m 基础培养液 小牛血清 5 0 h t 4 。c 贮存。 1 3 5 冻存液 d m e m 基础培养液 胎牛血清 二甲基亚砜 4 。c 贮存。 1 3 6 台盼兰溶液 台盼兰 5 0 m l 2 m l 1 9 8 m l 5 0 m l 2 m l 4 0 m l 5 0 m l 1 0 m l 5 0 0 m g 0 0 1 mp b s ( p h 7 4 ) 1 0 0 m l 4 。c 贮存。 1 3 7 封闭液 羊血清 2 m l 0 0 1 mp b s ( p h 7 4 ) 18 m l 1 b s a 0 2 m g 1 3 8 底物缓冲液( p h 5 0 柠檬酸一磷酸缓冲液) ( 1 ) 0 1 m 柠檬酸( 1 9 2 m g m 1 ) 柠檬酸 双蒸水 4 。c 贮存。 2 1 9 1 0 0 0 m l 徐州医学院硕士学位论文 ( 2 ) 0 2 mn a 2 h p 0 4 液 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 双蒸水 4 c 贮存。 ( 3 ) p h 值5 0 磷酸盐- 柠檬酸缓冲液 ( 1 ) 液 ( 2 ) 液 混匀即可。 1 3 9 终止液( 2 mh 2 8 0 4 ) h 2 s 0 4 ( 9 8 ) 双蒸水 4 。c 贮存。 7 1 6 9 1 0 0 0 m l 2 4 3 0 m l 2 5 7 0 m l 1 1 1 m l 1 8 8 9 m l 1 3 1 0t m b ( i t 甲基联苯胺) 使用液： t m b ( 2 m g m l 无水乙醇) 底物缓冲液( p h 5 5 ) 0 7 5 双氧水 1 3 1 1h e p e s 溶液 h e p t s 三蒸水 0 5 m l 1 0 m l 3 2 m 2 3 8 3 9 1 0 0 0 m l 0 2 2 1 x m 微孔滤膜过滤除菌，分装后4 保存。 1 3 1 21 0 g i e m s a 染液 g i e m s a 粉 甘油 o 5 9 3 3 m l 5 5 c - 6 0 c 保温2h ，加甲醇3 3 m i 混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液l 份， 加p h 6 8p b s9 份，即成1 0 g i e m s a 染液。 1 3 1 31 0 n a o h 1 2 徐州医学院硕士学位论文 n a o h 双蒸水 4 。c 贮存。 1 3 1 4t b s i r i s h c l 缓冲液( p h7 6 ) n a c l 双蒸水 高压蒸汽灭菌，4 。c 保存。 1 3 1 5 碳酸盐缓冲液( p h9 6 ) n a 2 c 0 3 n a h c 0 3 n a n 3 双蒸水 4 保存。 1 3 1 60 0 2 mp b s ( p h 7 4 ) n a c l k h 2 p 0 4 n a 2 h p 0 4 12 h 2 0 k c l 双蒸水 1 3 1 73 0 a a 母液( 3 0 a r c b i s ) 1 0 9 1 0 0 m l 1 0 0 m l 9 9 1 0 0 0 m l 5 0 0 9 2 9 3 9 o 2 0 9 1 0 0 0 m l 8 0 9 0 2 9 2 9 9 0 2 9 1 0 0 0 m l n ，n - 亚甲双丙稀酰胺 l g 丙稀酰胺 2 9 9 双蒸水 1 0 0 m l 滤纸过滤，置棕色瓶内，4 避光保存。 1 3 1 81 2 分离胶和4 的浓缩胶 1 3 徐州医学院硕士学位论文 分离胶浓缩胶 双蒸水 2 5 9 m l1 2 3 m l 3 0 a a 母液 3 3 m l 0 5 3 m l ( 1 5 mp h 8 9 ) t r i s h c i ( 1 5 mp h 6 8 ) t r i s - h c l 2ml| t l m l 1 0 s d s ( p h 7 2 ) 4 9 l 4 0 蔗糖 1 0 a p s ( p h 7 2 ) 4 9 l t e m e d 4 9 l 1 3 1 91x t r i s 甘氨酸缓冲液( 电泳液) 晡s 3 9 甘氨酸1 8 7 5 9 s d s l g 双蒸水 1 3 2 0 考马斯染色液 考马斯亮兰r 2 5 0 甲醇 冰醋酸 双蒸水 1 3 2 l脱色液 甲醇 冰乙酸 双蒸水 1 3 2 2 转移缓冲液( 电转液) 甘氨酸 t r i s 1 9 4 5 m l 1 0 0 m l 1 0 0 0 m l 6 0 m l 1 0 m l 4 0 m l 1 4 4 9 5 0 3 9 1 4 4 9 l 1 2 m l 2 9 l 4 “l 徐州医学院硕士学位论文 甲醇 2 0 0 m l 双蒸水1000ml 1 4 细胞和动物 健康雌性b a l b c 小鼠，6 8 周龄2 0 只，1 2 周龄1 0 只，健康豚鼠1 0 只，徐 州医学院动物实验中心提供。 s p 2 0 骨髓瘤细胞由蚌埠医学院病原生物学教研室惠赠。 华支睾吸虫囊蚴阳性的麦穗鱼购自徐州市郊县区。 2 方法 2 1 华支睾吸虫成虫抗原的制备 2 1 1 华支睾吸虫囊蚴的采集和分离 将感染华支睾吸虫囊蚴的麦穗鱼用清水洗净，去除鱼鳍、鱼鳞和内脏，剔下 鱼肉制成肉泥，放入三角烧瓶中。每克鱼肉加1 0 m 1 人工消化液，3 7 c 消化1 2 h 。 将消化好的鱼肉经6 0 目分离筛过滤到大量杯中，静置3 0 m i n ，弃上清，加满生理 盐水后再静置3 0 m i n ，如此反复几次至水变清为止。吸取适量沉渣于表玻皿中，在 解剖镜下用解剖针分离囊蚴。囊蚴的特征为囊壁薄，直径约1 2 0 岬1 4 0 岬，排泄 囊黑褐色、团状，囊内虫体运动活泼。用小吸管将囊蚴吸出并计数，保存于a l s e v e r s 溶、液【1 8 1 中，置于4 c 冰箱备用。 2 1 2 华支睾吸虫成虫的制备 经口感染豚鼠1 0 只，每只感染华支睾吸虫囊蚴2 5 0 个。感染5 0 d 后处死动物， 无菌取出肝脏，生理盐水冲洗后从胆管中挤出虫体，放入培养皿中用生理盐水反 复冲洗至澄清为止。 2 1 3 成虫抗原制备 将华支睾吸虫成虫充分研磨成匀浆，然后反复冻融，再于冰浴中超声粉碎1 0 s ， 反复5 次，每次间隔5 0 s 。粉碎后1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取上清，即为华支睾吸 虫成虫可溶性抗原。分光光度计测定蛋白浓度并计算蛋白含量，分装，2 0 c 冻存 备用。 徐州医学院硕士学位论文 2 1 4 华支睾吸虫阳性血清的制备 用心脏采血法取感染华支睾吸虫豚鼠的血液，待血液凝固血清析出后， 3 5 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取血清，2 0 保存备用。 2 3 动物免疫 2 3 1免疫方案 选择生长良好的6 - - - 8 周龄、雌性b a l b c 小鼠5 只，以上述制备的华支睾吸虫 成虫抗原进行免疫，另设对照组小鼠2 只，在同一饲养条件下饲养。将一定体积 的浓度为6 5l ag “l 的华支睾吸虫成虫抗原溶于3 0 0 1 d 生理盐水中，充分混匀，加 入等体积的福氏佐剂，取5 m l 玻璃注射器一个将混合液体完全吸出，注射器口套 上胶皮管，用绳扎紧，胶皮管另一端套上同样的5 m l 玻璃注射器，扎紧，来回推 动注射器约1 h ，使抗原与佐剂充分混匀待用( 用于前两轮免疫) 。用酒精棉球擦拭 小鼠背部皮肤，皮下多点注射，o 2m l 点，3 - 4 点只。对照组小鼠只注射生理盐 水，3 0 0 p 1 只。 具体免疫方案如下： 1 w k 4 w k 7 w k 融合前3 d 抗原5 0ug 只，溶于3 0 0 1 t l 生理盐水中，加入等量福氏完 全佐剂( c f a ) 充分乳化，背部皮下多点注射； 抗原5 0ug 只，溶于3 0 0 1 d 生理盐水中，加入等量福氏不 完全佐剂( i f a ) 充分乳化，背部皮下多点注射； 抗原5 0 | ig 只，溶于3 0 0 ul 生理盐水中，背部皮下多点注 射； 抗原1 0 0 l ag 只，溶于5 0 ul 生理盐水中，小鼠内眦静脉注 射以加强免疫。 2 3 2 免疫小鼠血清的制备 分别在3 次基础免疫1 周后取血，采用内眦静脉采血法：将1 戊巴比妥那腹 腔注射入小鼠体内，1 0 0 m l 只，注意小鼠保暖，约3 0 m i n 后待小鼠充分麻醉，左手 拇、食两指从背部握住小鼠颈部，压迫颈部两侧，使眶后静脉丛充血，眼球突起； 1 6 徐州医学院硕士学位论文 右手持自制采血器，由眼角内眦刺入，刺入后转动1 8 0 度，吸出血液，接入lm le p 管内；拔出采血器，用纱布按压内眦至不再出血。取血后3 5 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，吸 出上清，置2 0 保存备用。 2 4间接e l i s a 检测条件的优化 2 4 1 棋盘滴定法确定抗原、抗体的最佳浓度【1 9 】 2 4 1 1 将华支睾吸虫抗原稀释成2 1 t g m l 、1 0 i - t g m l 、5 0 9 t g m l 三种浓度包被 e l i s a 板，1 0 0 1 d 孔，4 过夜。 2 4 1 2 次日取出置3 7 复温2 h ，p b s 洗板3 次，l m i n 次。 2 4 1 3 加封闭液封闭0 5 h ，甩干。 2 4 1 4 将阳性、阴性血清用p b s 溶液分别做1 ：1 0 0 、1 ：2 0 0 、1 ：4 0 0 、1 ：8 0 0 倍比稀释，加入已包被好的e l i s a 板各孔中，每个样品均设复孔，每孔1 0 0ul ， 同时设空白对照，3 7 作用m 。 2 4 1 5 洗板3 次，用p b s 溶液将h r p 标记的酶标二抗稀释至工作浓度( 1 ：5 0 0 0 倍稀释) ，每孔1 0 01 tl ，3 7 c 作用l h 。 2 4 1 6 洗板5 次，加入新配制的底物显色液，每孔1 0 0ul ，室温避光显色1 5 m i n 。 2 4 1 7 加入终止液1 0 0l al 孔，终止反应。 2 4 1 8 用自动酶标测定仪在波长4 5 0 n m 处测定每孔的光吸收值。取平行样品孔 平均值，以阳性血清孔的o d 4 s o 值接近1 0 ，p n 2 时的抗原、血清稀释度作为抗 原包被浓度和血清稀释度。 2 4 2 间接e l i s a 法其他工作条件的优化 2 4 2 1抗血清最佳作用时间：采用抗原最佳包被浓度包被e l i s a 板，抗血清作 用时间分别为3 0 m i n 、6 0 m i n 、1 2 0 m i n ，抗血清3 7 作用6 0 m i n ，酶标二抗作用时 间为1 h 其它条件相同，计算p n 值，确定抗血清最佳作用时间。 2 4 2 2 酶标二抗作用时间：采用抗原最佳包被浓度4 。c 包被过夜，含5 脱脂乳 的p b s 封闭6 0 m i n ，抗血清3 7 作用6 0 m i n ，酶标二抗作用时间分别为3 0 m i n 、 6 0 m i n 、1 2 0 m i n ，其它条件相同，计算p n 值，确定酶标二抗最佳作用时间。 1 7 徐州医学院硕士学位论文 2 4 2 3 封闭液的确定：抗原最佳包被浓度4 0 c 包被过夜，分别设3 种封闭液：1 0 羊血清+ i b s a + p b s 、i b s a + p b s 、5 脱脂乳进行封闭，封闭时间分别为3 0 r a i n 、 6 0 m i n ，抗血清3 7 c 作用6 0 m i n ，酶标二抗作用时间为6 0 m i n ，其它条件相同，计 算p n 值，确定封闭液最佳作用条件。 2 5 杂交瘤细胞株的建立 2 5 1 骨髓瘤细胞的准备 2 5 1 1 复苏s p 2 o 骨髓瘤细胞 在融合前l o & - 一1 4 d 从液氮罐中取出冻存管，立即投入盛有3 7 c 温水的烧杯中， 融化后于10 0 0 r p m 离心3 0 m i n ，弃上清；取l m l 刻度吸管，吸取含2 0 胎牛血清的 d m e m 培养液i m l 装入冻存管，轻轻吹打几次，移入培养瓶中；取l o m l 刻度吸管， 吸取l o m l 含胎牛血清的培养液加入培养瓶；将培养瓶放入二氧化碳孵箱，次日换 液，每2 d - - 3 d 传代一次。 2 5 1 2 维持骨髓瘤细胞对数生长期7 d 。 2 5 1 3 融合前，用吸管将细胞从瓶壁上吹下，收集于5 0 m l 离心管。1 0 0 0 r p m 离 心5 m i n ，弃上清。 2 5 1 4 沉淀中加入不完全培养液，再离心一次。然后将细胞重悬至1 0 m l ，混匀。 2 5 1 5 取细胞悬液o 1 m l ，加o 5 苔盼蓝溶液0 1 m l ，混匀，取少量细胞悬液滴 在细胞计数板的计数室中，经显微镜计数，透亮不着色的活细胞应在9 5 以上。 按活细胞计算，吸取2 x1 0 7 个细胞备用。 2 5 2 小鼠饲养细胞的制备 2 5 2 1小鼠腹腔巨噬细胞的制备 于细胞融合前一天，取b a l b c 小鼠，摘除眼球处死，自来水冲洗后，浸泡在 7 5 酒精中5m i n ，将小鼠固定在解剖板上，剥离腹部皮肤，用注射器抽取5 r n l - - - 1 0 m l 基础培养液，注入小鼠腹腔中( 左手持镊子夹住肝区的腹膜，右手将预先抽 吸好的基础培养液轻轻推入腹腔) ，反复抽吸2 - - 3 次后，吸出液体，置于冰浴预 冷的5 0m l 塑料离心管中，以免腹腔巨噬细胞贴壁。 1 8 徐州医学院硕士学位论文 2 5 2 2 小鼠胸腺细胞的制备 按上述方法处死、消毒、固定小鼠，或将上述取过腹腔巨噬细胞的小鼠用消 毒后的剪刀沿胸骨打开小鼠胸腔，取出位于心脏上方的胸腺，置于1 2 0 目的钢丝 网中，在盛有约1 5 m l 基础培养液的平皿中，用注射针芯轻轻压磨胸腺，使其成为 单个细胞而悬于培养液中，吸取细胞悬液单独或与上述腹腔细胞混合，1 0 0 0 r p m 离 心5 m i n ，取沉淀细胞用完全培养液调浓度为2 1 0 5 个m l ，接种于9 6 孔培养板中， 每孔1 0 0l al 。 2 5 3 免疫脾细胞的制备 按上述方法处死小鼠，消毒后固定于解剖架上打开腹腔，在左后腹部取出脾 脏。按上述研磨胸腺的方法，获取单个脾脏细胞。计数有核细胞( 用苔盼蓝液作 活细胞计数) ，一个脾脏可获约1 0 8 个细胞，1 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，沉淀细胞重悬于 适量的培养液中备用。 2 5 4 细胞融合 2 5 4 1 细胞计数调整细胞浓度，将l 1 0 8 脾细胞与2 1 0 7s p 2 0 骨髓瘤细胞( 1 ：5 ) 混合于5 0 m l 离心管中，补加不完全培养基至3 0 m l ，充分混匀。 2 5 4 210 0 0 r p m 离心10 m i n ，将上清尽量吸净。 2 5 4 3 在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀；置4 3 水浴中预热。 2 5 4 4 用l m l 吸管在6 0 s 内加预热至4 0 c 的5 0 p e g ( p h8 0 ) l m l ，边加边轻 轻搅拌。 2 5 4 5 水浴中静置9 0 s ，立即加入预热至3 7 的不完全培养基，具体的加法为： 3 0 sl m l 3 0 s3 m l 3 0 s5 m l 继续补加基础培养液至4 0 m l ，3 7 c 静置1 0 m i n 。 2 5 4 6 1 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃去上清。 2 5 4 7 加入5 m lh a t 培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加 1 9 徐州医学院硕士学位论文 h a t 培养基至4 0 m l 。 2 5 4 8 分装9 6 孔细胞培养板，每孔0 1 m l ；然后将培养板置3 7 c ，5 c 0 2 培养 箱内培养。 2 5 4 95 d 后用h a t 培