（发育生物学专业论文）植物中dreb类转录因子抗逆性相关的功能研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 植物中d i 还b 类转录因子抗逆性相关的功能研究 花生d r e b 类转录因子的分离及抗逆性研究 中文摘要 植物生长在自然界中，经常面临干旱、高盐、低温等非生物胁迫因子，由逆境胁迫导 致的农作物减产最高可达7 0 【1 】。转录因子在植物生长发育过程中具有重要作用，通过与 特异的顺式作用元件结合，从而激活并调控下游基因的表达。其中a p 2 e r e b p 类、b z i p 类、w r k y 类等转录因子主要与植物抗逆性相关，当植物处于逆境时，这几类转录因子可 对胁迫刺激产生响应，通过调控下游一系列逆境应答基因的表达而参与到逆境信号传递的 途径中去，对植物抗逆能力产生影响。 通过筛选花生未成熟种子的c d n a 文库，我们分离到一个d r e b 类基因 一p n d r e b l ( f m 9 5 5 3 9 8 ) 。同源序列比对显示，p n d r e b l 与其他d r e b 基因，如 g m d r e b 6 ( e f 5 5 1 1 6 6 ) 、h v c b f 7 ( a y 7 8 5 8 6 4 1 、d r e b l a 和d r e b l b 的同源性分别5 7 、5 1 、 4 2 1 、4 4 4 。p n d r e b l 蛋白编码2 2 7 氨基酸残基，理论分子量( m w ) 为2 4 7k d a ；其编 码蛋白结构分析显示：其包含一个长度为6 4 a a 的a p 2 e r e b p 结构域，且包含有在d r e b 亚族中非常保守的位于保守区的第1 4 位缬氨酸( v ) 和1 9 位谷氨酸( e ) ，对决定其与特异顺 式作用元件的结合起到关键作用；其n 末端为碱性氨基酸富集区( r a r a k r 4 t ) ，是可能的 核定位信号序列，而c 末端为酸性氨基酸富集区，在转录激活中发挥作用。 结合酵母杂交系统，我们对p n d r e b l 的结合活性及转录激活活性进行了验证。结果 显示：p n d r e b l 能够特异的与d r e 元件结合，并且其c 末端具有转录激活功能。p n d r e b l 的表达模式分析显示，其在花生的根、茎、叶、花、种子中均有表达；且其表达受干旱、 低温的诱导，而对盐胁迫没有响应。为了进一步研究p n d r e b l 的功能，相关正、反义植 物表达载体p r o k i i - p n d r e b l 、p c a m b i a l 3 0 1 - p n d r e b l 一g u s 已构建完成并转化烟草， 经筛选获得1 0 个转基因株系。 鉴于p n d r e b l 在植物抗逆过程中具有重要功能，通过同源克隆的方法，我们在花生 中又进一步分离到两个d r e b 类基因一彳硼聊，( f m 9 5 5 3 9 4 ) ，a h t i n y 2 ( f m 9 5 5 3 9 5 ) 。 同源序列比对显示：a h t i n y l 与t i n y 2 ( n m1 2 1 1 9 7 ) 基因具有更近的亲缘关系，同源性可 高达8 2 ，而a h t i n y 2 与大豆中的d r e b 3 ( d q 2 0 8 9 6 9 ) 的同源性可达到6 2 。a h t i n y l 、 a h t i n y 2 基因内部均含有a p 2 e r e b p 结构域，分别编码2 0 5 、2 0 9 个氨基酸残基。表达模 式分析显示：a h t i n y l ，a h t l n y 2 为组成型表达；a h t i n y l 受低温、尤其是a b a 和乙烯 诱导，而对干旱和盐胁迫几乎没有响应；而a h t i n y 2 仅受乙烯诱导。目前己构建了 i 山东师范大学硕士学位论文 a h t i n y l 、a h t i n y 2 的正、反义植物表达载体，相关遗传转化及转基因植株筛选的工作正 在进行中。 作为植物中特异存在的d r e b s 类转录因子，其在植物应答干旱、高盐和低温等非生 物胁迫中具有重要作用。本研究通过对花生中d r e b s 类转录因子相关基因的分离及功能 验证，为进步实现对花生进行品质、性状改良，创新花生抗逆新种质具有积极的指导作 用；也为获得植物综合抗逆能力提高的作物新品种提供候选基因及理论指导。 关键词：非生物胁迫；d r e b 类转录因子；酵母杂交；植物表达载体；同源克隆 分类号：q 7 8 i i 山东师范大学硕士学位论文 t h ef u n c t i o n a la n a l y s i so fd r e b s t r a n s c r i p t i o nf a c t o r si np l a n ts t r e s s t o l e r a n c e i s o l a t i o no fd r e b st r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa n dt h ef u n c t i o n a ia n a l y s i so fi t s s t r e s st o l e r a n c ei np e a n u t 似r a c h i sh y p o g a e al ) a b s t r a c t e n v i r o n m e n t a ls t r e s sc o n d i t i o n ss u c ha sd r o u g h t ，h i g hs a l i n i t ya n de x t r e m et e m p e r a t u r ea r e k n o w na sa b i o t i cs t r e s s e s t h e yi m p a k et h eg r o w t ha n dp r o d u c t i v i 够o fp l a n t sg r e a t l y ，a n dr e d u c e t h ep o t e n t i a ly i e l d sa sh i g ha s7 0 i nc r o pp l a n t s 1 1 t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ( t f s ) h a v eb e e n r e p o r t e dt op l a yc r u c i a lr o l e si np l a n td e v e l o p m e n t ，t h e yc a ns p e c i a l l yi n t e r a c tw i t hc i s - a c t i n g e l e m e n ta n dt h e r e f o r ec o n t r o lt h ee x p r e s s i o no fm a n yf u n c t i o n a lg e n e sd o w n s t r e a m a m o n g t h e m ，t h e r ea r e5f a m i l i e s ，s u c ha sa p 2 e r e b eb z i ew r k y , m y ba n dn a c ，a r er e p o r t e dt o p l a yk e yr o l e i np l a n t s t r e s sr e s i s t a n c ea n dt o l e r a n c eb yr e g u l a t i n gt h e e x p r e s s i o no f s t r e s s i n d u c i b l eg e n e sa n dp a r t i c i p a t i o ni ns t r e s ss i g n a lt r a n s d u c t i o n h e r ew eh a v ei s o l a t e dad e h y d r a t i o n - r e s p o n s i v ee l e m e n t - b i n d i n gp r o t e i n s ( d r e b s ) - l i k e g e n e ，p n d r e b l ( f m 9 5 5 3 9 8 ) b ys c r e e n i n gaf u l l - l e n g t he d n al i b r a r yo fp e a n u t 似r a c h 括 h y p o g a e al ji m m a t u r es e e d s p n d r e b 1s h a r e dh i g hp r o t e i ns e q u e n c eh o m o l o g y 谢t l lo t h e r d r e b s g e n e s ，i d e n t i t i e so f5 7 t og m d r e b 6 ( e f 5 5 116 6 ) ，51 t oh v c b f 7 ( a y 7 8 5 8 6 4 ) ，4 2 1 a n d4 4 4 t od r e b i aa n dd r e b i b ( a b 0 0 7 7 8 7 ，a b 0 0 7 7 8 8 ) ，r e s p e c t i v e l y t h eg e n ee n c o d e s 2 2 7 a aw i t hc a c u l a t e dm o l e c u l a rm a s so f2 4 7k d a p n d r e b1c o n t a i n sap u t a t i v en l sl o c a t e d n e a rt h en t e r m i n u s ，a n dap u t a t i v ea c i d i ca c t i v a t i o nd o m a i ni nc - t e r m i n a le n d ，w i t hah i g h l y c o n s e r v e da p e l a l 心( a p 2 ) b i n d i n gd o m a i na b o u t6 4 a a ，t h et w oa m i n oa c i d so f14 也( v a l i n e ) a n d19 也( g l u t a m i c ) ，w h i c hh a v eb e e nr e p o r t e dc r u c i a l i nt h ed e t e r m i n a t i o no fd n a - b i n d i n g s p e c i f i c i t y ，w e r ea l lb ef o u n d w i t h i nt h i sr e g i o n i no r d e rt oc o n f i r mt h ef u n c t i o n so fp n d r e b lb i o c h e m i c a l l ya n dp h y s i o l o g i c a l l y , t h ey e a s t h y b r i ds y s t e ma n dt h eg e n e t i ct r a n s c r i p t i o nw e r ec a r r i e do u t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp n d r e b l c a ns p e c i a l l yi n t e r a c tw i t hd r e c i s a c t i n ge l e m e n t ，b yw h i c ht h ep n d r e b la p 2d o m a i nc o u l d b ev e r i f i e d ；t h ec t e r m i n a le n dw h i c hc o u l df u n c t i o na sat r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t o rw a sa l s o p r o v e d t oa n a l y z et h ee x p r e s s i o np a t t e r n so fp n d r e b li np e a n u t ，p a r t i c u l a r l yu n d e ra b i o t i c s t r e s s e st r e a t m e n t s ，r t - p c ra n a l y s i sw a sp e r f o r m e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep n d r e b l t r a n s c r i p t sw e r ec o n s t i t u t i v e l yd e t e c t e di nr o o t ，s t e m ，l e a f , f l o w e ra n ds e e d s w h e nt r e a t e db y d e h y d r a t i o n ( 2 0 p e g ) a n d4 cl o wt e m p e r a t u r ef o r2h r s ，t h ee x p r e s s i o no fp n d r e b lw a s a l li n d u c e d ，w h i c hw a sa l m o s tn or e s p o n s ew h e nt r e a t e db y2 5 0 m mn a c lf o r2h r s m e a n t i m e ， t h eb i n a r yv e c t o r so fp r o k i i - p n d r e b la n dp 3 5 s - 1 3 0 1 - p n d r e b lw e r ec o n s t r u c t e df o r i i i 山东师范大学硕士学位论文 t o b a c c ot r a n s f o r m a t i o n ，a n df i n a l l y , a b o u tt e nt o b a c c oi n d e p e n d e n tr e s i s t a n tl i n e sw e r e r e g e n e r a t e d g i v e nt h ei m p o r t a n tf u n c t i o no fp n d r e b li np l a n ts t r e s sr e s i s t a n c e ，w ef u r t h e ri s o l a t e d a n o t h e rt w od r e b s l i k eg e n ei np e a n u t - a h t i n y l ( f m 9 5 5 3 9 4 ) ，a h t i n y 2 ( f m 9 5 5 3 9 5 ) b y h o m o l o g ys e a r c h i n gs e q u e n c e sa n a l y s i ss h o w e d ，a h t i n y lw a sc l o s e l yr e l a t e dt oa r a b i d o p s i s t i n y 2 ( n m 一1 2119 7 ) ，w i t h8 2 i d e n t i t ya ta m i n oa c i dl e v e l ，a n da h t i n y 2s h a r e d6 2 p r o t e i n s e q u e n c eh o m o l o g yw i t hs o y b c a nd r e b 3 ( d q 2 0 8 9 6 9 ) b o t ho ft h e mc o n t a i n e dac o n s e r v e d a p 2 e r e b pd o m a i n ，a n de n c o d e2 0 5 a a 、2 0 9 a a ，r e s p e c t i v e l y r t - p c ra n a l y s i ss h o w e dt h a tb o t h a h t i n y la n da h t i n y 2w e f ec o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e d ，a n dt h ei n d u c e de x p r e s s i o np a t t e m s h o w e dt h a ta h t i n y lw a si n d u c e db yl o wt e m p e r a t u r e ，e s p e c i a l l ya b a ，a n de t h y l e n e ，w i t h s l i g h ti n d u c e db yd e h y d r a t i o n ( 2 0 p e g ) a n d2 5 0 m mn a c l b u ta h t i n y 2w a so n l yi n d u c e db y e t h y l e n e t h eb i n a r y v e c t o r so fa h t i n y ia n da h t l n y 2w e r ec o n s t r u c t e df o rg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n ，a n dt h ew o r ko ft r a n s g e n l c ss c r e e na n df u n c t i o n a la n a l y s i sa r es t i l lu n d e r g o i n g t os u mu p ，w eh a v ei s o l a t e da n dv e r i f i e dt h r e ed r e b s t r a n s c r i p t i o nf a c t o r si no u rr e s e a r c h ， a n dt h ep h y s i o l o g i c a ls t u d ya l s oi n d i c a t e dt h e yc o u l dp a r t i c i p a t ea n dp l a yr o l ei na b i o t i cs t r e s s r e s i s t a n c ep r o c e s s e s t h e s er e s u l t sw i l lg i v es o m ec l u e sf o rp e a n u tg e r m p l a s mi n n o v a t i o na n d b r e e d i n g ，a n df u r t h e rp r o v i d ep r a c t i c a la n da p p l i c a t i o nv a l u e sf o rd r e b s i nc r o pi m p r o v e m e n t e n g i n e e r i n g k e y w o r d s ：a b i o t i cs t r e s s e s ；d r e bt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ；y e a s th y b r i ds y s t e m ；b i n a r yv e c t o r s ；h o m o l o g y s e a r c h i n g c a t e g o r y ：q 7 8 i v 山东师范大学硕士学位论文 英文缩略表 英文缩写英文名称中文名称 b p c t a b d d h 2 0 d n a e b e d t a e c o l i g u s i p t g k a n l b m s p c r r p m s d s t e x g l u e h y g o d d n t p s d m s o p e g a b a 6 b a n a a l u f c e f b a s ep a i r c e t y l t r i e t h y l a m m o n i u r nb r o m i d e d i s t i l l e d a n td e i o n i z e dw a t e r d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d b c l l i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e s c h e r i c h 肠c o l i i j - g l u c u r o n i d a s e i s o p r o p y l t h i o p d - g a l a c t o s i d e k a n a m y c i n l u f i a & i e r t a l z im e d i u n l m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i a p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t r i s h c l e d t ab u f f e r 5 - c h l o r o - 4 b r o m o - 3 - - i n d o l y l - g l u c u r o n i d e h y g r o m y c i n o p t i c a ld e n s i t y d e o x y r i b o n u c e l e o s i d et r i p h o s p h a t e d m e t h y ls u l f o x i d e p o l y e t h y l e n eg l y c o l a b s i c i da c i d 6 - b e n z y l a m i n p u r i n e a - n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d r i f a m p i c i n c e f o t a x i n 碱基对 十六烷基三乙基溴化铵 重蒸水 脱氧核糖核酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 大肠杆菌 p - 葡糖醛酸糖苷酶 异丙基硫代一p d 一半乳糖苷 卡那霉素 l b 培养基 m s 培养基 聚合酶链式反应 转| 分铸 十二烷基硫酸钠 i r i s h c i e d l a 缓冲液 5 一氯- 4 溴3 吲哚葡糖苷酸 潮霉素 光密度 脱氧核糖核苷三磷酸 二甲基亚砜 聚乙二醇 脱落酸 6 一苄基氨基嘌呤 a 一萘乙酸 利福平 头孢霉素 v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声明的，本栏 可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：导师签字： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权趋可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 签字日期：b o j 军月石e l 导师签字： 签字日期：鑫耳髫月名日 山东师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 引言 干旱、高盐以及低温等极端条件又称为水分胁迫或渗透胁迫，是植物生长过程中所面 临的主要的逆境胁迫因子。植物生长在土壤里，本身不能自由移动，以上多种非生物胁迫 因素，极易通过影响气孔开度，细胞壁或细胞膜成分等生理、生化指标的改变进而对植物 造成伤害，严重影响了作物的产量和种植区域。针对植物的抗性育种，传统的方法一般具 有目的性差、周期性长、工作量大等局限性。基因工程技术的迅速发展及在农业生产中的 广泛应用提高并促进了作物抗逆育种及品质的改善，在提高产量的同时还可减少农业上的 灌溉用水，使作物在干旱和贫瘠的土地上生长出高新品种，从而产生巨大的经济效益【l 】。 目前，对植物抗逆机制的研究及培育作物抗逆新品种已成为广大植物学家和育种学家研究 的主要目标。抗逆基因工程采用的基因大致可分为两类，一类是功能基因，其编码产物主 要包括l e a 蛋白、抗冻蛋白等，同时还包括一些渗透调节因子的合成酶，以及毒性降解酶 等【2 】；另一类是与抗逆相关的、其编码产物参与信号传递途径和基因表达调控过程的转录 因子，主要分为m y b 类、b z i p 类、w r k y 类、a p 2 e r e b p 类和n a c 类五个家族【3 】。其中， d r e b s ( d e h y d r a t i o n - - - r e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n g ，与干旱应答元件结合的) 转录因子可特异 的识别并结合d r e ( d e h y d r a t i o n - - r e s p o n s i v ee l e m e n t ，干旱应答元件) ，进而参与逆境信号的 传递，调控下游逆境应答基因的表达，提高植物在多种逆境条件下的适应性和耐受性，从 而对植物抗性进行综合改良。 1 转录因子的概念 转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，t f ) ，也称为反式作用因子，即能够与真核基因启动子区 域中的顺式作用元件发生特异性相互作用的d n a 结合蛋白或者是能够与这些蛋白相互作 用的相关蛋白。当植物感受外界干旱、高盐、激素、病害时，通过一系列信号传递、激发 转录因子，转录因子与相应的顺式作用元件结合后，激活r n a 聚合酶i i 转录复合物，从 而启动特定基因的转录表达，最后通过基因产物的作用对内、外界信号做出的调节反应【4 】。 植物许多基因的表达都是由特定的转录因子与特定的顺式作用元件相互作用调控的。 2 转录因子的结构 从蛋白质结构分析，转录因子一般由d n a 结合区、转录调控区、寡聚化位点以及核 定位信号四个功能区组成。这些功能区决定转录因子的功能、特性、核定位以及调控作用 等，转录因子通过这些功能区与启动子顺式作用元件结合或者与其他蛋白的相互作用来激 山东师范大学硕士学位论文 活或者抑制基因的表达【5 】。 d n a 结合区是指转录因子识别d n a 顺式作用元件并与之结合的一段氨基酸序列。相 同类型转录因子的d n a 结合区的氨基酸序列较为保守，这些保守的氨基酸序列决定转录 因子与顺式作用元件识别及结合的特异性。 转录调控区包括转录激活区和转录抑制区两种，一般为d n a 结合区以外的3 0 1 0 0 个 氨基酸，有时一个转录因子可含有一个以上的转录调控区，它们决定转录因子功能的差异。 转录调控区一般具有一些典型的特征，如富含酸性氨基酸、富含脯氨酸或者谷氨酰胺等【6 】。 核定位信号区一般是转录因子中富含碱性氨基酸( 精氨酸和赖氨酸) 的结构域。引导转 录因子进入细胞核发挥作用。 寡聚化区是不同转录因子借以发生相互作用的功能区。寡聚化位点的氨基酸序列很保 守，大多与d n a 结合区相连并形成一定的空间构像，如b z i p 转录因子的寡聚化区包括一 个拉链结构，而b h l h 型转录因子含有螺旋环螺旋结构，m a d s 转录因子的寡聚化区则 形成两个a 螺旋和b 折叠。 3 植物中逆境相关的转录因子 根据d n a 结合区域的特点，其中和植物逆境抗性相关转录因子主要分为5 类：b z i p 类、 w r k y 类、a p 2 e i 汪b p 类、n a c 类和m y b 类。 ( 1 ) b z i p 类转录因子 b z i p 转录因子是普遍存在于动植物及微生物中的一类转录因子，都含有一个可结合 d n a 并形成二聚体的结构域。该结构域由两个保守区域组成：一个是由一个富含碱性氨基 酸残基的约2 5 个氨基酸序列组成，它紧靠亮氨酸拉链结构域的n 末端，能与专一的d n a 序 列相互作用；另一个区域是由亮氨酸拉链序列组成，亮氨酸拉链形成一个两亲性的仅螺旋， 该结构为b z i p 蛋白与d n a 结合之前形成二聚体所需 7 】。b z 口类转录因子以识别核心序列 a c g t 的顺式作用元件女i ：i c a c g t g ( g 盒) 、g a c g t c ( c 盒) 、t a c g t a ( a 盒) 等，一些受 光或a b a 诱导的基因的启动子区都含有这些元件。其中g 盒元件普遍存在于受a b a ，生长 素，茉莉酸，水杨酸诱导的基因中，证明它与植物的抗逆性有关。 ( 2 ) w r k y 类转录因子 w r k y 蛋白是近年来发现的一类植物特有的转录因子家族，因在其n 端含有由 w r k y g q k 组成的高度保守的氨基酸序列而得名。在w r k y 蛋白中，存在6 0 个高度保守的 氨基酸区域，其中所有成员均含有w r k y g q k 7 个绝对保守的氨基酸。在保守区域之外， 氨基酸序列差异较大。在拟南芥中，w r k y 家族共有7 4 个成员，主要与植物的抗逆性和衰 2 山东师范大学硕士学位论文 老等生理过程有关。病原菌、伤害和植物激素类物质等多种外界因素均能诱导瞅k y 基因 的表达【8 1 。 ( 3 ) a p 2 e r e b p 类转录因子 a p 2 e r e b p 类是在植物中发现的一个转录因子大家族，包括与调控植物细胞周期、生 长发育以及环境胁迫应答反应等有关的一系列转录因子，家族成员的转录激活区差异很 大，但它们都含有由5 7 7 0 个氨基酸残基组成的非常保守的d n a 结合区( 1 邓a p 2 e r e b p 结 构域) ，而且n 末端都有起核定位作用的碱性氨基酸序列。根据结构的不同，这类蛋白又可 以分成四个亚族：a p 2 类、d r e b 类、e r f 类、r a v 类。近年来的研究表明d r e b 类和e r f 类转录因子在提高植物的抗逆性中发挥着重要的作用。 ( 4 ) n a c 类转录因子 n a c 转录因子是近十年来新发现的植物特有的转录调控因子。1 9 9 7 年a i d a 等首先报道 t n a c 结构域，发现在矮牵牛趔朋基因、拟南芥黝用2 和c u c 2 基因编码蛋白的n 端包含 一段保守的氨基酸序列，取首字母命名为n a c 9 1 。在n a c 转录因子中，最主要的结构特点 是各成员的n 端含有高度保守的n a c 结构域，n a c 结构域由高度保守的大约1 5 0 个氨基酸残 基组成。研究表明，n a c 转录因子在植物生长发育、器官建成、激素调节和防御抵抗多种 生物和非生物胁迫等方面发挥重要作用。 ( 5 ) m y b 类转录因子 m y b 类转录因子家族是指含有m y b 结构域的一类转录因子。m y b 结构域是一段约 5 1 5 2 个氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列。首先是每隔约1 8 个氨基酸规则间隔的色氨酸( w ) 残基，它们参与空间结构中疏水核心的形成。其次，在每 个保守的色氨酸前后都存在一些高度保守的氨基酸，例如在第一个色氨酸的c 末端通常是 一簇酸性氨基酸。根据所含m y b 结构域的数目，植物中的m y b 类转录因子可简单分成3 个 亚类：只含一个m y b 结构的m y b 蛋白亚类成员可能是一类重要的端粒结合蛋白，在维持 染色体结构的完整性和调节基因转录上起重要作用【1 0 】；r 2 r 3 亚类成员含有两个m y b 结构 域，对应于动物中c m y b 蛋白的i 也和r 3m y b 结构域。该类成员数目众多，它们或参与次 生代谢的调节，或控制细胞的分化，或应答激素刺激和外界环境胁迫以及抵抗病原菌的侵 害；r 1 r 2 r 3 亚类成员含有3 个m y b 结构域，与动物、真菌中的r 1 r 2 r 3 m y b 蛋白高度同源， 主要参与细胞周期的控制和调节细胞的分化1 1 】。 4 植物中的d r e b 类转录因子 4 1d r e b s 类转录因子的结构特征 3 山东师范大学硕士学位论文 作为a p 2 e r e b p ( a p e t a l a 2 e t h l e n er e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ，a p e t a l a 2 ， 乙烯应答元件结合蛋白) 家族的一类成员，d r e b s 类转录因子特异的存在于植物中，参与 植物对干旱、高盐和低温等非生物胁迫的应答与响应。d r e b s 类转录因子序列中只含有一 个a p 2 e r e b p 结构域，其中包含y r g 和r a y d 两个保守区【12 1 。y r g 区为n 端富含有 2 0 个氨基酸残基的碱性亲水区，位于第二个b 折叠的第1 4 位和第1 9 位的氨基酸残基分别 为缬氨酸( v 1 4 ) 和谷氨酸( e 1 9 ) ，是与d r e 作用元件相互结合的关键位点，对识别并结合各 类顺式作用元件具有重要作用。r a y d 区位于a p 2 e r e b p 结构域的c 端，其核心区由 大约1 8 个氨基酸残基组成，可形成双亲性的a 螺旋，其主要行使调节转录因子与d r e 顺 式作用元件结合能力的功能，通过影响y r g 保守区的构象或通过与其它蛋自发生相互作 用进而发挥作用【1 2 】。同时，d r e b s 类转录因子在序列中存在一段富含s e r t h r 的区域，在 基因间的磷酸化及相互作用中起重要的作用【1 3 】。 4 2d r e b s 类转录因子的分类与功能 拟南芥基因组测序完成后，s a k u m a 1 4 】等分析了拟南芥中的1 4 5 个a p 2 e r e b p 家族的成 员，并根据a p 2 e r e b p 结构域的同源进化关系将它们分成了4 个主要的亚族，并进一步将 d r e b 亚族分成了6 个小类( a 1 a 6 ) 。而在以后的实验过程中，这种分类的合理性也得到了 大家的肯定。 a 1 类转录因子主要为d r e b l c b f 转录因子，它们是最先被分离出来的一类d r e b 类转 录因子，主要参与低温胁迫信号通路。a 2 类转录因子主要为d r e b 2 转录因子，它们主要参 与高盐、干旱和热激胁迫信号通路。就目前的研究来看，研究最为广泛的也就是a 1 和a 2 d r e b 类转录因子，对其他的几个小类的研究只有零星报道。a 3 类转录因子的一个代表就 是a b l 4 ，研究表明a b l 4 突变能够导致突变体种子对a b a 不敏感，并且近期的实验还发现 a b l 4 能够响应植物质体向细胞核传递的信号，以达到调控核基因表达的目的【”】。对于a 4 类转录因子，目前在拟南芥中只报道了t i n y 【1 6 1 和t i n y 2 1 7 1 ，另外玉米中的z m d b f 2 也被划 分到了这一类【1 8 】。通过对t i n y 2 的研究发现，t i n y 2 不仅能够与d r e 元件特异结合，还能 够与e r e 元件结合，并且还发现该基因的表达不仅受到低温、干旱、高盐的诱导，还受到 a b a 的强烈诱导。另外，对a 5 和a 6 类成员的研究只是停留在个别基因的表达水平的分析 上。 4 3顺式作用元件d r e c r t d r e c r t 顺式作用元件普遍存在于胁迫应答相关基因的启动子中，d r e b s 转录因子 能够特异地识别并结合该顺式作用元件，进而参与调控相关基因的表达及功能行使。 4 山东师范大学硕士学位论文 一般情况下，植物处于干旱、高盐和低温等非生物逆境胁迫下，其体内的a b a 含量 会明显升高，a b a 含量的升高进一步诱导下游一系列抗逆相关基因的表达，但之后的研究 发现有些受内源a b a 诱导表达的基因，如r d 2 9 a l t f 7 眦d ，7 8 、k i n l 、c o r 6 6 k i n 2 、c o r 4 7 r d l 7 、 c o r l 5 a 等，在a b a 缺失或a b a 不敏感的拟南芥突变体中，也可被干旱、高盐和低温所诱 导，表现为a b a 非依赖型表达模式【19 1 。进一步通过启动子缺失实验结合凝胶阻滞分析， y a m a g u c h i s h i n o z a k i ( 1 9 9 4 ) 发现r d 2 9 a 基因的启动子区除了存在a b a 应答元件a b r e ( a b a r e s p o n s i v ee l e m e n t ) ，还存在一个核心序列为c c g a c 的干旱应答元件 d r e ( a t c c g a c t a ) 2 0 1 。同年，一段与d r e 极为相似的序列t g g c c g a c 也被研究者从拟 南芥低温应答基因c o r l 5 a 的启动子区中分离并鉴定出来，称之为c r t ( c r e p e a t ) 元；件【2 1 】。 之后，在r d l 7 、k 1 n 1 和c o r & 6 等拟南芥干旱和低温应答相关基因启动子区、及大麦 ( h o r d e u m 7 9 口r el ) d h n t 2 2 1 、t 菜( b r a s s i c an a p u sl ) b n l l 5 t 2 3 1 、玉米( z s am a y sl ) r a b l f l 2 4 】 和小麦( t r i t i c u ma e s t i v u ml ) v e c s l 2 d 2 5 等胁迫相关基因的启动子区中，d r e 或d r e 核心序 y u ( c c g a c ) 元件均被分离并鉴定。 4 4 拟南芥中的d r e b s 类转录因子 顺式作用元件d r e c r t 的分离并鉴定，揭示出一条a b a 非依赖型的逆境信号传导途 径。进而使相关特异识别并结合d r e c r t 元件，进一步调控下游基因表达的d r e c r t 结合 蛋白的研究也逐渐深入。 # y a m a g u c h i s h i n o z a k i a i b 等于1 9 9 4 年首次在拟南芥的核抽提物中检测到能够与d r e 作 用的蛋白质因子d r b f l 【2 0 1 。之后，转录因子c b f l ( c r e p e a t d r eb i n d i n gf a c t o r1 ) 被 s t o c k i n g e r 等 2 6 】通过酵母单杂交的方法，从拟南芥e d n a 文库中首次分离并进行了验证。进 而g i l m o u r 等【2 7 ) 及l i u 等【1 3 】借助于相似的方法及材料，分别对基因d r e b i a ( 或称c b f 3 ) 、 d r e b l b ( 或称c b f l ) 和d r e b l c ( 或称c b f 2 ) 进行了克隆；并在干旱处理的拟南芥c d n a 文库 中克隆到2 个受干旱和高盐胁迫诱导的转录因子d r e b 2 a 和d r e b 2 b 。n o r t h e r n 杂交结果显 示，这5 个转录因子具有不同的表达模式，在4 处理1 0m i n 内，d r e b l a 、d r e b l b 和d r e b l c 被迅速、强烈的诱导；在干旱或2 5 0m m o l ln a c l 处理下，d r e b 2 a 和d r e b 2 b 基因表达量 在1 0 嘶n 内也明显增强，但它们均不受a b a ( 1 0 0i t m o l l ) 诱导，为a b a 非依赖型。 目前，经序列同源检索，在拟南芥全基因组中发现可能存在6 个d r e b l 转录因子，8 个 d r e b 2 转录因子。s a k u m a 等【2 8 】根据序列专一性，从拟南芥中分离到3 个新的 d r e b i ( d r e b l d 、d r e b l e 和d r e b i f ) 转录因子基因和6 个剃2 ( d r e b 2 c - d r e b 2 h ) 转录 因子基因，通过对这八种转录因子在干旱、高盐、低温以及a b a 处理等多种非生物逆境胁 山东师范大学硕士学位论文 迫下的表达模式进行研究，发现只有d r e b l d 、d r e b l f 、d r e b 2 c 、d r e b 2 d 和d r e b 2 f 在高盐处理下表达量有微弱变化，而d r e b 2 e 的表达受a b a 诱导，表明在d r e b l c b f 和 d r e b 2 胁迫响应中可能存在着表达调控途径的交叉。 4 5 其他植物中的d r e b s 类转录因子