（应用化学专业论文）碳菁染料荧光探针分子的合成及光谱性质研究.pdf

摘要 碳菁类染料作为生物荧光探针，被广泛用于生物分子尤其是核酸的标定。它们具有 很高的摩尔吸光系数，较低的荧光背景干扰等特点，荧光激发和发射波长跨越可见光至 近红外光区，可适用于不同的激发光源。碳菁类染料是目前荧光探针中较新，也是研究 比较活跃的一类。 本论文以溴化苄模拟高分子氯球所带功能基相同结构的组份合成了噻唑橙类荧光 染料，为采用树脂氯球的固相合成提供了参考另外，采用两种不同的路线对噻唑橙类 荧光染料进行修饰，合成了三种带不同取代基团的噻唑橙类荧光染料，讨论了它们的合 成条件及影响因素。 合成了一种带多次甲基的吲哚类荧光染料，研究了四种染料的紫外可见光谱，讨 论了引入取代基对噻唑橙类染料的光谱特性的影响，为噻唑橙类染料荧光探针分子的修 饰提供参考。发现甲基的引入，其供电子效应增大了染料的大兀共轭体系，使染料溶液 的最大吸收波长产生1 0n m 的红移，而氯的引入对最大吸收波长没有影响。吲哚类染料 d y e4 比噻唑橙类染料的最大吸收波长要长，其桥链结构中增加的次甲基具有重要意义。 利用碳菁染料与核酸的标记特点，尝试对蛋白进行标记，研究了四种染料与蛋白结 合后的紫外可见及荧光光谱。在与蛋白结合后，最大吸收波长相对各自游离时有红移， 荧光最大波长均达到了6 0 0n m 左右。 关键词：荧光探针，噻唑橙类染料，吲哚类染料，光谱性质 a b s t r a c t c y a n i n ed y e sa r ew i d e l yu s e df o rt h el a b e l l i n go fb i o l o g i c a lm o l e c u l e se s p e c i a l l yf o r n u c l e i ca c i d sa sb i o l o g i c a lf l u o r e s c e n tp r o b e s t h e s ed y e sd e m o n s t r a t eh i g hm o l a re x t i n c t i o n c o e f f i c i e n ta n dl o wf l u o r e s c e n tb a c k g r o u n d t h e i rf l u o r e s c e n te x c i t a t i o na n de m i s s i o n w a v e l e n g t hr a n g e sf r o mv i s i b l er e g i o nt on e a r - i n f r a r e dr e g i o n ，w h i c hc a nb es u i t a b l ef o r d i f f e r e n te x c i t a t i o ns o u r o a 3 c y a n i n ed y e sa r en o wo n eo ft h en e w e s ta n dm o s ts t u d i e do n e si n f l u o r e s c e n tp r o b e s b e n z y lb r o m i d ei su s e dt os i m u l a t ec h l o r o r e s i nw h i c hh a st h es a m ef u n c t i o n a lg r o u pt o s y n t h e s i z ef l u o r e s c e n td y e so ft h i a z o l eo r a n g es e r i e s t h i sm e t h o dp r o v i d e sar e f e r e n c ef o r s o l i d - p h a s es y n t h e s i su s i n gc h l o r o - r e s i n t w od i f f e r e n ts y n t h e t i cr o u t e sa r eu s e dt oe m b e l l i s h t h ef l u o r e s c e n td y e sa n dt h r e ed y e so ft h i a z o l eo r a n g es e r i e sw i t hd i f f e r e n ts u b s t i t u e n t sa r e g a i n e d t h e i rs y n t h e t i cc o n d i t i o n sa n di n f l u e n c i n gf a c t o r sa r ed i s c u s s e d a ni n d o l ef l u o r e s c e n td y ew i t hp o l y m e t h i n ei ss y n t h e s i z e d u v - v i ss p e c t r ao ff o u rd y e s a r es t u d i e da n dt h ei n f l u e n c e so ft h es u b s t i t u e n t s i n t r o d u c t i o nt ot h ed y e sa r ed i s c u s s e d r e f e r e n c e so ft h ee m b e l l i s h i n go ft h et h i a z o l eo r a n g ed y e sa p r o v i d e d t h ei n t r o d u c t i o no f m e t h y lw i d e n st h e 兀c o n j u g a t e ds y s t e ma n dm a k e st h ea b s o r p t i o nm a x i m u mr e ds h i f to f1 0 n n l ，w h i l et h ei n t r o d u c t i o no fc h l o r i n eh a sn oi n f l u e n c e sw i t ht h ea b s o r p t i o nm a x i m u m d y e4 h a sl a r g e ra b s o r p t i o nm a x i m u mc o m p a r e dw i t ht h i a z o l e o r a n g ed y e sa n di t sa d d i t i o n a l m e t h i n ei nt h eb r i d g es t r u c t u r eh a s g r e a ts i g n i f i c a n c e a c c o r d i n gt ot h el a b e l l i n gc h a r a c t e r i s t i co fc y a n i n ed y e sa n dn u c l e i ca c i d ，d i f f e r e n td y e s a l eu s e dt ol a b e l l e dp r o t e i n s u v - v i sa n df l u o r e s c e n ts p e c t r ao ft h e4d y e sb o u n dw i t h p r o t e i n sa r es t u d i e d a f t e rt h eb i n d i n g , a b s o r p t i o nm a x i m u mo fe a c hd y eh a sar e ds h i f t c o m p a r e dw i t ht h e i rf r e es t a t ei nw a t e rs o l u t i o na n df l u o r e s c e n tm a x i m u m r e a c h e s6 0 0n n l k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n tp r o b e ，t h i a z o l eo r a n g ed y e s ，i n d o l ed y e s ，s p e c t r a lp r o p e r t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取 得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼理王太堂 或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 每铲签字日期：7 年月伊 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解云洼堡工太堂有关保留、使用学位论文 的规定。特授权丞洼堡王太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编， 以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复本和电子 文件。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 签字日期： 豸绎 月，) 日 导师签名： - j f 哆粥 签字嗍加7 年f 月7 日 i 第一章文献综述 第一章文献综述 进入2 1 世纪，生命科学将占有举足轻重的地位，各国科学家都不约而同地将目光 转向这一领域。蛋白质、核酸和糖等都成为研究的对象。其中，对于核酸的研究一直占 有较大的比重。早在1 8 6 8 年，瑞士内科医生m i e s c h e r 从脓细胞中分离出一种有机物质， 因为具有酸性且存在于细胞核中而得名“核酸”。虽然核酸的发现已有1 0 0 多年的历史， 但人们对它真正有所认识不过是近6 0 年的事。核酸，又称为多聚核苷酸，它是构成生 命的重要物质。核酸分为脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，简称d n a ) 和核糖核酸 ( d b o n u c l e i ca c i d ，简称r n a ) 。这两类核酸在所有动物和植物中都存在，r n a 在细胞 质和细胞核内均有分布，它在蛋白质生物合成中起着突出的作用：d n a 是一种遗传物 质，主要分布在细胞核内的染色体上，它是构成染色体的主要成分，一条染色体具有一 个d n a 分子。核酸是遗传的重要物质，d n a 是遗传信息的存储和携带者，可以说核酸 与生物的生长、发育、遗传和变异密切相关。因此，对于核酸的研究具有非常重要的意 义。 对于核酸的研究，离不开先进的分析检测手段，荧光探针分子可以说是其中比较重 要的一部分。而且，随着不断的发展，其作用已经不仅仅限于核酸的研究，而渗透到生 物研究的其他领域。 1 1 核酸结构特征简介 核酸的基本结构单位是核苷酸。核苷酸由一个含氮碱基( 嘌呤或嘧啶) ，一个戊糖 ( 核糖或脱氧核糖) 和一个或几个磷酸组成。核酸是一种多聚核苷酸( p o l y n u c l e o t i d e ) ， 核苷酸靠磷酸二酯键彼此连接在一起。 磷 聚核苷酸 厂上 戊糖碱基 图1 - 1 核酸的化学组成 f i g u r e1 - 1 c h e m i c a lc o m p o s i t i o no fn u c l e i ca c i d 1 9 5 3 年，w a t s o n 和c r i c k 提出了d n a 的双螺旋结构，主要结构特征如下：两条多 核苷酸链以相同的旋转方向绕同一中心轴形成右手双螺旋，螺旋直径为2 0n m ：两条多 事 酸丁苷 鞋 核 核 第一章文献综述 核苷酸链呈反向平行，一条链的走向是5 一3 ，另一条是3 一5 ；多核苷酸是许多核苷 酸通过3 ，5 磷酸二酯键连接成的聚合物，核苷酸是由核苷和磷酸脱水缩和而成，而核 苷又是由戊糖的苷羟基和碱基脱水缩和而成；两条多核苷酸链的糖一磷酸骨架处于双螺 旋的外侧，碱基结合的平面处于链的内部。沿螺旋方向看，双螺旋表面有两个沟槽，一 个称为小沟槽( m i n o rg r o o v c ) ，另一个称为大沟槽( m a j o rg r o o v c ) ，大、小沟槽携带 了其他分子可识别的信息，这两个沟槽使碱基外露，为探针分子与碱基作用提供了空间； 两条多核苷酸链均由腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、胞嘧啶( c ) 、胸腺嘧啶( t ) 通过 碱基配对规律互补配对，其中a 与t 之间形成两个氢键，g 与c 之间形成三个氢键。 而在r n a 中，尿嘧啶( u ) 代替了胸腺嘧啶( t ) ，其余三种与d n a 相同。r n a 分子由 单股多核苷酸链组成，但有局部双链结构。一般r n a 分子质量也相对较小，种类繁多， 各种r n a 分子各具有独特的空间构象。 图1 - 2 d n a 结构 f i g u r e1 - 2 s t r u c t u r eo fd n a 1 2 有机核酸荧光探针简介 生物分子的结构通常都比较复杂，直接研究它们的性质会比较困难，因此一般采用 探针技术研究。探针技术即把一些小分子通过共价、静电结合等标记技术连接到生物分 子上，通过适当的仪器检测这些物质标记前与标记后分析信号的变化，从而对生物分子 进行诸如组成、构象、粘度、p h 值和质量等物理化学性质方面的研究。荧光探针法则 2 第一章文献综述 因其灵敏度高、表征参数多、动态响应线性范围宽，而在生物分子的研究领域中起着重 要的作用。荧光探针是基于荧光物质与生物分子作用后，其荧光特性发生了与生物分子 某一特定性质相关的变化，来研究生物大分子的结构及物理化学过程和性质。 由于d n a 中富含具有共轭体系的嘌呤、嘧啶等碱基，其在2 5 0 2 8 0n l n 波长处有 光吸收，最大吸收峰在2 6 0n l n 处，结合分离手段，紫外吸收检测，可检测单链和双链 d n a ，但由于d n a 的摩尔吸收系数仅1 0 4 数量级，灵敏度不高，不适于微量或痕量 d n a 片段的检出和d n a 序列分析的要求。为了提高测定灵敏度，需要采用新的分离、 检测技术，其中研究和发掘新的灵敏的大共轭体系紫外可见染料、荧光染料等有机分子 探针是重要途径之一。 一般来说核酸荧光探针染料多达几十种，下面介绍几种一直以来使用较广泛的核酸 探针。 1 8 7 1 年，德国科学家v a nb a y e r 合成了荧光素，它是一种强荧光染料，其荧光为 强绿色，在水中的最大吸收发射波长为4 9 2 5 7 1n m ，荧光量子产率为0 9 2 ( p h = 9 1 。由 于它荧光强度大，大量基于其结构的荧光素衍生化合物被合成，并被作为荧光检测试剂， 广泛应用于细胞学、病毒掣1 1 等方面。 图l o 荧光素结构 l n l g u r e1 - 3 2 d 咖c h o f f l u o n c c i n 荧光素的优点是：操作简单，成本较低。但也存在缺点：如敏感性偏低；其共轭体 系不稳定，容易发生不可逆转的光漂白，导致荧光信号迅速下降；吸收及荧光性质受p h 值影响；与标记物共轭连接后易发生猝, 灭1 2 1 。 1 2 2 双苯并咪唑( d i b e n z i m i d a z o l e ) 类 苯酚基双( 苯并咪唑) ( h o e c h s t3 3 2 5 8 ) 和苯乙氧基双( 苯并咪唑) ( h o e c h s t3 3 3 4 2 ) 水溶性较好，相对无毒性。作为核酸荧光探针，可渗透细胞、通过小沟槽键合到d n a 染色，发射蓝色荧光，其中h o e c h s t3 3 3 4 2 比h o c c h s t3 3 2 5 8 有稍微高的膜渗透性。h o e c h s t 类染料可用于细胞和粗处理组织匀浆中d n a 的测定1 3 i ，s t o u t 等为了直接检测碱性洗脱 液中的d n a ，建立了用h o c c h s t3 3 2 5 8 检测单链d n a ( s s d n a ) 的方法，可检测低至1 0 0 n g m l 的单链d n a 1 4 】。 3 第一章文献综述 r = o h ，h o e c h s t3 3 2 5 8 ；r = o c h 2 c h 3 ，h o c c h s t3 3 3 4 2 图1 4 h o e x ：h s t 类染料结构 f i g u r e1 - 4 2 d s t r u c t u r eo fh o e c h s td y e s 这类染料可用紫外光激发。若用氩离子激光光源及一般的激发光源激发，显示出大 的s t o k e s 位移，激发波长，发射波长为3 5 0 4 6 0n l n 。该染料还表现出与d n a 序列选择性 亲和的宽光谱行为，足够强的键合到聚d ( a - t ) 序列。正由于这种特异性，它们的荧光发 射不能反映整个d n a 的情况。因此h o e c h s t 染料的荧光发射不能用来比较不同基因组 的大小。 1 2 3 吖啶和菲啶( a c r i d i n ea n dp h e n a n t h r i d i n e ) 类 吖啶和菲啶类染料是应用得比较早的荧光核酸探针，吖啶环和菲啶环是它们的荧光 发色团吖啶和菲啶类染料及其二聚物具有较好的水溶性，也易溶于有机溶剂，如二甲 基亚砜( d m s o ) 、n , n - - - 甲基甲酰胺( d m f ) 及乙醇等。它们通过嵌入或静电吸引与 核酸分子进行无择序键合，使核酸荧光增强。 1 2 3 1 吖啶橙( a c r i d i n eo r a n g e ) 吖啶橙通过嵌入或静电吸引与d n a 和r n a 作用。当与双链核酸结合时，染料发绿 色荧光，最大发射波长为5 3 0n m ；当与单链核酸结合时，有红色荧光，最大发射波长为 6 4 0n n l 。用于核酸的测定阁和抗癌药物的筛选嘲 图1 5 吖啶橙结构 f i g u r e1 - 5 2 d s t m c l u r eo fa c r i d i n eo r a n g e 1 2 3 2 溴乙锭f e t h i d i u mb r o m i d e ) 在上世纪6 0 年代，w a r i n g 发现溴乙锭与d n a 和r n a 高度键合，饱和键合能力为 一分子溴乙锭键合4 到5 个核苷鸭l cp e c q 和p a o l e t t i l 8 。9 1 发现溴乙锭能插嵌入d n a 双 4 第一章文献综述 螺旋的碱基堆中，与其形成强荧光的化合物。从此溴乙锭取代了诸如吖啶橙，h o e c h s t 3 3 2 5 8 和h o c c h s t3 3 3 4 2 等传统荧光染料。溴乙锭可用于监测其他物质与d n a 的作用机 理【1 0 - 1 ，或有机致癌物、毒素及抗癌药物在体内的过程1 1 2 j 。但是，激发溴乙锭d n a 的 结合物，可使染料光漂白和单链断裂同时，溴乙锭能诱发癌变，灵敏度也不高，限制 了其进一步的发展。 图i 溴乙锭结构 l r t g u r e1 - 6 2 d - s m l c m eo fe t h i d i u mb r o m i d e 1 2 4 碳菁染料( c y a n i n ed y e s ) 碳菁染料的结构特点是通过单次甲基或多次甲基将两个含氮的环连接起来，形成共 轭大旋。这种大共轭体系有利于兀电子的激发，形成冗一兀跃迁，产生荧光。 碳菁类染料大都在可见光区有很高的摩尔吸光系数，超过5 1 0 4 ( c m - 1 m o l - 1 l ) ；较 低的自身荧光，不与核酸结合时，荧光量子产率小于0 0 1 ，当与核酸结合后，不会出现 荧光猝灭现象，其荧光强度反而大大增加( 10 0 0 倍以上) ，荧光量子产率高达0 9 ；对 核酸有很高的亲合作用；大多数染料分子带有电荷，有一定的水溶性。此外，这类染料 的荧光激发和发射波长跨越可见光至近红外光区，可适用于不同的激发光源。因此，碳 菁染料是目前核酸荧光探针中较新的，也是研究比较活跃的一类。 1 2 4 i 苯并噻唑和苯并唔唑( b e n z o t h i a z o l ea n db e n z o x a z o l 曲类 噻唑橙( t h i a z o l eo r a n g e ，t o ) 和啄唑黄( o x a z o l ey e l l o w ，y 0 ) 类染料的分子由苯并 噻唑盐或苯并嚅唑盐通过一个次甲基与喹啉盐连接而成。与溴乙锭相比，此类染料表现 出与d n a 更高的亲和力，高量子产率和结合后极高的荧光增强( 10 0 0 倍以上) 1 1 3 j 。这种 不对称菁染料的主要优点在于它的低荧光背景，消除了与d n a 结合后的背景干扰，增加 了检测的灵敏度【l ”。t o 在用于核酸的凝胶电泳检测时，其灵敏度较溴乙锭高5 0 倍以上i l ”。 此类染料的结构如下所示： x 2 s ，t h i a z o l eo r a n g e ，t o ；x2o ，o x a z o l ey e l l o w ，y o 圈1 - 7 苯并噻唑、苯并喙唑类染料结构 f i g u r e1 - 7 2 d - s t r u c t u r eo fb e n z o t h i a z o l ea n db e n z o x a z o l ed y e s 5 第一章文献综述 x = s ，t o t o ；x = 0 ，y o y o 图l 最苯并噻唑、苯并嚼唑类染料二聚体结构 f i g u r e1 - 8 2 d - s m u c t u r eo fh o m o d h n 目o fb e n z o t h i a z o l ea n db e n z o x a z o l ed y e s 光谱性质如下表所示1 1 3 1 ： 表1 - 1 t o 、y o 及其二聚体的光谱性能 ! ! 坠生! ：! ：鱼! ! ! ! 型婴竖璺堕! 堕! q ：! 里! ! ! 些! 堕塑里! ! 塑! 堡 染科二r i m 竺e x 1 0 3 l m o l 1 c m - e x l 0t o o lc l n 。兰薹鬻茹 一强倍数 f r e eb o u n df r e eb o u n d厦 溴乙锭均 二聚物 4 9 25 3 4 8 9 ( 4 9 2 ) 6 2 66 1 63 51 0 t o 5 0 1 5 0 9 7 0 0 0 2 ) 6 4 0 5 2 7 1 8 9 t o t o4 8 15 1 3 1 3 1 7 ( 5 0 7 ) 6 3 0 5 3 2 l1 1 2 y o4 7 5 4 8 6 7 5 7 ( 4 7 6 ) 5 7 55 0 57 0 05 6 y o y o4 5 8 4 8 9 1 1 8 “4 8 2 ) 5 6 45 0 9 32 0 04 4 单体t o 、y o 具有很高的摩尔吸光系数( e 7 00 0 0l m o l - 1 c t f l “) ，它们的二聚体 t o t o 和y o y o 则超过了1 0 00 0 0l m 0 1 - 1 c m 。在水溶液中，这4 种染料并不发荧光。 在与d s d n a 结合后荧光量子产率大大提高。与通常的菁类染料相比，t o 及y 0 在与 d n a 结合后的吸收和发射波长的差值在1 8 2 0 啪，跟典型的菁类染料相差不多。而在 溶液中的s t o k c s 位移为1 0 0 1 5 0h i l l ，超过一般文献记载菁类染料的s t o k c s 位移( 1 5 2 5m n ) i t s - 1 6 1 。正是由于这种特殊的性质，有利于选择性和分辨率的提高。 二聚体t o t o ，y o y o 的双阳离子链和对核酸的双嵌入作用，使它们无论跟单链还 是双链核酸都有很高的亲合力1 1 7 1 。偏振光谱分析显示：啄唑或噻哗部分的长轴垂直于核 酸轴，这与双嵌入理论相一致【l ”。以t o t o 为例，与d n a 结合后，它的双阳离子链处 6 第一章文献综述 于小沟槽中，分子中的苯并噻唑环相对于喹啉环产生扭转。t o t o 分子中两个发色团锁 入d n a 碱基中，使相对位置固定，迫使t o t o 分子通过发射荧光来释放吸收的能量【1 9 l 。 次甲基两端的苯并噻唑部分和喹啉部分的扭转受限制，很好的解释了t o t o 及类似菁染 料二聚体的荧光增强现象【硎。单体t o 及y o 跟二聚体有相似的特性：染料分子中的苯 并噻唑或苯并嚅唑部分与多核苷酸的小沟槽结合，而另一部分插嵌入碱基中。与核酸的 结合迫使次甲基桥链两端的发色团方位固定，导致荧光强烈增强。而在没有核酸的情况 下，染料不发荧光是因为桥链两端的苯并噻唑环和喹啉环之间的自由转动造成的。染 料的相对柔性使它非选择性地高度亲合。另外，t o 及y o 与单个苯并噻唑或苯并嗯唑 及喹啉盐相比，最大激发和发射波长出现红移。 1 2 4 2 吲哚和苯并吲哚( i n d o l ea n db e n z o m d o l e ) 类 吲哚类碳菁染料具有较大的摩尔消光系数，相对较高的反射率，溶解性好等特点。 由于生物分子在紫外区都有弱荧光，对于一般的荧光染料会有背景干扰，降低了检测的 灵敏度。而此类含吲哚的多甲川碳菁染科的吸收和发射波长大多位于5 5 0 1 2 0 0 砌区 间内，属于近红外荧光染料。在这个区域，生物分子的荧光背景干扰很弱，信噪比很高， 有较高的摩尔吸光系数，在1 1 0 5 2 5x1 0 5l - ：】 1 1 - 1 m o l - 1 l 间。因此，有很高的荧光 检测灵敏度。 n = 1 ，2 3 图l - 9 吲哚、苯并吲哚类染料结构 f i g i l 件l 9 2 d s t n i d u m sm d o l e d 妇o m d o l ed ”s 通过引入不同或相同的取代基r 1 、r 2 、r 3 、来形成不对称或对称的碳菁染料， 而通过改变n 值得到不同长短次甲基链的染料。此种吲哚类碳菁染料分子的大丁【共轭体 系，决定了染料的主要吸收带的范围，共轭体系越大，分子的最大吸收波长越长。一般 次甲基链上每增加一个双键，可使染料分子的最大吸收波长红移约1 0 0 啪，但次甲基链 越长，染料的稳定性也就越差 7 第一章文献综述 1 3 探针分子与核酸的结合模型 不同类型的探针分子，与核酸的结合方式也各有不同，可以用几种模型归类如下： ( 1 ) 沟结合，即d n a 探针分子与d n a 的大沟或小沟的碱基对直接发生相互作用。如 h o c c h s t 类染料，它们特异性地键入双链d n a 的小沟槽中，这使它们对d n a 有高度的 选择性。 ( 2 ) 插嵌结合，即在碱基对之间嵌入平面的或几乎平面的芳香环系统。这种探针分子 能够嵌入d n a 和r n a 的碱基中，如溴乙锭。 ( 3 ) 在嵌入碱基的同时也和核酸的小沟槽或大沟槽结合，只在与核酸结合后才发荧光， 比如碳菁染料单体。 ( 4 ) 与不同类型的核酸结合，有不同的荧光发射光谱，如吖啶橙。 不同类型的核酸探针染料与核酸结合的主要性质归纳如下表： 表1 - 2 核酸探针染料与核酸结合的性质阎 ! ! ! ! 竺! 兰：! 竖生竺堕! ! 墅! 塑! ! 堡! ! 垫! 塑型! ! ! ! ! 型! 型! 竺 1 4 碳菁染料的分类 碳菁类染料作为生物分子荧光探针的各种优点使得其近些年来倍受关注，家族也不 断壮大。虽然碳菁染料的数目繁多，分类方式也不尽相同，归纳起来主要有以下几种： 乱依据次甲基链的长短，可分为单次甲基、三次甲基、五次甲基碳菁染料等。 b 依据次甲基链两边连接的氮坏的异同，可分为对称和不对称碳菁染料。 8 第一章文献综述 c 依据次甲基链两端所连接的环的类型，可分为噻碳菁、嗯碳菁、咪碳菁等。 d 依据分子的水溶性，可分为水溶性和非水溶性碳菁染料。 1 5 碳菁染料的性质 1 5 1 碳菁染料的共振 碳菁染料分子含有两个主中心，共轭链中各原子的正负电荷互相中和。但是。各共 轭原子间的距离愈远，则阻碍这种中和的极化作用愈为强烈。两个正中心之间的距离愈 长，则位于链两端的两个原子中的电子振动的频率愈低。这种频率与被吸收的辐射频率 相应。因此，两个正中心之间的链愈长，则吸收带将愈偏向长波方向。 碳菁染料这种大的共轭分子，量子力学理论认为i 捌：菁染料基态的成键轨道中有a 电子、兀电子和孤对电子，而反键轨道有兀空轨道和o 空轨道，虽然轨道的相对能量 与特定的分子体系相关，但是不同类型的轨道可能具有相似的能量菁染料在可见光与 近红外光谱区的可能的跃迁包括珊f 和n f 跃迁，其中n f 跃迁消光系数低而被 较强的而一兀跃迁所掩盖。 这样，染料分子就可以比作一个共振的电子振荡系统，其共振频率决定着被吸收辐 射的等时振动频率。参加振动的只有各原子外层的可动的兀电子，它们的振动与整个分 子的转动叠加在一起。分子由一种激发态至另一种激发态是量子化的。原子的振动频率 都不是单纯的，因为每个原子周围的各原子也都在振动。 碳菁染料是由共轭双键链组成的，末端原子中的电子可以通过相继的转移沿着分子 运动。吸收带中的每一种波长都与电子在分子中移动的某一路程相应，最长的波长对应 于最长的路程，而最长的路程是在分子铺展的最宽时出现的。最短的波长对应于分子折 叠起来时的情形或对应于电子转移不完全的阶段。 1 5 2 碳菁染料的溶剂效应 碳菁染料分子由于共轭键的不断转移，形成两个极端的共振结构。溶剂对于碳菁染 料的吸收光谱具有重要的影响。s h e p p a “2 4 1 研究了碳菁染料在溶剂中的可见光谱，发现 溶剂只是使染料的最大吸收波长产生少量红移。w e s t l 2 5 j 等把染料的最大吸收波长与溶剂 的介电常数、折射率关联起来，发现最大吸收波长的位移与溶剂的介电常数无关，而与 折射率存在一定关系。随着折射率的增大，染料的最大吸收波长向长波移动。 1 5 3 碳菁染料的聚集行为 菁染料在水溶液中易于形成聚集体，这一现象与水的介电常数高从而减少了聚集体 中染料离子间的排斥力有关陋j 。在有机溶剂中，高介电常数的有机溶剂虽然也具有这种 作用，但是溶剂化作用却干扰了聚集作用。 在极性有机溶剂中，染料的吸收能够很好的满足比尔定律，但在水溶液中则与比尔 定律有很大的偏差1 2 6 1 。在稀的水溶液中，染料的最大吸收强度随浓度的增加而减弱，并 且在其他波长出现新的吸收峰。这些光谱迁移是由于染料分子在水溶液中受到强烈的分 9 第一章文献综述 散力以及发色团的高度极化能力的影响，而形成二聚体和多聚体【卅。碳菁染料在水或醇 溶液中都出现聚集现象，随着染料浓度的增加，依次出现二聚体、三聚体及多聚体，染 料分子的吸收峰逐渐减弱，而相继出现d 吸收峰、h 吸收峰和j 吸收峰。其中，j 吸收峰出 现在m 吸收峰的长波方向，与m 吸收峰间有很大位移【删。 1 6 碳菁染料的研究进展 1 6 1 苯并噻唑和苯并嗯唑类染料 苯并噻唑和苯并嚅唑类染料结构相似，对于它们均有一些研究i 批刈，但以对噻唑橙 类染料的研究居多。 1 9 8 6 年，l e c i 孔l 等人合成了一组染料用于网织红血球分析( r e t i c i i i o c v t ea n a l y s i s ) ， 发现一种命名为噻唑橙( t h i a z o l co r a n g e ) 的染料的性质对红血球分析有很好的效果：可 渗透膜佃c m b r a n ep e r m e a b l e ) ，在4 8 8n m 处有很好的吸光系数，高的量子产率，与砌q a 结合后荧光的增强下图为他们合成的噻唑橙结构： 图1 1 0 噻唑橙结构 f i g u r e1 - 1 0 2 d - s t m c t e r eo f t h i a z o l co r a n g e 下表是噻唑橙和传统染料与r n a 结合后的光谱性质： 表1 - 3 核酸染料与r n 结合的光谱性质 ! 苎些! 曼：墨唑型鬯些型! ! 堕坐! ! 些些g 堕坐 化合物耿k 撇a m 波默k 删n m 波。二篙嚣荧霉荧搿 r y e 3 2 l 等在k e 的基础上，将t o 和溴乙锭同时跟d s d n a 分子结合，发现在溴乙锭存 在的情况下，荧光在5 3 0n m ( t o 的最大发射波长) 处发生猝灭，而在6 2 0n m ( 溴乙锭的 最大发射波长) 处，有大的荧光增强，被t o 吸收的能量转移给了溴乙锭。 t i m t c h e v a p 3 1 等合成了6 种基于噻哗橙单体的不对称单次甲基化合物，将它们与不同 的核酸作用发现：当它们与r n a 和s s d n a 结合时荧光最大波长在6 0 0 - 6 2 0a m 之间；而 1 0 第一章文献综述 当与线性d s d n a ( 1 i n e a rd s d n a ) 结合后，荧光最大波长在5 2 5 5 4 5l i r a 之间；在与低分 - 子量的d s d n a ( 如寡核苷酸) 或超螺旋质体d n a ( s u p e r c o i l e dp l a s m i dd n a ) 结合后，各 种染料的荧光最大波长相差较大。以溴乙锭作为参考发现，它与各种核酸结合后的荧光 波长几乎不变 染料 t o h e t o 脏c 1 d m 吧 xy h c 2 h 4 0 h c ic _ 批o h 0 1 3 0 c 2 h s c h 3 0c - 4 h 4 0 h h o c 2 1 - k o c 2 h 5 c h 3 c o n hc h ， z c 1 0 4 b r r b f - r a o i 图1 1 1 不对称单次甲基菁染料一览 l 啊g u r e1 - 1 1 l i s to f t h ea s y m m e t r i cm o n o m e t h i n ec y a n i n ed y e s 他们认为这6 种化合物可以用来区别双链和单链的多核苷酸。 他们还研究了氯化钠溶液浓度对染料核酸化合物荧光的影响，发现在浓度低于0 2 5 m o l l 的氯化钠溶液中，染料一核酸化合物不稳定，容易被盐脱离；当溶液浓度在o 2 5m o i l 到3m o l l 时，染料核酸化合物的荧光猝灭约8 0 ，并且荧光保持稳定。而溴乙锭核酸 的荧光受氯化钠溶液浓度的影响较小。溴乙锭是典型的嵌入核酸式探针，他们分析这六 种染料与核酸中的磷酸有静电作用。 g a d j e v 和d e l i g c o 晒e v i ”5 】等合成了分别带1 、2 、3 i e 电荷的染料t o a c 、t o p y l 和 t o p y 2 ，发现这三种染料与d s d n a 结合后的化合物的荧光最大波长在5 2 0 5 5 0n m 之间， 而随着染料分子中电荷的增加，荧光量子产率o f 有明显的增加。他们将染料d n a 化合 物分别超声波降解5 、1 0 、1 5 和2 0s c c ，发现荧光最大波长不随d n a 的链长度变化而改变， 只是荧光强度随着降解时间的增加而有微弱减小。当染料与s s d n a 结合后，荧光强度的 下降取决于染料分子中的电荷。t o p y 2 ，由于带3 电荷，与磷酸能有更强的静电结合， 荧光强度仅减小5 倍( 5 一f o l d ) ；带2 电荷的t o p y l ，荧光强度减小1 0 倍( 1 0 f o l d ) ；而 带1 电荷却减小了3 0 倍( 3 0 一f o l d ) 。 孽 第一章文献综述 h 3 c o c h n 图1 1 2 t o a c 的结构 f i g u r el - 1 2 2 d s t r u c t u r eo ft o a c 图1 1 3 t o p y l 的结构 n g u n1 - 1 3 2 d - s t r u c t u r eo f t o p y l 图1 1 4 t o p y 2 的结构 f i g u r e1 - 1 4 2 d - s t n l c t u r eo ft o p y 2 d e l i g e o r g i e v i 蚓等以2 - 亚氨基一3 甲基苯并噻唑啉衍生物和1 , 2 二甲基喹啉盐制各不 对称单次甲基染料，发现只有6 硝基取代物能形成不对称染料，其他的都为对称单偶氮 染料。 1 2 第一章文献综述 r = i ，c i ，h o c - 2 h 4 0 ；x = c h 3 s 吼c 1 0 4 ，b r ，j 图l - 1 5 2 亚氨基3 甲基苯并噻唑啉衍生物的反应 f i g u r e l - 1 5 r e a c t i o n s o f l h ed e r i v a t i v e s o f 2 - i m i n o - 3 - m e t h y l b e n z o t h i a z o l i n e s 同一位作者 3 7 1 将2 - 或4 甲基杂环季铵盐和n 烷基杂环的磺酸基化合物在无碱性介 质的情况下加热反应。将反应物一同熔融或在溶剂中回流，这两种情况下都有强烈的 s 0 2 的释放。用熔融方法，反应时间在1 分钟到几分钟之内就能完成，温度一般在1 5 0 2 5 0 之间，这取决于化合物的熔点和相对热稳定性。若反应物对热不够稳定的话，可 以在极性溶剂或混合溶剂中回流制备单次甲基化合物。溶剂或混合溶剂的沸点在1 0 0 2 0 0 间，反应时间为5 1 2 0 m i n ，大部分在1 5 2 0 m i n 之间。用上述两种方法制备单 次甲基染料的收率都很理想，一些反应的收率能达到9 5 1 0 0 ，这是一般有碱性介质 制备方法所不能达到的效果。 ，一 ，。 r 毗+ 坤j f i c 卜b 图1 - 1 6 在无碱性介质中制备碳菁染料的反应 f i g u r e l - 1 6 r e a c t i o n s o f p r e p a r a t i o n s o f c y a n i n ed y e s w i t h o u tb a s i ca g e n t s i s a c s s o n 3 8 1 等将化合物1 和2 接上固相树脂，化合物a 和b 随之与4 甲基毗啶或4 甲基喹啉盐部分缩合，颜色变化明显，得到四种不同颜色的产物：黄色的b o ，橙色的 t o ，紫色的b o 3 和蓝色的t o 3 。质谱分析：除有预期的产物外，还有少量未反应的 接在树脂上的4 一甲基吡啶或4 甲基喹啉盐部分。但不会干扰与d n a 结合的荧光光谱试 验。这种固相合成法由于省去了纯化步骤，使此类染料的合成得以简化。尤其是少量合 成时，固相合成法可以得到较纯的染料产品 、；，矿 一 第一章文献综述 一n 。以 n u b rh 越 u ； 1 ，弋： ，十o n p 扩一 “ a 尸 r n r 飞 。八屈毋 杜 d hh 占、瑚 b 抄 图1 1 7 四种菁染料的固相合成 f i g u r e1 - 1 7 s o l i d - p h a s y n t h e s i so ff o u rc y a n i n ed y e s 1 6 2 吲哚类碳菁染料 此类染料的吸收和发射波长大多位于5 5 0 1 2 0 0n m 区间内，属于近红外荧光染料。 在这个区域，生物分子的荧光背景干扰很弱，有较高的摩尔吸光系数。因此，有很高的 荧光检测灵敏度。 图1 - 1 8 吲哚类菁染料的结构 f i g u r e1 - 1 8 2 1 ) - s t r u c t u r eo fi n d o l ec y a n i n ed y e so = 1 ，2 ，3 ) 厅值的不同，染料的最大吸收波长也各有不同。一般来说，次甲基链上每增加一个 双键，染料分子的最大吸收波长红移约1 0 0n m 。但随着次甲基链的增长，染料的稳定性 随之下降。这是因为次甲基链越长，染料分子的共轭度越大，分子链的柔性增加，活性 氧对染料分子的进攻变得容易，光氧化反应也就越容易，导致稳定性的下降染料的光 氧化褪色反应主要是由于染科的白敏化所产生的活性态氧( 单重态氧及超氧负离子) 进 攻分子链而导致分子链断裂所致i ”。 1 4 第一章文献综述 b o y e r 删在桥链上引入六员环的同时，在环体中引入卤素原子，使染料的光稳定性 得以显著增加。其机理可能是因为当在次甲基链上引入不饱和环体结构时，一方面分子 链的刚性增加，减少了分子链自由旋转的机会；另一方面增加了光氧化反应时的空间位 阻，阻止了活性态氧对分子链的进攻，使光稳定性提高。 x = a x = 。 一c s 一 图1 1 9 引入不同基团的吲哚菁染料结构 f i g u r e1 - 1 9 2 d - s h - u c t u r e so fi o d o | ec y a n i n ed y e sw i l hd i f f e r e n tg r o u p s s h e a l y l 4 1 】和w i l l j 锄s 1 4 2 l 在六员环上引入了带有一n c s 基团的芳香环，被用于d n a 的 序列分析，荧光发射波长为6 8 1 衄，为近红外染料，生物分子的荧光背景干扰大大减少。 分子中的一n c s 基团能与一级脂肪胺作用，增加了染料的活性。 由于吲哚类菁染料具有摩尔消光系数大、与生物基质结合后荧光增强、易合成得到 在近红外及红外区有吸收的荧光染料等特点，因而被广泛用作近红外荧光探针。 w a g g o n e r