（特种经济动物饲养专业论文）中国猫科动物繁育中心圈养东北虎种群遗传多样性的研究.pdf

摘要 摘要 本研究利用微卫星标记技术，研究了中国猫科动物繁育中心圈养东北虎种群三个世 代( f l 、f 2 、f 3 ) 的遗传多样性。等位基因的数目、有效等位基因数、群体杂合度、多 态信息含量和个体多位点杂合度等指标的分析表明，1 ) 中国猫科动物繁育中心的人工 饲养东北虎在所研究的个体中种群遗传多样性水平较高，但等位基因的频率变动很大， 使遗传多样性处于不稳定状态。2 ) 种群发展过程中，选择性繁殖是造成科一群遗传多样 性丢失的主要原因，引进个体虽然在遏制遗传多样性下降的趋势中初显成效，但其作用 仍需继续发挥，或有计划地引进更多的个体，及时调整遗传管理的目标和方案来稳定遗 传多样性状态。3 ) 现有种群规模庞大是造成不合理繁殖和遗传管理跟不上的主要因 素，应及时将种群分割成异地保护种群和生产性种群，按照不同的目标进行遗传管理。 4 ) 种群的分割和遗传管理必须基于科学合理的分子遗传学分析，按照遗传规律分析、 预测和控制种群的遗传多样性水平，以使异地保护种群能够最大限度保存基因资源，使 遗传上失去保护意义的剩余个体按照特定的方向进行选育，形成优良的生产性群体。 关键词虎，遗传多样性，保护，遗传管理，微卫星 ? 墨 东北林业大学硕士学位论文 a b s t r a c t g e n e t i cd i v e r s i t yo f3g e n e r a t i o n s ( fl ，f 2 ，f 3 ) o fc a p t i v es i b e r i a nt i g e rp o p u l a t i o no f c h i n af e l i db r e e d i n gc e n t e r m o i e c u l a rg e n e t i cp a r a m e t e r s ，i n c l u d i n ga 1 1 e l en u m b e r ，e f f e c t i v e a l l e l e n u m b e r ，h e t e r o z y g o s i t y ，p o l y m o 印h i s mi n f o r m a t i o nc o n t e n ta n dm u l t i p l el o c u s h e t e r o z y g o s i t yi n d i c a t e dt h a t1 ) f 1c o n t a i n e dr i c hg e n e t i cd i v e r s i t y ，b u ts o m ea l l e l e sh a dv e r y l o w 仔e q u e n c yi nf 2a n df 3 ，n e e d ss a l v a g i n gc o n s e r v a t i o n ；2 ) s e l e c t i v eb r e e d i n gw a sak e y f - a c t o ri e a d i n gt ot h ei o s so fg e n e t i cd i v e r s i t y ，a n di n t r o d u c t i o no fe x t e r n a li n d i v i d u a lt ot h i s p o p u l a t i o n d i dn o t e f 佗c t i v e l ys t o p t h ed e c l i n i n gt r e n d t a r g e ta n d s t r a t e g yo fg e n e t i c m a j l a g e m e n tm u s tb ea d j u s t e di nf a v o ro fg e n e t i cd i v e r s i t yc o n s e r v a t i o n 3 ) e x t r e m el a r g eo f p o p u l a t i o ni sak e yf a c t o rr e s u l t i n gi ni m p r o p e rb r e e d i n ga n di n s u 衔c i e n tg e n e t i cm a n a g e m e n t t h ep o p u i a t i o ns h o u l db ed i v i d e di n t oap o p u i a t i o nf o re xs 打“c o n s e r v a t i o na n dap o p u l a t i o n f o rp r o d u c t i o n ，w h i c ha r em a n a g e dw i t hd i f ! 、e r e n tt a r g e t 4 ) d i v i s i o na n dg e n e t i cm a n a g e m e n t s h o u l db eb a s e do nr e a s o n a b l em o l e c u l a rg e n e t i ca n a i y s i st h a tf h n c t i o ni na n a i y s i s ，p r e d i c t i o n a n dc o n t r o lo fg e n e t i cd i v e r s i t y ，s oa st om a x i m i z et h ec o n s e r v a t i o nc a p a b i l i t yo fg e n e t i c r e s o u r c e si np xs f mc o n s e r v a t i o np o p u l a t i o na n dm o v ei n d i v i d u a l sw i t h o u tg e n e t i cs i g n i f i c a n c e f o rc o n s e r v a t i o nt ot h ep o p u l a t i o nf o rp r o d u c t i o na n db r e e di nf a v o ro fp r o d u c t i v et r a i t k e y w o r d st i g e r ，g e n e t i cd i v e r s i t y ，c o n s e r v a t i o n ，g e n e t i cm a n a g e m e n t ，m i c r o s a t e l l i t e l 绪论 1 1 虎濒危的原因和保护 1 绪论 1 1 1 虎的濒危原因 1 1 1 1 人为捕杀 在亚洲历史上，虎吃人的故事不胜枚举，打虎英雄为民除害的故事也屡见不鲜。但是历 史上“虎害”的实际危害程度无从考证，只是近代的一些传说或记录。例如：由于几只东北 虎的骚扰，与朝鲜接壤地区方圆1 5 0 公里范围内的店铺都关门数周，而且当地居民采伐过冬 的烧柴( 主要是木头) 都受到了影响。边境地区一个朝鲜村庄18 口人被老虎杀死【2 | 。在修 筑中国东部铁路时，还雇佣了1 个团的哥萨克人来保卫施工工人【3 】。这个时期老虎经常潜入 窝棚，将住在那里的中国人和俄罗斯人拖走。人们不得不砍伐大片的森林来修铁路，也为人 们居住提供安全的场所【4 】。虽然吃人虎频繁出现，但是一般的吃人虎没有成为“惯犯”的机 会，它们很快就会被当地的猎人打死。到3 0 年代末，因为大规模的捕杀，俄罗斯的老虎都 被压缩到边远山区，仅存2 0 3 0 只东北虎p j 。 尽管如此，人虎的直接冲突发生的频率并不高，远远少于其它自然灾难造成的死亡【6 j 。 但是，老虎伤人会引起人们的恐怖心理，这种恐怖气氛不断蔓延，给社会带来的影响经常远 远超过事件本身的影响。这是人类捕杀老虎的重要原因。所以，在5 0 一7 0 年代，老虎带来的 威胁是必需要消除的。因此，5 0 年代末到6 0 年代在全国范围内开展了“除害运动 ，虎、 豹等大型猫科动物均在“害兽”之列。1 9 6 2 年，寿振黄先生等根据建国以后历年来收购虎 皮虎骨的数量，估计猎虎约1 0 0 0 只。而后来估计到2 0 世纪8 0 年代初期，中国境内被猎杀 的老虎超过4 0 0 0 只。从5 0 年代到7 0 年代，老虎捕获量连年下降，说明“除害运动”是虎 濒危进程中十分关键的因素。 老虎被捕杀的另一个重要因素是虎的全身各个器官和粪便、尿液等都是名贵的传统中药 材，虎骨更是贵中之贵。传统中医药在东亚、东南亚和南亚国家非常流行，比较西方医药 学，人们在滋补、保健等方面更相信传统中医药。因此，全球任何有亚洲人的地区，含有虎 骨的中药都很流行【7 】。据t 凡虾f i c ( 1 9 9 4 ) 统计，中国是一个虎骨生产国、进口国、出口 国和消费国。1 9 9 0 1 9 9 2 年期间曾将2 7 0 0 万单位含有虎成分的中药和酒出口到2 6 个国家和 地区。其中有4 6 万单位来自1 9 8 1 年c i t e s ( 濒危野生动植物种国际贸易公约，c o n v e n t i o n 0 ni n t e m a t i o n a lt r a d ei ne n d a j l g e r e ds p e c i e so fw i l df a u n aa n df l o r a c i t e s ) 在中国生效之前 的库存虎骨；8 6 5 单位来自圈养的老虎；6 2 0 0 单位来自野外捕猎的老虎。另外，在1 9 9 3 年 前9 个月，韩国从中国进口虎骨多达1 5 6 3 k g 。 1 1 1 2 栖息地的破坏 导致老虎濒危的一个非常重要的因素是栖息地的破坏和食物缺乏。栖息地的资源开发对 虎的影响是系统性的。生态系统的稳定性是依靠系统内各个组成部分之间相互依存和制约关 东北林业大学硕：卜学位论文 系来维持的。森林生态系统中，鹿类和野猪等草食动物主要采食林下灌木的枝条和果实，但 是，高大乔木是维持灌木物种在这个系统中存在的前提提供合适的郁闭度、小气候调节、水 源涵养等等。虎在这个系统中存在的理由，一是要有可捕食的草食动物；二是要有灌木等提 供隐蔽条件：三则要有合适的微环境。高大乔木一旦遭到砍伐，首先改变林下植物的组成， 进而改变草食动物的组成。而老虎对食物丰富度的敏感性极高，对隐蔽条件要求也很高。如 果捕食对象的数量减少和隐蔽条件的恶化，势必将老虎逐出该系统。 林间作业，如采伐和开矿等发出的机械声响、采收和运输时的车辆来往等等，都会使虎 逃避。在绝大多数情况下，虎对入主要采取回避态度，极少有食人虎出现【8 j 。因此林间作业 对虎有一种驱赶作用， 5 0 年代初期至今在东北虎的分布区中林间作业强度越来越大，对虎 的压力也越来越大。 在生存需求的问题上，人类与野生动物围绕资源发生着持 x 东北林业大掌坝：l 学位论文 的保护中与关注野生种群具有同等重要的意义。 圈养种群的保护意义可分为两个层次，第一是保存了野生种群的遗传资源，但是种群经 过驯化，完全适应人为设定的新环境，已经失去了重新回到野外的能力；第二是保存了野生 种群的遗传资源，基本能够适应人工环境，但仍保留着野外的适应能力，可以放归野外。这 两类种群在遗传资源保存方面都有一定的贡献，对未来的开发和利用非常有意义。第一类种 群是人工饲养完全成功的种群，可以象梅花鹿一样进行选育，形成某一方面经济性状优秀的 生产性群体。但是，保护的最终目的是要实现野外放归，重建原初的生态系统，恢复系统的 生态调节功能。所以这类种群彻底失去了保护意义。第二类种群人工饲养也获得成功，但并 没有被驯化，通过一定程序的野外适应性训练，可以恢复野外适应能力。这类种群在遗传 上、行为上、生理上都符合保护的目标要求，可成为异地保护种群。 鉴于濒危物种数量的急剧扩大，r l j c n 早在1 9 8 7 年就制订了物种圈养繁育的指导方 针，指出圈养群体作为异地保护的一种最主要的形式，其主要目的是为野外种群提供补充。 根据c n 建议：当一个濒危物种的野生种群数量低于1 0 0 0 只时，应当将人工繁育、异地保 护作为保护该物种的一项措施。制定此方针的基本出发点是许多物种只有在维持野生种群的 同时维持一个人工保护的异地种群，才能保证物种不会灭绝。异地保护具有作用主要在于： ( 1 ) 在生物学和社会生物学基础研究中作为野生个体的代用材料；( 2 ) 取得管理野生种群的经 验，作为野生种群的后备基因库；( 3 ) 为野生环境不复存在的物种提供最后的生存机会；( 4 ) 为在新的生境中创建新的生物群落提供种源。 在野生状态下的物种即将灭绝时，异地保护无疑提供了最后一套保护方案。异地保护是 为了增加濒危物种的种群数量。当异地种群数量增加时，通过不断地释放易地种群的繁育后 代补充野生种群，能增加野生种群的遗传多样性。异地保护中，采用调整群体遗传结构等管 理措施，能减弱随机因素对小群体的影响，并使其有效种群达到最大。 由于圈养保护可以人为地减少或消除在野外时的受危因素，并在食物、水源供应非常充 分，在繁殖上，增加虎交配成功率，减少幼虎的死亡率，使虎的数量逐渐增长，因此圈养虎 种群是保护这种珍稀濒危物种健康发展的需要。 中国在虎人工饲养方面非常成功，在饲料、饲养管理、繁殖、人工育幼、疾病防治等方 面已经积累了丰富的经验。可以说，在中国，老虎的饲养已经具备了规模化生产的能力，可 以象养鹿一样进行定向选育，形成在某一方面的具备优良性状的群体或品种。中国猫科动物 饲养繁育中心1 9 8 6 年有8 只东北虎，到2 0 0 5 年已经超过6 0 0 只，3 月龄成活率达到8 0 9 0 。桂林雄森熊虎山庄到2 0 0 5 年已经发展超过1 0 0 0 只，国内大多数中等以上城市动物园 和野生动物园也都已“虎满为患”。据不完全统计，全国人工饲养老虎超过4 0 0 0 只。由于虎 的利用仍被严格禁止，这给饲养单位带来很大压力，尤其是中国猫科动物繁育中心和桂林雄 森集团两个世界上最大的种群。给这些种群寻找出路是政府主管部门和饲养单位和社会所关 注的焦点。 按照c n 建议的有关标准，对于一个濒危物种，保护的目标是在1 0 0 年内，能够保存 9 0 的遗传多样性。而达到这一目标，对于老虎，只要保存一个1 0 0 1 5 0 只的种群即可，而 东北林业大学硕士学位论文 的野化训练，使其逐渐恢复野外捕食能力( 猫科中心的种群已经获得了部分能力) ，并能够 适应恶劣环境。 如何对待“多余”的老虎是近年来国内外一直争论不休的问题，作为饲养单位，每年都 有一些自然死亡的个体，根据国家法律的有关规定，尸体被完整地包装后冷冻保存起来。以 猫科中心为例，从1 9 9 6 年至今，已经有1 5 0 多具尸体一直保存在冷库中，每年需要投入大 量的维护费用。作为规模庞大的种群，自然死亡会一直持续下去，冷库中保存的尸体也会一 直累加起来，最终成为饲养单位沉重的负担。因此，饲养单位需要妥善处理这些尸体，减轻 经济、管理、安全等方面的负担。要么全部销毁，要么有条件地利用。对于销毁，中国政府 已经出台了一系列相关法规，禁止销毁濒危珍稀动植物。因为，这些物品还可以在科学研 究、公众教育中起到重要作用，这些公益事业对其有很大的需求，销毁这些尸体是巨大的浪 费。如果加以利用，有可能会导致一些非法途径获得的虎产品挤进这个行列，造成鱼目混 珠，对野外种群产生盗猎压力。目前，我国还没有研发出区别野生个体和人工饲养个体的方 法，无法从技术上进行保障，可能受到强大的国际压力。 经过多年的论证、商讨，国家正在研究制定相关的法律条款来解决自然死亡虎的利用问 题。在一定的监控措施下，实施限量、限价、定点利用，暂时规避技术鉴定问题。这虽然属 于个案，但为中国圈养虎的利用发出了一个信号。下一个问题就是如何妥善对待或利用“剩 余”种群。“剩余”种群在遗传上没有保护价值，除了在需要时输出到其他种群，实际上与 饲养的鹿类、环颈雉等动物一样，可以根据情况以适当的方式加以利用。目前看，至少有四 种可以被接受的方式，一是输出给在遗传上需要的种群，二是开发多种旅游、观赏的潜力和 空间，三是为老虎的生物学研究提供实验动物，反过来有助于解决保护种群的一些问题。四 是自然死亡后获得综合利用，而不仅限于骨骼。这部分种群的利用最大的好处是可以为异地 保护种群提供强大的资金支持，使保护可以在所需的任何方向都有条件开展工作。这正是保 护种群发展的最大的限制性因素。如果利用的问题得到允许和肯定，那么利用这些“剩余” 个体可以开展定向的育种工作，在所需要的性状得到定向发展，形成品种或品系，扩展更大 的利用空间。 1 2 中国猫科动物饲养繁育中心种群的特点和问题 2 0 世纪8 0 年代，虎的濒危状况已经举世瞩目，虎产品，尤其是用于传统中医药的产品 供应日趋紧张，国际市场的价格不断攀升。尤其在韩国、东南亚地区更是由于虎产品的紧 缺，把眼光放在南亚、中国和俄罗斯等虎的分布国，一度使野生种群处于盗猎的重压之下。 黑龙江省土畜产进出口公司看准了这种商机，试图通过建立人工饲养种群来生产虎产品，一 方面可以供应国内市场的需求，给国家创造大量的外汇，另一方面也可以缓解野生种群的压 力。于是，在1 9 8 6 年成立了中国横道河子猫科动物饲养繁育中心，从各地引进8 只东北 虎，开始饲养和繁殖的尝试。历经几年的艰苦努力，在以往该公司毛皮动物饲养经验的基础 上，吸收国内外动物园和保护基地老虎饲养的经验和教训取得了成功。到9 0 年代初，就发 i 绪论 展为近百只多只。而且年轻个体占主体，种群发展程明显向上的趋势。 但是，到9 0 年代初期，世界上野生老虎种群全面进入濒危状态，c i t e s 等国际组织加 大了对虎的关注，印度等国在孟加拉虎( p ，桫西姆西) 的保护方面取得了举世瞩目的成 就，种群获得很快恢复，树立了良好的国际形象。我国政府考虑到国内种群的现状，1 9 9 3 年，国务院发布了关于全面禁止虎骨和犀牛角贸易的通知，明确禁止了各类虎产品的使 用和贸易。这给“猫科中心”的饲养繁育和相关产业带来毁灭性的打击，同时，国家不允许 放弃这个种群，而能够提供的支持显得力不从心，于是这个种群就成了一个烫手的山芋。9 0 年代初由于缺乏资金的支持，虎的饥饿、疾病等严重威胁种群的发展。到1 9 9 6 年，种群历 经近1 0 年的发展，已经近1 0 0 只，在年龄组成和性比上仍然处于快速发展的阶段。“猫科中 心”成立了“黑龙江东北虎林园”，开拓旅游市场，通过旅游收入来维持种群的发展，获得 了成功，种群也得到了迅速发展，到2 0 0 5 年5 月，种群已经超过了6 0 0 只。 由于东北虎林园在活动区域上的扩大，使虎有了较大的活动空间。猫科中心在此基础上 开展了一系列野化训练，包括让虎在野外越冬、野外采食、野外自由选择配偶和交配、建立 社群关系等，还以活动物( 主要是牛、羊、兔、鸡、珍珠鸡、环颈雉、梅花鹿等) 投喂，训 练虎的体能和捕食技巧，同时让幼虎观摩成年虎的活动。野化方面取得了很多进展，一部分 成年虎率先学会捕食活动物的技能，然后其他虎也通过学习获得了这些技能：奔跑速度、跳 跃能力、感观灵敏度等有了飞跃性进步，一些成年虎10 年来直在野外越冬，可耐受3 0 0 c 的严寒，抗病力和自我护理的能力明显提高。同时还开展了一系列的心理学、行为学、生 态、生理学、疾病防治等研究，为繁殖虎和野外放归后备个体的选择提供心理学依据。 但是，该种群还存在很多问题，主要表现为： 1 ) 野化训练还不够深入和完善，一是空间场地不够大，野化环境与实际生境还有很大 差距，训练捕食技能还仅处于“演习”水平，距离“实战”很远。另外，对于野外 领域性和野外社群结构还不能得到训练，捕食的猎物仍处于以家畜为主的状况等。 解决这些问题，不是一个饲养单位可能完成的，还需要更多的资金支持、地域支 持、技术支持和政策支持，而目前这些还几乎是零。 2 ) 东北虎种群过大给遗传管理带来难度，种群内遗传多样性状况还不清楚，亟待加 强。种群规模过大，尤其是同胞过多，就会给遗传多样性的评价带来难度。张研 ( 2 0 0 4 ) 通过微卫星检测发现，在一雌配多雄产生的后代中，同窝后代可能来自不 同的父亲，在偌大的种群中，很难仅以谱系记录来评价遗传多样性的变动情况。要 对每只个体进行评价，耗费的时间和财力很大。事实上处于一种混乱状态，需要在 短时间内理清。 遗传管理中，需要监控遗传多样性，并进行动态的评价。如前所述，保护种群 并不需要保留所有的后代，因此，需要在遗传多样性评价的基础上，选择一些个体 组成保护种群，而放弃其余的个体，以便集中精力和财力对其进行有效的管理。这 一工作需要对遗传多样性进行全面、系统评价，本项目的目标就是对该种群3 个世 代遗传多样性进行检测和评价，为制定合理的遗传管理方案提供依据。 东北林业大学颂：l 。：学位论文 1 3 微卫星与种群遗传多样性的检测 1 3 1 微卫星d n a 标记 在真核生物基因组中存在很多串联重复序列，根据重复单位大小和次数可分为卫星序列 ( s a t e l l i t e ) ；小卫星d n a ( m 岫s a t e l l i t e ) 、微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t e ) 1 1 7 1 剐。微卫星d n a 又称为简单重复序列( s 打n p l et a n d e mr e p e a t s ，s t r ) ，是由几个核苷酸( 2 1 0 个) 为重复单位 组成的长达几十个核苷酸的重复序列，如( g a ) n 、( a c ) n 、( g a a ) n 、等，在染色体上呈随机 分布，广泛分布于真核生物基因组。在一个群体中，由于微卫星座位重复次数不同而构成了 多态性。微卫星通常位于基因内含子或基因间隔序列中，产生重复次数的突变和点突变都会 被遗传下来，因此，其多态性程度非常高，而在重复单位的侧翼区，序列则非常保守，有时 在种间都可以达到1 0 0 的同源性。于是，通常在侧翼区设计一对引物来扩增特定的位点， 高精度的电泳可以分辨重复单位重复次数的变化情况。这种保守序列确定的s t r 可以检测 出复等位的差异，表现为共显性【1 9 l 。 1 3 2 微卫星的优越性 微卫星d n a 具有种类多、分布广、高度多态性、杂合性高、重组频率低的特点，在群 体中变异范围大，构成了丰富的长度多态性，有高度的个体特异性，遵循孟德尔共显性遗传 规律。因此，微卫星。d n a 标记是近年来飞速发展的一种遗传标记，具有5 个方面的优越 性：1 ) 微卫星d n a 遗传遵循孟德尔遗传规律，等位基因间呈共显性遗传；2 ) 数量多，平 均每1 0 k b 就有一个微卫星d n a ，且均匀分布在基因组中；3 ) 具有丰富的多态性，每个座 位的杂合度通常为0 3 0 8 ；4 ) 微卫星d n a 在进化过程中所受的选择压力小，如鹿科动物 就大量使用牛科动物的微卫星位点、大型猫科动物的遗传学分析中大量使用家猫的微卫星位 点等【2 6 | 。；5 ) 微卫星d n a 检测容易，省时，重复性好，适合于进行自动化分析。广泛应 用于遗传多样性的检测、物种或品系鉴别、个体识别、谱系关系分析、动植物育种、对疾病 相关基因的定位、分离、克隆和筛选、连锁图或物理图的构建、研究q t l 与性状的相关 性、度量遗传距离、重建系统发生树等。本项目也选择微卫星作为遗传标记来检测该东北虎 种群的遗传多样性状况。 1 4 种群遗传管理中使用的主要分子遗传学参数 种群遗传多样性则由以下几个指标描述：杂合度、等位基因多样性、有效等位基因数、 多态信息含量等3 7 4 1 1 。 1 4 1 杂合度 在一个位点上，杂合子携带着不同的等位基因，就意味着遗传变异的存在。因此，在传 l 绪论 统的遗传多样性度量中，杂合度是一个很重要的指标。对于种群，可以测算单位点的杂合 度、多位点平均杂合度和系统内基因的平均杂合度。多位点平均杂合度用来描述基因位点的 遗传多样性，系统内平均基因的杂合度用来描述一个物种的遗传多样性。 ( 1 ) 单位点杂合度 七 仇= l 一p ? ，之l 其中，p ，为第f 个等位基因的频率，尼为第七个等位基因。在非随机交配群体中，杂合度与 群体内杂合体的实际频率无关。n e i ( 1 9 7 3 ) 认为，即使对非平衡群体，饥仍然是一个群体内 基因变异的理想测度，适合于任何生物。不论是自体受精生物还是异体受精生物：是单倍体 还是多倍体，均为适用【4 2 】。 ( 2 ) 多位点平均杂合度 1，七 = l 一p ? 膏= li = l 式中，为位点数，p 为等为基因频率，七为第尼个等位基因。 ( 3 ) 系统内平均基因的杂合性 出= ， 。j = i 式中s 为系统数( 即物种数) ，h 为第f 个系统或物种的多位点平均杂合度。 1 4 2 等位基因多样性 等位基因多样性是每个基因座上等位基因的平均数量，它也被用来描述遗传多样性的变 化程度。对于多基因座，等位基因多样性( 彳) 是基因座上等位基因的平均数【4 3 】。 a = w n 其中，以为所有基因座上等位基因的总和，位基因座位的数量。 1 4 3 有效等位基因数目 当群体在某个座位处于h a r d y w | e i b e 唱平衡时，其等位基因数量等于有效等位基因数 ( ) 。换言之，某个座位观察等位基因的频率分布相当于该座位处于h a r d y w 色i b e 唱平衡时 的等位基因的数量就是有效等位基因数，可用下式计算： 1 2 万 其中p ，为等位基因频率。 1 4 4 多态信息含量 多态信息含量p i c ( p o l y m o 叩m s mi n f o r n l a t i o nc o m e n t ，p i c ) 是评价一个位点遗传变异程 度的指标( b o t s t c 洒，1 9 8 0 ) m 】： 月 一l” p ，c = 1 一( p ；) 一( 2 p 知；) 东北林业大学硕? 卜学位论文 式中胛为等为基因数，胁、p f 为等位基因频率。 1 4 5h a r d y w d b e r g 平衡 在一个理想种群中，没有个体的迁入和迁出，个体之间发生随机交配，某个座位上的等 位基因频率基本保持不变，此时的状态称为h a r d y w e i b e 娼平衡状态。但是，自然种群中， 尤其是小种群，很难达到理想种群的这些要求，在基因频率上发生偏离理想状态，因此，检 测基因频率与理想状态下的偏离程度是评价一个种群是否发生迁入、迁处、选择交配等的重 要指标。h a r d y w 色i b e 曜平衡符合度检验通常用f 检验。 2 材料与方法 2 材料与方法 2 1 采样 本项目中的样品为健康东北虎的静脉血，采自黑龙江东北虎林园。采集时，首先将东 北虎用适量的氯胺酮麻醉，在尾基静脉或股静脉采集血液3 r n j ，然后用终浓度为 e d t a 抗凝后，4 。c 下暂时保存，当天送到实验室立即提取总d n a 。本研究中共 个个体，参照黑龙江东北虎林园的猫科动物饲养繁殖中心种虎名册，将东北虎 f 2 、f 3 代，基本信息见表2 1 。 表2 1本文分析样品的基本信息表 0 5 m m 的 采集了1 6 4 分为f 1 、 ：! 壅垒! 竺兰：! 望盟! ! 垫! o ! ! 坚璺垡旦望q ! ! ! g ! ! ! 兰坐巳! 墅垒宝垫g 璺翌璺b 兰竺垒 f 1f 2f 3 序号个体编号 序号个体编号序号个体编号 9 0 0 3 1 9 2 0 3 9 9 0 0 2 8 9 0 一0 3 0 9 1 0 3 5 9 4 0 6 1 9 0 0 1 9 9 3 0 5 5 9 0 0 2 2 9 3 0 5 2 9 3 0 5 3 9 2 0 4 0 9 2 0 4 8 9 3 0 5 6 8 8 0 0 2 9 2 0 5 0 9 9 1 3 6 9 7 一0 7 8 9 8 1 1 1 0 2 3 0 9 0 0 1 6 2 0 2 3 0 8 9 7 0 7 9 9 7 0 8 4 9 9 1 4 1 9 7 0 8 1 9 7 _ 0 9 5 9 9 一1 4 8 9 9 1 4 2 0 0 1 6 3 9 7 0 7 7 9 8 1 0 8 9 7 0 8 0 9 6 0 6 9 9 8 9 8 0 0 0 1 2 4 9 0 3 3 2 2 0 1 2 0 4 8 3 8 4 8 5 8 6 8 7 8 8 8 9 9 0 9 1 9 2 9 3 9 4 9 5 9 6 9 7 9 8 9 9 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 0 4 1 0 5 1 0 6 0 2 2 6 1 0 3 3 3 0 0 2 3 1 7 0 3 3 4 4 0 2 2 8 8 0 1 2 4 0 0 3 3 4 0 0 3 3 5 0 0 1 2 3 4 0 3 3 3 5 0 3 3 3 3 0 1 2 5 0 0 3 3 2 7 0 3 3 5 2 0 3 3 5 3 0 1 2 5 3 0 3 3 2 6 0 1 2 5 l 0 2 2 7 2 ( 2 4 0 ) 0 3 3 3 2 0 2 2 8 9 0 3 3 4 9 0 3 3 3 9 0 2 3 1 5 坦甜 博侉扒龙躬m药拍卯船力如引驼弘弘驺拍”弘”知 2 3 4 5 6 7 8 9 m 眩b m 巧m 东北林业大学硕：l 二学位论文 2 3p c r 引物的选择 根据徐艳春的报道【4 5 】，选择1 4 对微卫星位点引物用以扩增东北虎基因组d n a ，如表 2 - 2 。所选择的微卫星位点的重复单位分别为2 b p 、3 b p 和4 b p 。上游引物都经过荧光素的标 记，在激光检测时可发出蓝色( f 删) 、绿色( j o e ) 和黄色( t a m a r a ) 荧光，下游引物 不标记。引物全部由博雅生物技术公司提供，都经过p a g e 纯化。 表2 - 2 扩增虎微卫星位点的引物 ：! 鱼垒堡三二兰! ! i 坐星空坠! 鲤鱼璺坐卫! ! 垒墅垒竺! 堕! 避! 堡堡塑塑堡! 坐竺! 殳堕 位点上游引物 下游引物 霎霆 荧光标记 l o c u s f o n v a r d 州m e r r e v e r s ep r i m e r 翠1 芝 f i u m o t l f 2 4p c r 条件 本研究所有位点的扩增条件基本相同，均采用1 0 “l 体系，组份如表2 3 。t a qd n a 聚 合酶、b u 航r 、d n t p ，由上海s o n g o n 公司提供。基本扩增程序：1 个循环：9 3 。c3 m i n ；1 0 个循环：9 4 。c 1 5s 、5 5 。c 1 5s 、7 2 。c 3 0 s ：2 0 个循环：8 9 。c 1 5 s 、5 5 。c 1 5 s 、7 2 。c 3 0 s ：1 个 循环：7 2 。c l o m i n 。p c r 在9 7 0 0 型扩增仪上进行。 3 结果 3 结果 3 1 微卫星位点的扩增结果 本研究采用荧光引物标记技术扩增了1 4 个微卫星位点，用a b ip r i s m3 1 0 0 型全自动 d n a 测序仪分析扩增产物的片段大小。每个位点均显示良好的扩增效果和高度多态性，见 图3 1 。 姗 硼 图3 - 1 部分样品微卫星位点毛细管电泳图 f i g u r e 3 - 1p c rp r o d u c to fm i c r o s a t e l l i t e si s o l a t e db yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 东北林业大学硕士学位论文 3 2 微卫星位点观察等位基因数 东北虎的3 个世代在1 4 个位点上检测出7 8 个等位基因，各个位点的等位基因数如表 3 1 ，1 6 4 个个体的1 4 个微卫星位点的基因型如表3 2 。 从表3 1 可以看出，在同一个微卫星位点上3 个世代所观察等位基因数是不同的。这 是由于在同一个位点上，3 个世代中检测到的大多数等位基因在每个世代中分布并不均匀， 即一个等位基因在一个世代中存在，在另一个世代中并不一定存在。例如：在f 5 3 位点 上，在f 1 、f 2 、f 3 世代中实际观察等位基因数分别为5 、6 、7 ，但该位点总共观察到的等 位基因为7 个。1 4 个微卫星位点平均每个位点检测到的等位基因数目为5 8 个，其中f 3 代最高数目平均每个位点等位基因数目为5 6 个，f 2 代次之为5 2 个，f 1 代最少为4 4 个。 在1 4 个微卫星位点中等位基因数目最多的位点是f 4 1 ，均为1 1 个，等位基因数目最少的 位点是f c a 0 7 4 ，为2 个。 表3 1 ：东北虎3 个世代观察等位基因数目 位点 f 1f 2f 3 笆笆8 a 粤笆a 日 、寸一、寸 固日笆笆笆 a a 笆 a a a a 日巴 笆u 笆粤 a 固a a 日a 笆固笆笆笆a a 笆8 a 笆a 笆 笆 、唾一z q u a 凸 q uu 鬯。 鬯鬯鬯u q 鬯鬯u q e a | l 磐8 a a 哄u彳一彳 u q 色口d 山出彳出彳廷皿 已一 d 山 皂山黾山 出彳 色u妊山露z 哄叫彳r 、寸 z z 出、寸 出、寸皂衄 咚u世q口 v 国。 皂 u v 丑 鬯 a d ，q u 巴 u u v 鬯u 世 g z r q j u 鬯岫 u i 正 m 芒。 出灿 o u v 鬯u a 丑u 、寸2 p u 巴一 d 孑 q 】u 匙k 望 g a u 世“ a u u d d u u u u 山m u u u 、u 山叫u 笆 l u 臣 g u 世皿 u u z z m c u 鲤灿 o r 、寸 、，miq k o u u u 世 o u v 丑u a a u q u 世凸 u u u叫q】 u u u u 世皿 丑 鬯 世 世o g 鬯o d o d u q q目a q qa a q q a 巴 日口oe da q oa o 笆 a q 笆a d a 口q qa uq z 一彳 z za 彳一么 丑 彳一、嘻 a 丑 a q 日 、寸一、寸彳2咚 趔 q 丑 a 、， 彳一彳a 目口么r 彳z 2 8 管 e o d 叫 v 哄u 9 殳o e q 仑u 掣u a u 咚o u ud u u u逭u 鬯u鬯u山ud u | o 、uq u 山ud u o u q uo ua d uu色。皿u i u u n k q a d o n 皿 q q a d 山 盆 u 日 d u 盆 一 皂、， 世u n q u a 巴u n 山 g a u n k g 丑 山 2 趔 日 2 1 o 鬯 色。 一k q u 电 曼u 三 一8 a d q i d q 丑 d 山 i d u 丑 廷u 一皿 丑 皂山 一皿 1 丑 一山 一b 固 u 匠 v i 山 g 一皿 u m 岂 山u 一山 一m i 匙u 一 一i a d 口 一 i q 皂 o 山 一 o u q bb 口l 一l o i l (c 口i d o 一o ，do d 、h o _ ，d n h o 一o d i i n l bo e z 尹p p n ene ，e 甬 ee o do ddo d口d b d 口，do o音 b 音口、o，ddd口do 口d bn o dn do c o o亩 口，d 0 o dd口o d 。o p f c nn n d q eon c e，eo ，e，e口，fo on 亩n fo nn 夕pp 尹b 呈罗 n 尹p nn n、nn 、c 尹矛n eo e f，f o f四f f 吲 o ff 1 田f四f f ，qf 吲f ，喇f 叫 m o口efm e 璺卅 田f mo 卅 璺卅 ，f f 唧 o y 司，ff 吲m ，e d q f 口f 口on d o f o d 田e 口en e n dn dn 商o ，dnc，e 巾f o e ne d田c f oe n o d亩 田n ，d n dn d o nb n 尸r 罗芦一尸罗r 尸尸一芦尸一7 尸一罗 p pp pnn ，em 尸r 尸 e 尸一芦 e 芦一罗7 一芦罗一尸 矽r 夕e 矿一尹 eb 罗r 少 n e 尸矛 口f尸矛罗矛 a a ( q 一 e fff 吲f 叼 亩 厂fo f口f 尸r 罗d 尸矛尸矛 口f口f f 1f 1 o f f 叼 f 唧叼，f 璺卅 f 1尸矛 o h 罗r 芦 罗一罗芦r 罗 b p | cde e甬e亩n n d n o 罗r 罗 尹一夕 罗r 7尸一罗尸r 罗矿r 尸罗一尸尹一y 亩 面，b品_，b一bp nn bb bb 四 四，b亩，b 田，bnn b bbbbb亩田田亩 ，b，b_ ，bbb田b bbbb田b b，b亩b田、 ，b 田，bbb b四bb四bb四田 _ ，b，b品田bbbb a | | a q 彳一幺 a 巴 8 a a 日雩8 日a 巴日a 巴目巴8 a 笆a 日a 8 笆a 彳一、寸a 、，8 曾、，u 笆a 、，u u u g 望u 固笆笆、a a 笆 a 笆固笆 巴 8 笆a 8 日 鬯 u q u q a ua u a q q u u z q o0 ua uq u望uq u a 丑 q q q e 0 q q q 殳 咚山 彳一彳 = i 山世 h 山丑鬯、，a qd q丑q 出、寸世q a q a 凸d o丑o出z h 凸a 出彳 掣、寸 h 山皂皿廷d 皿 d q d q 丑o 掣彳h h 皿 、畸一、寸 世山 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