（应用化学专业论文）流动注射化学发光法测定药物和蛋白质的研究及应用.pdf

济南大学硕 j 学位论文 摘要 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) ，是化学反应体系中某些物质分子，如反应物 质、中间体或者生成物吸收了反应释放的能量由基态跃迁至激发态，然后再从激发态 返回基态时，产生的光辐射。当与流动注射联用时，可使其具有灵敏度高、线性范围 宽、设备简单、操作方便、分析速度快、易于实现自动化等优点，越来越多地应用于 分析各领域。将流动注射化学发光用于药物分析和生物大分子分析不仅具有理论意 义，而且还有重要的实用价值。青霉素是抗菌素的一种，是第一种能够治疗人类疾病 的抗生素。阿莫西林是半合成的氨苄西林类抗生素，其抗菌谱广，作用强，疗效高， 毒性低，临床应用广泛。氧氟沙星是目前广泛应用于临床的第三代喹诺酮类药物，主 要用于呼吸道、泌尿道、肠道、皮肤、关节以及软组织等多种系统的感染。吲哚乙酸 是一种广泛存在于植物体中的植物生长素，在植物生长过程中起着重要的作用。青霉 胺是青霉素的代谢产物，主要用于类风湿关节炎及硬皮病的治疗。蛋白质是构成生物 体细胞组织的重要成分，与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、 遗传等密切相关。 本文共分为七部分，第一部分综述了流动注射化学发光法的研究及应用。 在论文的第二、三、四部分采用i 删n 0 4 槲皮素体系分别测定了青霉素g 钾、阿 莫西林、氧氟沙星。实验发现，在酸性介质中，k m n 0 4 氧化槲皮素能产生强的化学 发光，青霉素g 钾、阿莫西林、氧氟沙星的降解产物能抑制k m n 0 4 槲皮素体系的化 学发光，据此分别建立测定青霉素g 钾、阿莫西林、氧氟沙星的化学发光分析新方 法。在最佳实验条件下，青霉素g 钾、阿莫西林、氧氟沙星的线性范围均为 1 o 1 0 一2 o 1 0 7 9 m l ，检出限( 3 6 ) 分别为6 7 1 0 母g m l ，6 2 l o 。9 m l ，7 1 l o 。9 9 1 1 1 l ， 对机理进行了初步探讨。 在论文的第五、六部分采用k m n 0 4 体系测定了吲哚乙酸和青霉胺。实验发现， 在酸性介质中，l 刚n 0 4 氧化吲哚乙酸和青霉胺能产生微弱的化学发光，h c h o 的存 在可使发光强度大大增强，据此分别建立测定吲哚乙酸和青霉胺的化学发光分析新方 法。在最佳实验条件下，吲哚乙酸和青霉胺的线性范围分别为1 0 l o 一2 o 1 0 。6 咖l 和1 o x l o 。7 - 4 o 1 0 。6 9 m l ，检出限分别为9 o 1 0 。9 咖l 和1 6 l o 8 咖l 。 在论文的第七部分采用n b s 荧光素体系测定了蛋白质。实验发现，在碱性条件 下，n b s 氧化蛋白质，荧光素作为能量转移剂，在c t m a b 的增敏作用下产生化学 v 流动滓射化学发光法测定药物和蛋白质的研究及府用 发光，建立了一种测定蛋白质的化学发光分析新方法。在最佳实验条件下，卵蛋白、 牛血清白蛋白、牛血红蛋白线性范围分别为：4 0 1 0 一4 0 l o 。5 9 m l ， 2 o l o 2 o 1 0 。5 m l ，1 0 l o 。6 1 0 1 0 4 m l 。检出限分别为3 7 1 0 8 咖l ； 6 2 1 0 。8 9 m l ；2 4 1 0 7 9 m l 。 关键词：化学发光；青霉素g 钾；阿莫西林；氧氟沙星；吲哚乙酸；青霉胺；蛋 白质 济南大学硕十学位论文 a bs t r a c t c h e m i l 啪i n e s c e n c e ( c l ) i sd e 6 n e da l st l l ep r o d u c t i o no fe l e c t r o m a g n e t i c ( u l t r a v i o l e t ， v i s i b l eo rn e a r - i r a r e d ) r a d i a t i o na sar e s u l to fac h e m i c a jr e a c t i o ni nw l l i c ho n eo ft h e r e a c t i o np r o d u c t so c c u r si na ne x c i t e ds t a t ea n de m i t sl i 曲tw h e nr e t u n l i n gt oi t sg r o u n d s t a t e w h e nc h e m i l u m i n e s c e n c ei sc o m b i n e dw i t hn o w i n j e c t i o na l l a l y s i s ，f i c la n a l y s i s c a l lp r o v i d es i m p l ec h e 印o p t i c a ls ys | t e m sr e q u i r i n gn ol i g h ts o u r c e s ，l l i 曲s e n s i t i v i t y ，l o w d e t e c t i o nl i m i t ，谢d el i n e a rd y n a m i cm i l g ea n di n e x p e n s i v ei n s t n l m e n t s ，m o r ea n dm o r e u s e di 1 1m a l l ya r e a u so fa l l a l y s i s f i c li su s e df o r d r u g sa n a l y s i s a n db i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l e sa 1 1 a l y s i s ，n o to n l yo ft h e o r e t i c a ls i g l l i f i c a n c e ，b u ta l s oh a v ei m p o i r t a n t p r a c t i c a lv a l u e p e n i c i l l i ni s a na n t i b i o t i c ，w h i c hi st h ef i r s ta n t i b i o t i ct o 。t r e a t eh u 】n a n d i s e a s e s a m o x i c i l l i ni sas e m i s y n t h e t i ca l l t i b i o t i c s ，i th a sb r o a ds p e c t l l j ma 1 1 t i m i c r o b i a l e f f e c t ，e m c a c yo fh i 曲，l o wt o x i c i t ya 1 1 db r o a dc l i n i c a l 印p l i c a t i o n o n o x a c i ni st h et h i r d g e n e r a t i o no fd m gk e t o n e s ，m a i n l yf o rr e s p i r a t o 巧t r a c t ，嘶n a r yt r a c t ，硫e s t i n a j ，s k i n ，j o i n t s a 1 1 ds o rt i s s u ei n f e c t i o n sa n ds oo n i n d o l e a c e t i ca c i di sa i la u x i nw 1 1 i c hw i d e l ye x i s t si nt h e p l a n t ，a 1 1 di tp l a y sa ni m p o n a n tr o l ei nm ep l a i l t sd u r i n gt h e i rg r o w t h p e i l i c i l l 锄i n ei sa m e t a b o l i t eo fp e n i c i l l i n ，i ti s m a i n l yu s e df o rr h e u m a t o i da n “t i sa n ds c l e r o d e m a 骶锄e m p r o t e i ni sa ne s s e n t i a lc o m p o n e n to fc e l l sa n dt i s s u e s ，i ti sc l o s e l yr e l a t e dw i t h n u t r i t i o nm e t a b o l i s m ，c e us t r u c t u r e ， e n z y m e s ，h o r n l o n e s ，v i r u s e s ， i m m u n i z a t i o na n d p h y s i c a l 劬c t i o n i n g t h i sm e s i sf o c u s e do nt l l e d e v e l o p m e n to fn e wm e a n so fc h e m i l u m i n e s c e n c et 0 e s t a b l i s hm e t h o df o rt h eq u a n t i t a t i v ed e t e m l i n a t i o no fm a t e r i a l sa b o v e m e n t i o n e d w e s t u d i e dt h ei n t e r a c t i o nm e c h 枷s m ，p r e l i m i n a d ， t h i st l l e s i si n c l u d e ss e v e np a r t s i nt l l ef i r s to ft h i s t h e s i s ，w es u mu pt h e n o w i n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c er e s e a r c ha n d 印p l i c a t i o n t h es e c o n dt h i r da n df o u n hp 矾s 、耽f o u l l dt h a tp o t a s s i 啪p e m a u l g a l l a t ec a nr e a c t 、v i t h q u e r c e t i nt op r o u d u c eh i 曲c h e m i l u m i n e s c e n c ei n t e n s i t ) ri nt l l ea c i d i cm e d i u m ，t h e d e g r a d a t i o np r o d u c to fp e n i c i l l i ngp o t a s s i 啪，锄o x i l i na n do n o x a c i nc a ni n h i b i tt h e c h 锄i l u m i n e s c e n c e i n t e n s i t yo fp o t a s s i u m p e 咖a n g a n a t e - q u e r c e t i ns y s t e m u n d e r o p t i m 啪c o n d i t i o n s ，t 1 1 el i n e a rr a n g ei s1 o 1o 一2 o 1o 。7 m lf o rp e n i c i l l i ng p o t a s s i 啪， v i i 流动沣射化学发光法测定药物和蛋门质的研究及应用 锄o x i l i na n do n o x a c i n 1 1 1 ed e t e c t i o nl i m i ti s6 7 1 0 9 9 m l ，6 2 1 0 - 9 舢，7 1 1 0 - 9 m l ， r e s p e c t i v e l y a n dw e c o n d u c t e dap r e l i m i n a r y 咖d yo nt l l em e c h a n i s m i nt h ef i f u la i l ds i x t hp a n s 、ef b u l l dt h a ti n d o l e a c e t i ca c i da n dp e m c i l l a n l i n ec a l lr e a c t w i t l lp o t ；a s s i 啪p e m l a n g a n a t ei na 1 1a c i dm e d i 啪t op r o d u c ec h e m i l u m i n e s c e n c e ，w h i c hi s g r e a t l ye n h a n c e db yf ；d 珊a l d e h y d e u n d e ro p t i m 啪c o n d i t i o n s ，t h el i n e a rr a n g eo f i n d o l e a c e t i ca c i da n dp e n i c i l l 锄i n ei s1 o 10 一一2 o 1o 6 咖la n d1 o lo 一4 o lo 。6 咖l ， r e s p e c t i v e l y t h ed e t e c t i o nl i m i ti s9 o 1o 9 9 m la n d 1 6 1o + 8 9 m l ，r e s p e c t i v e l y i nt h el a s tp a r tw ef o 蛐dt l l a tp r o t e i nc a nr e a c t 诵t hn - b r o m o s u c c i n i m i d ei na l k a l i n e m e d i 啪 u s i n g f l u o r e s c e i n a s e n e r g ) ， t r a n s f e r ，、v h i c h i s e i l h a n c e d b y c e t y l 埘m e t h y l 锄m o n i u mb m m i d e i nt 1 1 e m o s to p t i m i z e de x p e r i m e n 组lc o n d i t i o n s ，t h e l i n e a u rr 锄g ew a u s4 0 l o 4 o 1 0 。5 咖lf o re g gp r o t e i n ，2 0 1 0 - 2 o 1 0 。5 m lf o rb o v i n e a l b u m i na n d1 0 10 击1 o 1o - 4 咖lf o rb o v i n eh e m 0 9 1 0 b i n t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s 3 7 1 0 。8 9 m l ，6 2 x 1 0 。8 9 m l ，2 4 1 0 。7 m l ，r e s p e c t i v e l y k e y 、v o r d s ： c h e m i l 姗n i n e s c e n c e ； p e i l i c i l l i ngp o t a s s i 啪； 锄o x i c i l l i n ； o f l o x a c i n ； i n d o l e a c e t i ca c i d ； p e n i c i l l a m i n e ；p r o t e i n 流动注射化学发光泫测定药物和蛋门质的研究及戍用 c l f i n b s c t m a b d n a r n a b s a e a h b i a a i 彳 比l 龇l 符号说明 化学发光 流动注射 n 溴代丁二酰亚胺 十六烷基三甲基溴化铵 脱氧核糖核酸 核糖核酸 牛血清白蛋白 鸡蛋清白蛋白 牛血红蛋白 吲哚乙酸 荧光强度 吸光度 化学发光值 加入样品后化学发光变化值 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：岱掐聋 日期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借鉴；本人授权济南大学可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保 存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：俘搦争导师签名： ，ul h it 智嚯 f 日期：瑚o7 i 够2 护 济南大学硕十学位论文 第一章绪论 青霉素是抗菌素的一种，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素有钾盐、 钠盐之分。钾盐不仅不能直接静注，静脉滴注时，也要仔细计算钾离子量，以免注入 人体形成高血钾而抑制心脏功能，造成死亡。阿莫西林( a m o x j c i l l i n ) 是半合成的氨苄 西林类抗生素，主要用于治疗流感杆菌，痢疾杆菌，大肠杆菌，伤寒杆菌，变形杆菌 等引起的泌尿系统、呼吸系统、胆道等的感染，其抗菌谱广，作用强，疗效高，毒性 低，临床应用广泛。氧氟沙星( o n o x a c i n ) 是目前广泛应用于临床的第三代喹诺酮类药 物，主要用于呼吸道、泌尿道、肠道、皮肤、关节以及软组织等多种系统的感染。吲 哚乙酸( i n d o l e a c e t i ca c i d ，i a a ) 是一种广泛存在于植物体中的植物生长素，与植物生 长发育的规律和代谢过程的调控有密切关系，在植物生长过程中起着重要的作用。青 霉胺是青霉素的代谢产物，它作为一种抗风湿药，主要用于类风湿关节炎及硬皮病的 治疗。蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一 来源，具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、 病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关。因此，在化学中对上述物质的分析检测具 有重要的意义。 化学发光( c h e m i l 啪i n e s c e n c e ，简称c l ) 是化学反应中释放的化学能致使系统中 基态分子跃迁到激发态，再由激发态返回基态时所产生的光辐射，已经证明是一种有 用的现象，并且在分析化学上得到广泛应用【1 】o 自从l9 2 0 年，g m b e r g 【2 1 首先报道了 酸性0 4 作为化学发光试剂的用处，化学发光法在化学上得到快速地发展。流动 注射( f i ) 是在非平衡状态下完成试样的在线处理与测定的定量流动分析技术，是一种 技术上日益成熟并得到广泛应用的进样手段。将流动注射与化学发光法相结合的流动 注射一化学发光( f i c l ) 分析法已广泛地应用于无机物和有机物的分析中。本论文利用 化学发光法测定了青霉素g 钾、阿莫西林、氧氟沙星、吲哚乙酸、青霉胺和蛋白质。 本章主要介绍流动注射化学发光法的原理、特点、体系和应用进展以及论文的 主要内容和特点。 流动注射化学发光法测定药物和蛋自质的研究及府用 第一节流动注射化学发光分析法的应用进展 1 1 化学发光分析的原理 化学发光是指吸收了化学反应能的分子由激发态回到基态时所产生的光辐射现 象，广义的化学发光也包括电致化学发光【3 1 。一个化学反应要产生化学发光现象，必 须满足以下条件：第一是该反应必须提供足够的激发能，并由某一步骤单独提供，因 为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光；第二是要有有利的 反应过程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态；第三是激发态 分子必须具有一定的化学发光量子效率释放出光子，或者能够转移它的能量给另一个 分子使之进入激发态并释放出光子。 化学发光反应之所以能用于分析测定，是因为化学发光强度与化学反应速度相关 联，因而一切影响反应速度的因素都可以作为建立测定方法的依据。 化学发光反应一般可表示为： a + b c ( 1 ) c 一c + 办1 ， ( 2 ) 化学发光强度( 七l ) 取决于反应的速度( 廿饱，) 和化学发光量子效率( 吼l ) 。 比l ( 力= 理k l d 列出( 3 ) 式中吼l 可表示为：吼l = 卿痧f ，其中研为生成激发态产物分子的量子效率，研为激 发态产物分子的发光量子效率。 对于一定的化学发光反应，吼l 为一定值，其反应速度可按质量作用定律表示出 与反应体系中物质浓度的关系。因此，通过测定化学发光强度就可以测定反应体系中 某种物质的浓度。原则上讲对任何化学发光反应，只要反应是一级或假一级反应，都 可以通过公式( 1 ) 进行化学发光定量分析。例如，在上述化学发光反应中，如果物质b 保持恒定，而物质a 的浓度变化并可视为一级或假一级反应，则： 尼l - j 尼l ( d d f = j 口k l d 爿( f ) d f 】d 户吼l “( 4 ) 即化学发光强度与a 的浓度成正比。 化学发光分析测定的物质可以分为三类：第一类物质是化学发光反应中的反应 物；第二类物质是化学发光反应中的催化剂、增敏剂或抑制剂；第三类物质是偶合反 应中的反应物、催化剂、增敏剂等。这三类物质还可以通过标记方式用来测定人们感 兴趣的其他物质，迸一步扩大了化学发光分析的应用范围。 2 济南大学硕j 二学何论文 1 2 流动注射化学发光分析法的特点 化学发光( c l ) 分析法具有高灵敏度和宽的线性范围、仪器简单等优点，但由于 c l 现象一般比较短暂且随时间变化比较大，在使用间歇式手工操作时较难取得良好 的精度，而流动注射系统却极适用于这类反应【4 】。f i c l 分析法在保持c l 法优点的 同时，也具有自己的优点：( 1 ) 装置简单，f i c l 分析所用的分析装置比较简单，无需 复杂的分光元件和光强测量装置，操作方便，可以自行组装：( 2 ) 灵敏度高，一般在 n g - p 眺数量级，对于一些无机离子测定下限达到1 0 p g l ，比光度分析低了4 个数 量级；( 3 ) 线性范围宽，发光强度与待测物浓度可在4 5 个数量级范围内呈线性关系； ( 4 ) 重现性好，在f i 条件下，试样与试剂在流动中高度重现地混合，显著提高了分析 结果的重现性。 1 3 化学发光反应体系 1 3 1 鲁米诺类( 1 u m i n 0 1 ) 化学发光体系 鲁米诺( 3 一氨基邻苯二甲酰肼) 属于酰肼类有机化合物，性质稳定，结构简单，易 于合成，无毒，不污染环境，且水溶性较好，是使用最早、应用最广泛的酰肼类化学 试剂之一，至今仍是研究最多、应用最广的化学发光试剂。在强碱性溶液中可以被氧 化剂氧化而处于激发态，激发态发射蓝光同时回到基态。鲁米诺化学发光光谱的最大 发射波长位于4 2 0 1 1 i i l 至4 5 0 啪之间，其发光反应会在开始的数秒内即达到最大峰值 又迅速衰减。在静态体系中，鲁米诺发光大约可持续1 0 0 秒左右。基于化合物对鲁米 诺化学发光反应的增强或抑制作用，可测定对化学发光具有增强或淬灭作用的化合 物【5 1 。 利用鲁米诺发光体系可测定很多物质。通常情况下，所采用的氧化剂是过氧化氢， 鲁米诺与过氧化氢的化学发光反应相当缓慢，但当有某些催化剂存在时，反应非常迅 速。最常用的催化剂是某些金属离子，在很宽的浓度范围内，金属离子浓度与发光强 度成正比，从而可对某些金属离子进行化学发光分析。利用这一反应也可以分析那些 含有金属离子的有机化合物，达到很高的灵敏度。例如在药物分析中，也可利用金属 离子对鲁米诺化学发光反应的催化作用对某些药物进行直接或间接的测定【们。 鲁米诺发光体系一般由发光剂、氧化剂和催化剂组成。发光剂与氧化剂发生化学 反应而发光，催化剂的加入能加快这一反应的进行。l9 8 2 年c a n e r 等发现，当向鲁米 诺化学发光体系中加入6 羟基苯并噻唑及其衍生物( 如2 氰基6 一羟基苯并噻唑) 时，该 3 体系的化学发光强度可提高1 0 0 0 倍，发光时间也延长几小时。他们将此发光现象称为 增强化学发光，将6 一羟基苯并噻唑及其衍生物称为增强剂。1 9 8 5 年l “c k a 等发现对位 取代的苯酚类化合物( 如对碘苯酚和对苯基苯酚) 可以显著增强过氧化物酶一l 啪i n o l h 2 0 2 体系的化学发光，而且增强效果优于6 羟基苯并噻唑及其衍生物，这类增强剂的 增强作用均与苯环上的羟基及酚羟基有关，所以称其为酚类增强剂；此外，人们还发 现了胺类物质和苯基硼酸衍生物也可以增强化学发光。鲁米诺类发光衍生化产物可大 大增加发光强度，但发光强度受到苯并噻唑的荧光结构性能影响较大【7 1 ，因此应用受 至0 了一些限铝0 。 1 3 2 光泽精类化学发光体系 光泽精州，n 二甲基二吖啶硝酸盐) 是第一个被发现有化学发光性质的吖啶类化 合物，光泽精的化学发光对p h 值的要求比较严格，同时发光反应的持续时间更长。 现在研究和应用较多的是吖啶酯化合物，这类化合物在有h 2 0 2 和o h 存在下能迅速 产生化学发光。有报道称，光泽精化学发光体系比传统的黄嘌呤黄嘌呤氧化酶发光 体系更稳定1 8 j 。 光泽精以硝酸盐的形式存在，在碱性条件下被过氧化氢氧化产生强的化学发光， 被氧化成四元环过氧化物中间体，而后裂解生成激发态的吖啶酮而发光。 光泽精可在一些还原物质存在的情况下产生化学发光，因此该化学发光试剂主要 被用于无机还原剂和有机还原剂的测定。大多数化学发光反应在无催化剂作用下是一 个非常缓慢的氧化反应，光泽精发光体系亦是如此。当分别选择s n 、f e 2 + 、u 3 + 等 金属离子作为催化剂时，光泽精发光体系的发光速率急剧加快，发光强度也随之增强 【9 】。被增强的发光强度与金属离子的浓度有良好的线性关系，从而建立了测定痕量金 属离子的化学发光分析方法。 以光泽精为化学发光试剂，研究发现了测定f e 2 + 、抗坏血酸等的新方法，与鲁米 诺方法相比，改善了灵敏度和选择性，取得了较好的实验效果。与应用最广泛的鲁米 诺相比，光泽精有以下优点：( 1 ) 光泽精的发光体n 甲基吖啶酮比鲁米诺的发光体3 氨基邻苯二甲酸发光更强、发光效率更高：( 2 ) 光泽精的化学发光对某些还原剂非常 敏感，如抗坏血酸、肌酸酐、尿酸、葡糖醛酚，检出限一般为1 1 0 岬o l ；( 3 ) 含q 羟 羰基的化合物与光泽精会发生强烈的化学反应，如甘油、羟基乙醛、二羟基丙酮酯等。 4 济南大学硕上学位论文 1 3 3 过氧化草酸酯化学发光体系 过氧草酸酯( p e r o x a l a t e ) 类化学发光体系最早发现于2 0 世纪6 0 年代，最初主要用 于军事目的，后来逐渐转入民用。过氧草酸酯类化学发光体系有几种要素化合物，即 荧光剂、草酸酯、过氧化氢、催化剂。这种发光体系除了能用于制造各种冷光源外， 还广泛应用于各类化学发光分析。与鲁米诺及其类似物化学发光体系相比，主要优点 是量子产量高，因而具有较高的灵敏度，金属离子和氧分子干扰少。 过氧化草酸酯类化学发光反应是在合适的荧光化合物( 增敏剂) 的存在下，过氧化 氢诱导氧化芳香基草酸酯而发光的过程。发光的情况与增敏剂特性有关而与化学发光 试剂种类、性质无关。化合物被过氧化氢氧化时会产生化学发光，其发光现象最早于 1 9 6 3 年被c h a n d m s s 发现。典型的过氧化草酸酯化合物有双( 2 ，4 二硝基苯基) 草酸酯 ( d n p o ) 、双( 2 ，4 ，6 三氯苯基) 草酸酯( t c p o ) 6 1 。 1 3 4 酸性高锰酸钾化学发光体系 高锰酸钾是化学发光反应中常用的强氧化剂。高锰酸钾化学发光反应可以分为两 类。第一类是直接与高锰酸钾反应产生化学发光。由于高锰酸钾氧化性很强，能够氧 化许多含有不饱和键、羟基、氨基等基团的物质，产生具有荧光的中间体或产物，它 们能够接受反应产生的能量，并以光辐射的形式释放出去；另一类是利用增敏剂增强 高锰酸钾化学发光。由于高锰酸钾化学发光体系所需的试剂非常普通，发光强度一般 比较稳定，受到人们的重视，己经在大气环境检测、毒品分析、药物检验等许多方面 得到实际应用【6 j 。 在酸性介质中，高锰酸钾化学发光反应体系的灵敏度一般较低，常常需要在体系 中加入增敏剂，常用的有还原性物质，如甲醛、乙二醛、戊二醛、甲酸等；荧光类物 质，如罗丹明b 、罗丹明6 g 、核黄素、奎宁以及一些表面活性剂。由于很多的有机 物能够被高锰酸钾氧化，所以高锰酸钾化学发光体系在化学发光检测中有着越来越广 泛的应用。 1 - 3 5 钌( i i ) 联吡啶配合物化学发光体系 钉( i i ) 一联吡啶( 【r u ( b p y ) 3 】2 + ) 的化学发光最早于19 6 6 年被l 矿l e 掣1 伽发现。他们在 强酸或强碱的【r u ( b p y ) 3 】2 + 溶液中加入芳香胺，观测到桔红色的发光。 r u ( b p y ) 3 】2 + 是常 用的电致化学发光试剂，具有独特的化学稳定性、氧化还原性和发光性，在硫酸介质 中，它能与氧化剂产生化学发光，加入某些有机物可以增强其发光强度，且发光强度 s 流动汴射化学发光法测定药物和蛋白质的研究及应用 与有机化合物浓度呈线性关系。基于此，可以测定这些有机化合物【“】。 1 3 6 铈( i v ) 化学发光体系 在药物和生物领域，硫酸铈和硫酸曾被用于测定罂粟碱。c e ( i v ) 如同高锰酸钾、 重铬酸钾或溴酸盐等氧化剂一样在氧化亚硫酸盐等还原性物质时可产生弱的化学发 光反应。在酸性介质中，c e ( i v ) 可以和许多物质发生氧化还原反应从而产生荧光特性 或化学发光，利用该反应已经建立了一些化合物的测定方法1 6 j 。 1 3 7n 溴代丁二酰亚胺( n b s ) 化学发光体系 n 溴代丁二酰亚胺( n b s ) 是一种普通的化学发光试剂，它一般在碱性环境中测定 其他物质。它是除前面的酸性高锰酸钾、r u ( i i ) 以外的又一氧化剂，被用来直接氧化 药物产生化学发光。比如，以阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲基铵( c t m a b ) 作 增敏剂，n b s 在碱性溶液中氧化某些药物产生化学发光，据此建立测定焦酚的分析 方法。 n b s 在水溶液中，可水解为强氧化性的h b 向，其氧化性也主要来自于h b 内【1 2 1 。 1 9 9 0 年，h a l v a t z i s 等首次将n b s 用于化学发光分析，他们发现n b s 氧化异烟肼 时产生化学发光，而铵离子的存在可以大大增强发光，据此，建立了检测异烟肼的化 学发光分析法。在这之后，n b s 作为一种相对稳定和有效的氧化剂，在化学发光领 域得到了广泛的应用。 1 3 8 铁氰化钾( k 3 【f e ( c n ) 6 】) 化学发光体系 铁氰化钾是一中等强度的氧化剂，可以氧化许多物质，但目前利用其氧化性氧化 其他物质产生化学发光所测定的物质并不多。早在1 9 9 0 年c a l o k e r i n o s 就利用铁氰化 钾直接氧化硫胺水解产物产生化学发光的现象建立了铁氰化钾化学发光法测定硫胺 的含量【1 4 1 。以铁氰化钾为氧化剂的化学发光反应体系在最近几年里才有较多的报道。 因而对铁氰化钾化学发光反应体系的规律、机理及应用的研究和探讨还有待深入。 1 4 化学发光分析的应用研究 1 4 1 在无机物分析中的应用 化学发光分析法目前可测定的金属离子和其他无机组分已达4 0 多种，涉及的分析 试样极为广泛，但以测定环境及生物样品中的无机组分为主。 6 济南大学硕：i ：学何论文 1 4 1 1 金属离子的测定 利用金属离子对化学发光反应的催化作用测定无机物的研究报道最多，利用被测 无机组分的氧化作用或对化学发光反应的抑制作用或利用偶合反应测定无机物的研 究也有报道。采用的分析手段以流动注射为主，s o n g 等【1 5 】基于钻离子对鲁米诺溶 解氧化学发光反应的显著增强作用，用f i c l 方法检测了飞克水平的钴，并被成功地 应用于蛋黄、鱼组织和人血清中钻的检测。 铬是一种有毒元素，它在环境中的排放是受限制的，但它也是人体需要的微量元 素，李淮芬【1 6 1 等建立了鲁米诺一过氧化氢一铬( i i i ) 吐温- 8 0 化学发光体系测定铬( i l i ) 的分 析方法，检出限达到1 2 1 0 。8 m o l l ，可用于环境水样中铬( i i i ) 的测定。 铅的毒性比铬高得多，因此人们研究出多种发光体系来实现对不同环境中铅的测 量。唐守渊【1 7 】等采用铅催化氧化鲁米诺检测汽油样品和尿中的铅。吴永平【1 8 】等建立 了简易、快速测定白酒中铅含量的流动注射化学发光新方法。 镉是一种银白色重金属，广泛并持久存在于环境中，对人和动物造成极大的健康 危害。大量研究表明，镉具有致癌性。刘晓掣1 9 1 等研究了c d ( i i ) 对鲁米诺一c o ( i i ) 一h 2 0 2 发光体系的抑制现象，据此建立了c d ( i i ) 的抑制化学发光测定法，该法的线性范围为 1 o 1 0 7 5 o 1 0 6 m l ，检出限为3 2 1 0 。8 m l 。该方法用于实际水样中c d ( i i ) 的测定， 结果令人满意。部分金属离子的分析应用见表1 1 。 表1 1 部分金属离子的化学发光分析 7 流动注射化学发光法测定药物和蛋广1 质的研究及府用 1 4 1 2 无机阴离子及化合物的测定 流动注射化学发光法在无机非金属元素的测定中有着广泛的应用。m o h 锄m a d y - a q 0 0 b 等例和t o m 缸p 6 r e z 1 沁i z 等【3 l 】采用f i c l 方法分别检测了硅酸盐和草酸盐。亚 硝酸盐是一种常见的有毒物质，p a v e lm i k u s k a 建立了鲁米诺化学发光体系测定水中 亚硝酸盐的分析方法，范彩玲f 3 3 】等基于酸性介质中n 0 2 。将亚铁氰化钾氧化为铁氰化 钾，建立了间接测定微量亚硝酸盐的方法，可用于各种蔬菜中微量亚硝酸盐的测定。 亚硫酸盐具有杀菌、溶解、防腐、增酸和抗氧等作用，常用作食品添加剂，但过 量的亚硫酸盐残留对人体有害，因此建立测定亚硫酸盐的方法很重要。赵芳【3 4 】等提出 了k m n 0 4 n a 2 s 0 3 体系化学发光法测定溶液中亚硫酸盐含量的方法，该方法成功地用 于啤酒中亚硫酸盐总含量的测定。 用二氧化氯代替液氯消毒自来水不易形成有致诱变和癌变的三卤甲烷类物质，已 显示出它的优越性而成为种广泛应用的优良消毒剂。二氧化氯消毒自来水，水中有 效氯以c 1 0 2 、c 1 2 、c 1 0 2 。、c 1 0 3 等形态存在，但主要是c 1 0 2 形态，刘希东【3 5 】等建立了 流动注射一二氧化氯碘化物鲁米诺体系测定c 1 0 2 的新方法，应用于自来水中剩余c 1 0 2 的测定，结果满意。部分无机阴离子和化合物的分析应用见表1 2 。 表1 2 部分无机阴离子及化合物的化学发光分析 1 4 2 在有机物分析中的应用 与无机物相比，有机物数目众多，可达几百万种。有机物对人类具有重要意义， 地球上所有的生命形式，主要是由有机物组成的，如脂肪、蛋白质、糖、叶绿素、酶、 8 济雨大学帧十字位论文 激素等。生物体内的新陈代谢和生物的遗传现象，都涉及到有机化合物的转变。此外， 许多与人类生活有密切关系的物质，例如石油、天然气、染料、天然及合成药物等， 均属有机化合物，可见对有机物的检测具有重要意义。 1 4 2 1 药物检测 药物分析在临床、药代动力学及药物开发研究中具有重要地位。化学发光与流动 注射联用，可达到分析快速、重现性好、自动化程度高的目的。作为痕量分析技术， 已在药物分析中显示了极大的潜力和应用前景。 抗菌素是人及动物常用的药物之一，s u n 等1 4 5 】利用l m n 0 4 乙二醛一h 2 s 0 4 体系对 头孢氨苄、头孢羟氨苄和头孢唑啉钠等三种头孢菌素的测定进行了研究，检出限分别 是：1 0 n m l 、2 n 咖l 和2 n m l ，成功地测定了这三种头孢菌素。a l a l lt o 、i l s h e n d l 4 6 】 等利用高锰酸钾r u ( i i ) 一四环素体系，成功地测定了四环素，该法的线性范围为5 1 0 巧 5 1 0 4 m o l l ，检出限为2 o x l o 击m o l l ，用于测定药物中的四环素，结果满意。 维生素是一类维持机体正常生理功能的重要物质。体内维生素的含量过高或过低 都会影响人体的正常代谢，因此其分析检测对于临床医学具有重要意义。徐小娜等1 4 7 】 建立了顺序流动注射化学发光法测定痕量抗坏血酸的新方法，检出限达到5 o 1 0 _ o m o l l ，可应用于测定维生素c 针剂和片剂中的抗坏血酸。z h e n 曲u as o n g l 4 8 】等基于鲁 米诺k 1 0 4 维生素b 1 发光体系的研究，结合流动注射技术建立了一种灵敏度高、线性 范围宽的流动注射化学发光测定维生素b l 的新方法。该法的线性范围为3 3 p m o l m l 6 7 姗o l m l ，检出限为1 0 p m o 1 l 。李卫华【4 9 】基于f e ( i i i ) 氧化叶酸生成f e ( 1 1 ) 的反应和 鲁米诺0 2 f e ( i i ) 化学发光反应相偶合，建立了流动注射化学发光测定叶酸的新方法， 方法检出限为2 o 1 0 0 m o l l 。该法用于叶酸片剂中叶酸的分析测定，结果满意。 吗啡类生物碱属于中枢神经药物，具有镇痛、中枢抑制、呼吸抑制等作用，h 啪g 等利用盐酸氯丙嗪对c e ( i v ) n 0 3 一罗丹明6 g 、l u m i n o l 。a u c l 。的增敏例和抑制酬作用， 建立了其含量的分析方法。w i r a tr u e n g s i t a g o o n 【5 2 】等基于在扑热息痛存在下，在稀硫 酸溶液中，高锰酸钾氧化r u ( i i ) 产生化学发光，建立了一种简单的流动注射化学发光 测定扑热息痛的方法。该法的线性范围为o 3 5 0 o p 咖l ，检出限为o 2 p 咖l ，该法成 功地用于测定商业药品中的扑热息痛。e d y t a n a l e w 句k o 【5 3 】等基于多巴胺鲁米诺铁氰 化钾化学发光体系，建立了一种流动注射化学发光测定多巴胺的方法。该法的线性范 围为3 0 - 1 0 0 p g ，l 和4 0 0 3 0 0 0 肛g l ，检出限为5 p g l ，该法已被用于测定商业药剂注射液 样本中的多巴胺。 9 流动滓射化学发光法测定药物和蛋一质的研究及席用 s h u w e ns u n 【5 4 】等发现了阿托品在c e ( i v ) 亚硫酸钠反应体系中的后化学发光反 应，建立了利用后化学发光反应测定阿托品的流动注射化学发光新方法。该法的线性 范围为1 o 1 0 一5 o l o 5 9 m l ，检出限为4 1 0 。7 咖l ，该法用于测定药品中的阿托品， 其结果与药典方法一致。其他药物的分析应用见表1 3 。 表1 3 部分药物的化学发光分析 样品体系 检出限线性范围文献 抗坏血酸 氨基比林 异烟肼 头孢克洛 环丙沙星 心得安 安乃近 维生素b 1 2 阿莫西林 尼莫地平 没食子酸 盐酸。肾上腺素 吲达帕胺 氟美松 金霉素 氯丙嗪 奋乃静 氟非那嗪 甲硫哒嗪 芬妥胺 美洛昔康 芦丁 美托洛尔 c e ( i 一罗丹明b 铁氰化钾钙黄绿素 鲁米诺n b s 鲁米诺- h 2 0 2 c e ( i v ) s 0 2 3 高锰酸钾硫酸 罗丹明6 g 聚乙二醇 鲁米诺c o ( i i ) 鲁米诺- h 2 0 2 c o ( i i ) c e ( i v ) s 0 2 3 鲁米诺k 1 0 4 铁氰化钾 鲁米诺铁氰化钾 鲁米诺一铁氰化钾 高锰酸钾s 0 2 3 - 鲁米诺高锰酸钾 鲁米诺一高锰酸钾 鲁米诺高锰酸钾 鲁米诺高锰酸钾 鲁米诺铁氰化钾 n b s k m n 0 4 n a o h c e ( 1 v ) - s 0 2 3 1 o 1o + 1 3 m o l l 2 0 嵋几 4 n 咖l 6 0 1 0 9 咖l 2 2 10 l l m o l l 7 0 n g m l 0 0 0 3 陷，m l 5 o 1 0 川g ，l 2 7 l o 9 咖l 0 0 8 5 m g l o 7 8 “g l 2 8 l0 9 m o l l 3 4 1 0 9 m l o 0 1 蚓m l 1 0 1 0 8 m o l l 0 4 n g m l o 7 n g ，m l 2 n g m l 0 7 n g m l 3