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a s i p p 微束装置计算机控制系统研究与实现 摘要 f k 单粒子束装置( s i n g e i o nm ic r o b e a mf a c i li t y ) 是一种可以将 粒子束的束径限制在微米量级的范围内，并将预定个数的粒子注入到 细胞中的某一指定位置的辐射装置。作为辐射生物学发展的前沿，单 粒子束装置为辐射生物学研究提供了一个强有力的手段并可以解决传 统研究方法无法解决的问题，在世界范围内受到广泛的重视。 中科院等离子体俪离子束生物工程研究室率先建成了国内第一台 单粒子微束装置。y 本课题作为实施单粒子束照射细胞系统的一部分， 主要任务是通过对a s i p p 微束装置计算机控制的研究，设计“a s i p p 微 束装置计算机控制系统”软件，确保实验过程中定量辐射的精确度和 定位辐射的准确性，实现真正意义上的“定点辐射”和“定量辐射”。 与此同时，对实验过程中产生的系列实验数据进行必要的分析，为 进一步进行离子束生物工程中的诱变方向性问题和估计低剂量电离辐 射的生物体效应研究提供理论依据。作者承担了微束装置计算机控制 系统的设计工作，完成了a s ip p 微束装置计算机控制系统的系统设计、 主程序以及样本架控制模块的设计；提出并实现了提高装置通量的相 关优化策略等。这些工作为我国在预定时间内建成第台单粒子微束 装置，填补我国在这一领域的空白起到了重要的作用，并为a s i p p 微 束在若干技术参数上赶超英美微柬奠定了基础。 本课题来源于国家自然科学基金资助、中科院重大仪器研制项目， 项鲁编号：1 9 8 7 5 0 5 4 ( 子项目) 。“十五”期间，单粒子微束装置的研 制又成为“十五”国家重点科技攻关项目“离舌噱应用技术研究”的 四大子课题之一，项目编号：2 0 0 l b a 3 0 2 b - 0 l 。y ? 关键词：离子束生物j 名学；微束施；控制程系统建幽系统设 计；微图像处理系统：串行通信；无缝集成；哈密尔顿问题 、一7 、+v 、，7 s t u d y & i m p l e m e n t a t i o n o ft h ec o n t r o lp r o g r a mf o rt h e a s i p pm i c r o b e a m a b s t r a c t as i n g l e - i o nm i cr o b e a mf a c i l i t yisas e to fr a d i a t i o ns y s t e mt h a tc a ni i m i tt h e d i a m e t e ro ft h ei o nb e a mt ot h em j cr o nl e v e la n dc a nd e l i v e rpr e d e f i n e dn u m b e r s o fi o nsi n t oa p r e d e f i n e da r e ao fac e l i asa na d v a n c e df a c i i i t y t e c h n i q u e o f r a d i a t i o nb i o p h y s i c s ，s i n g l e i o nm i c r o b e a mf a c i l i t ypr o v i d e dap o w er f u lm e t h o d f 0rt h es t u d yo fr a d i a t i o nb i o p h y s i c sa n dc a nb eus e dt os o l v et h ep r o b l e m st h a t t r a d i t i o nm e t h o d sc a n td e a lw i t h t h er e f or e ，m a n yc o u n t r i e sp u tah i g hp r e m i u m o nt h ed e v e i o p m e n to ft h et e c h n o i o g y k e yl a b o r a t or y o fi o nb c a mb i o e n g i n e e r i n g ( c a s ) ，i nt h ea s s i p ，iso n eo f t h ef o r e r u n n e r sw h od e d i c a t e dt ot h es t u d yo ft h em i c r o ir r a d i a t i o n t e c h n i q u c s t h ea s l p pm i cr o b e a mh a sb e e nc o ns t r u c t e da tt h ek e yl a b o r a t o r y o fi o nb e a m b i o e n g i n e er i n g t h i si sn op r e c e d e n tf ort h isi nc h i n a t h ea s i p pm i c r o b e a mh a s b r o u g h tw i d e s p r e a da t t e n t i o n ，a n dh a sp r o f o u n da n df a r - r e a c h i n gs i g n i f i c a t i o ni n b i o e n g i n e er i n g f i e i d s t h ist h e s is m a i n i y f o c u s e so n d i s c u s s i n gs t u d y a n d i m p l e m e r i to ft h ec o n t r o ip r o gr a mf ort h ea s i p pm i cr o b e a m t h ec o n t r o lp r o g r a m c a nb ed i v i d e di n t ot hr e ei o g i c a im o d u l e s ：m i c r o s c o p es t a g ec o n t r o l l e r c o u n to f t h en u m b ero fr a d i a t e dj o n sa n dc o n tr o lo ft h ee l e c t r o n i cb e a ms h u t t e r a n d m i c r o - i m a g i n gs y s t e m t h e m a i n t o p i c s i nt h ist h e s isa r ea s f o i i o w i n g ： pr e s e n t i n gd e t a i l so ft h em i cr o b e a mf a c i i i t y ，m c2 0 0 0 ，m i c r o s c o p es t a g e ，v e n u s - 1 i a n g u a g e ，m o d e i i n g o nt h ec o n tr o l pr o g r a mb a s e do nt h er e q u i r e m e n t sa n a l y s i s ， t h ec o n t r o is t r u c t ur ea n df 1 0 wc h a r t ，t h em a i nf r a m ef o rt h e i n t e g r a t e dp r o g r a m ， u t i i i z i n g a c t i v e xc o n t r o it o i m p l e m e n t s e r i a lc o m m u n i c a t i o nb e t w e e nt h e c o m p u t e r a n dm c2 0 0 0 ，s e a m i e s s i n t e g r a t i o n b e t w e e nv b a p p l i c a t i o n a n d m a t l a b ，p r o b i n gi n t os o m ef a c t o r st h a tm a yi n f l u e n c et h ec o n t r 0 1 i i n gp r e c is i o n a n dp r o v i d i n gs o m em e t h o dst os o l v et h e m o nt h eo t h e rh a n d ，t h er e l a t e dp i v o t a l pr o t o c o l sa n dt i p si np r o g r a m m i n ga n do p t i m i z i n gs t r a t e g i e sw i l lb eo f f e r e dt o o t h is pr o j e c t i s1 i s t e di n m a g n i t u d ei n s t r u m e n td e v e l o p i n gp r o j e c to fc h i n e s e a c a d e m yo fs c i e n o e s ( n o ：19 8 7 5 0 5 4 ) a n dn a t i o n a ls c i e n c e & t e c h n o i o g yk e y p r o gr a m ( n o ：2 0 0 1b a 3 0 2 b ) k e y w o r d s ：i o nb e a mb i o e n g i n e er i n g ；m i c r o b e a m ；c o n t r o i p r o g r a m ：m o d e l i n g ： m i c r o 。i m a g i n gs y s t e m ：s e r i a lc o m m u n i c a t i o n ；s e a m i e s si n t e g r a t i o n ；h a m i l t o n i a n c y c l ep r o b l e m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得盒胆王、业盔堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 凇姗懿唧愀蝴月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解垒起王些盔堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权盒胆王些盍堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：名 签字日期：年月日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话 邮编 姒) 其邓年 魏 嗍 鄂 样 致谢 首先，衷心感谢我的导师邓铁如教授、何晓雄教授在我两年多的研 究生学习期间，在学习和生活各方面都给了我无微不至的关怀。感谢 中科院等离子体物理研究所离子柬生物工程学重点实验室胡素华老师 在本人做课题期间给予的各种指导和论文进行期间提供的大力支持。 老师们严谨的治学态度、渊博的知识和对科学执着的追求，以及严以 律己、宽以待人的高尚情操使我倍受教益。在今后的工作、学习、生 活和科研中，我都将以老师们为榜样，牢记老师们平日的谆谆教诲。 特别感谢中科院等离子体物理研究所离子束生物工程学重点实验 室余增亮研究员为本人提供了良好的学习环境，感谢余老师在本人作 课题期间在学习、生活各方面给予的关心和帮助。余老师渊博的知识、 敏锐的洞察力、开拓进取的创新精神、一丝不苟的治学态度、对工作 的万分热情、对科学事业的执着追求、对学生诲人不倦无不让我受益 匪浅。 感谢程连运、王晓华、王旭飞等同学在中科院等离子体物理研究所 离子束生物工程学重点实验室期间给予的无私帮助，正是他们使我从 对微束系统一无所知到现在有了初步的了解和认识：衷心感谢实验室 的吴李君、许安、刘军红、姚建铭、王相勤等老师一年多来对本人的 关照；感谢李军、陈斌、张束清、吴瑜等老师对我的大力帮助；感谢 生物学小组的石怀彬、张鉴、李玉峰、程国旺、姚黎明同学们在相处 的日子里给予的帮助和提供的建议。感谢美国c o l u m b i a 大学的g e r h a r d r a n d e r s p e h r s o n 博士所给予的无私帮助。感谢中科院等离子体物理研 究所离子束生物工程学重点实验室所有的老师和同学们。 感谢2 0 0 0 级研究生刘成岳、张鉴、张学勇、孙林、朱晓翔、袁航、 时钟涛、王建国、张静、崔莉莉、王红艳、姚风薇、杨艳芳、刘彩霞 等给予的帮助。 最后，感谢我的父母、哥哥、姐姐多年来对我的无条件支持和那份 深深的爱! 对于我的爱人李燕和我的儿子胡皓冉，在攻读硕士的三年 中，我没有尽到作为丈夫和父亲应尽的责任，在此表示深深的歉意! 衷心感谢我的爱人李燕! 感谢所有帮助过我的亲人、领导、师长、朋友和同学! 胡智文 2 0 0 3 年1 月 鱼塑工些叁堂垡! ! ：堡兰! 二里 第一章绪论 1 1 前言 单粒子束装置，又被称为荷电粒子微束( c h a r g e d p a r t i c l em i c r o b e a m ) 装 置，是微束( m i c r o b e a m ) 装置的一种。荷电单粒子微束( c h a r g e d - s i n g l e - p a r t i c a l e m i c r o b e a m ) 是一种将粒子束斑的直径限制在微米量级范围内，并将预定数目 的离子注入细胞中某一特定位置的一种辐射装置。作为辐射生物学发展的前沿， 单粒子束装置已经成为当今世界上用来估计低剂量电离辐射对生物体效应的一 个强有力的手段，因而受到了高度重视。美国、欧洲数国、日本和中国等许多 国家都已经或正在开展这方面的研究工作。 中国科学院等离子体物理研究所离子束生物工程学重点实验室在国内率先 进行了这种装置的研制，从1 9 8 9 年起，中科院等离子体物理所在低能离子生物 学方向承担了多项国家和部委科研项目。如国家计委“九五”重点科技攻关项 目“离子束应用技术研究”、国家自然科学基金重大项目“低能离子与生物体相 互作用研究”等。它们在研究方向中都提出了单粒子束及单粒子生物效应研究 这一前沿问题。单粒子束建设的前期工作逐步展开，并以1 9 9 9 年成功申请中科 院重大仪器研制项目“单粒子束精确定位照射细胞系统”( 该项目于1 9 9 9 年获国家自然科学基金资助) 为标志进入主体研制阶段i ij 。目前，单粒子微束 装置的研制又成为“十五”国家重点科技攻关项目“离子束应用技术研究”的 四大子课题之一( 课题编号：2 0 0 l b a 3 0 2 b 0 1 ) 。 笔者有幸于2 0 0 1 年9 月开始到中科院离子束生物工程学重点实验室参加科 研工作，并进行硕士论文研究。作者承担了微束装置计算机控制系统的设计工 作，完成了a s i p p 微束装置计算机控制系统的系统设计、主程序以及样本架控 制模块的设计；提出并实现了提高装置通量的相关优化策略等。这些工作为我 国在预定时间内建成第一台单粒子微束装置，填补我国在这一领域的空白起到 了重要的作用，并为a s i p p 微束在若干技术参数上赶超英美微束奠定了基础。 在即将毕业之际，把本人所做的工作进行总结所以成此文，希望能有助于 我国第一台单粒子束装簧今后的进一步优化改进。 1 2 离子束生物工程学简介 离子是一种荷电粒子，在自然界中广泛存在。2 0 世纪后半叶，随着低能粒 子加速器和离子注入技术的发展，低能离子与物质相互作用研究对半导体工业、 微电子和材料科学产生了重大影响【2 1 。然而，由于低能离子能量低，射程短， s t u d y i m p l e m e n t a t i o no f t h ec o n t m lp r o g r a mf o rt h ea s i p pm i c r o b e a m - i - 仓肥t 业大学枷! i j 论文 第一素 长期以来，人们一直将与低能离子相互作用的研究对象局限于气体( 包括等离 子体) 、固体( 金属、半导体等) 和高分子材料等这些无生命的物质。无论国内 还是国外，低能离子的生物学作用及其在生物学中的应用研究一直未受到重视。 直到中国科学院等离子体物理研究所余增亮等人于1 9 8 6 年首次发现用低能n + 离子注入水稻种子诱发变异1 3j ，证实了低能离子束与生物体的相互作用。继而 开创了一个崭新的研究领域低能离子生物学。 1 2 1 离子束生物工程学 离子束生物工程学也叫低能重离子注入生物学，是八十年代中期诞生在我 国的一门边缘交叉新学科，离子束生物技术是具有中国自主知识产权的原始创 新技术，并已从国内走向世界。目前，不仅以中国科学院等离子体物理研究所 离子束生物工程学重点实验室为中心的我国大部分省市开展了这项研究工作， 而且美国、日本、英国、澳大利亚和泰国等也相继开展了这方面研究，日本还 将离子束生物技术列为“人类前沿科学计划”f 4 l ，作为优先发展的高科技项目， 将成为二十一世纪生命科学研究的支撑技术之一1 5 】。 自从离子束生物工程学诞生以来，在短短十余年时间里人们已经在诱变育 种、植物转基因、生命起源和进化以及环境辐射与人类健康等方面取得了一些 重要的阶段性研究成果，开辟了具有重要理论和应用价值的研究方向。在基础 研究领域，为分子生物学、遗传工程等方面的研究提供了新的手段和方法，新 的实验证据使得人们对低能离子在生命起源中的作用有了更多认识。特别是离 子束生物工程技术在工农业、医药业的应用带来了巨大的经济效益。目前，离 子束生物工程技术日益成熟，产业化获得初步成果，并在不断开创新的研究领 域。离子束生物工程学以揭示低能离子与生物体相互作用规律为目的，具有深 刻的科学意义和广阔的应用前景。低能离子束在生命起源、植物、微生物等方 面的研究和应用将对人类社会的发展产生巨大的推动作用。那么离子束与生物 体是如何相互作用的呢? 1 2 2 低能离子与生物体的相互作用原理 低能离子通常指能量低于m e v 级的荷能粒子。如果按照离子注入金属和半 导体的理论，几百k e y 的离子在生物体中的射程仅微米量级，似乎不能穿透几 十微米厚度的生物体( 如干种子) 的表层而到达胚部，生物效应也就无从谈起。 然而，研究发现农作物组织内部存在着不同层次的、杂乱无序的孔洞、空腔。 离子注入一方面对生物体表面产生溅射刻蚀作用，另一方面使得这些孔洞和空 腔被连通，形成渐深的通道，使后续的离子可以深入到遗传物质上，从而引起 损伤、变异等生物效应1 6 j 。 能量为几十至几百k e y 的荷能离子注入生物体后可以使质量、能量和电荷 共同作用于生物体，比其它电离辐射的作用更为丰富和复杂i7 1 。一般认为，离 子束作用于生物体时，最早发生的是离子与靶原子间库仑作用而进行的能量和 s t u d y i m p l e m e n t a t i o no f t h ec o n t r o lp r o g r a mf o rt h ea s i p pm i c r o b e a m2 台肥丁业火学坝l + 论文 第一竞 动量的转移f 引。在碰撞过程中，入射离子逐渐损失掉能量，转移的能量可引起 靶分子的电离、激发和化学键的断裂，如果作用发生在d n a 、酶等生物分子上 时，将会引起d n a 链断裂而导致生物特性的变化。另外，荷能离子与水分子作 用会产生o i r h + 等活性基团，它们会引起生物分子一系列的间接损伤。图1 1 是经5 0 k e v 铜离子注入的绿豆干种子子叶的扫描电镜照片。未经注入的子叶部 分细胞内淀粉粒饱满，分布规则；离子注入后，颗粒减少，出现明显的质壁分 离。 图l 一15 0 k e v 铜离子注入绿豆后子叶损伤深度扫描电镜照片( 4 0 0 ，左为对照) 随着注入离子因能量损失在生物体内慢化，在与靶原子的每次碰撞中，俘 获电子的几率增大。大约9 0 的注入离子将在细胞表面获得电子，成为中性原 子。只有一小部分注入离子进入细胞内部并最终与生物分子进行电荷交换，将 电荷“沉积”在细胞内部，发挥生物效应。 在电荷转移的同时，注入离子还以一定的几率与生物分子发生键合，将自 身的质量沉积在生物体内。离子的质量沉积产物可以改变细胞内分子成份，会 影响细胞内的酸碱平衡。例如注入h + 可使细胞内的p h 值减小。 因此，离子束注入生物体内，将产生质量沉积、能量转移和电荷交换效应。 这使得离子束生物效应具有损伤轻、突变谱宽、突变率高等特点1 9 ，是传统辐 射如电、磁、光辐射、x 射线等主要是能量效应的手段所难以实现的。利用动 量过程引起的溅射，离子束能象手术刀那样对细胞进行刻蚀和加工，也使得离 子束定点定量注入生物体成为可能。 当然，离子和生物体相互作用的机理十分复杂。从离子注入到生物效应的 出现，是一个宽广的时空过程。以细胞学的角度看，离子束与生物体相互作用 经历了损伤的原初过程和增加过程。原初过程包括注入离子的能量沉积、质量 沉积和电荷转移三部分，它首先引起生物体分子水平上的变化，最终通过损伤 的增强作用而引起各种生物效应。但这些效应不一定可遗传，有些在生长过程 中能自我修复，有些经过若干代后，一小部分性状被固定下来。生物体是一个 有机整体，局部损伤会引起其它细胞的连锁反应，使得最终结果十分复杂。 离子注入生物体可以用m o n t e c a r l o 方法来模拟1 8 1 。其基本思想是跟踪单 s t u d y i m p l e m e n t a t i o no f t h ec o n t m lp r o g r a mf o rt h ea s i p pm i c r o b e a m - 3 - 台肥工业大学顺f ：论义 鹕一章 个注入离子与靶的碰撞级联细节过程，通过 随机模拟来确定碰撞体系中所有原子的运动 轨迹。对大量离子的模拟计算可以确定其统 计规律，从而展示级联过程的物理图像。图 i - 2 模拟了2 0 k e y 的n + 注入到丙氨酸中的级 联碰撞径迹，明显表现出离子注入的方向性。 利用m o n t e c a r l o 方法，分别对 | 、h e ”注 入到液态水( h 。0 ) 、m y l a r 膜( c 1 0 ，1 1 - 8 ， 0 4 ) 、成人骨头( 1 l 一1 0 ，c 一2 0 ，o - 6 5 ，n - 4 ，s - o 2 ，n a 一0 2 ) 、人体 皮肤( c a 一2 3 ，p 1 0 ，h - 3 ，c 一1 6 ，o - 4 4 ，n - 4 ，s - o 3 ) 等样品中的 射程分布进行了计算，结果如图1 3 。可见注入的深度随离子能量的提高而增 加，h + 比质量数大的h e 穿透能力更强。幽卜2n 在丙氨酸中的模拟径迹 离j ：撞证k e y j：影一=-liquid w a t e r ! 图i 3 不同能垃离子注入不同材科时的注入深度( 左为h + 、右为h e “) 细胞的大小是微米量级，植物种子的胚芽经过处理，离表面也是微米量级。 从计算结果可以看出离子要注入并穿透细胞，离子束能量至少需几百k e v 。由 于离子注入生物样品时还存在许多间接作用如真空渗透效应、隧道效应、热扩 散效应等因素，因此实际注入深度比计算值要大一些。 1 2 3 离子束生物学应用现状 离子束生物学的研究方向主要包括诱变育种、离子束介导转基因、低能离 子与生命起源、环境辐射与人类健康等。随着生物技术挑战信息技术的到来， 离子束生物工程必将得到更深入广泛的发展和应用。据统计，到目前为止，已 有1 7 项创新成果和一批有重要价值的育种材料获认定，其中1 1 个高产、优质、 抗病虫农作物新品种和6 个微生物新菌株经推广应用，到目前已累计创1 7 亿元 人民币的经济效益i ”】。 1 2 3 1 诱变育种 大量实验证明，低能离子辐照下多种生物体具有“马鞍型”存活剂量效应 曲线j ，即随着注入剂量增加，生物体的存活率先降后升，到达峰值后又急剧 s t u d y i m p l e m e n t a t i o no f t h ec o n t r o lp r o g r a mf o rt h ea s i p pm i c r o b e a m 下降。较高的剂量下，低能离子注入仍能保持较高的存活率，大大增加了有用 突变体的数量，因此，离子注入用于作物诱变有可能在损伤轻的情况下获得较 高的突变率和较宽的突变谱。为生物的遗传改良开辟新的途径i i “。 在植物方面，经离子束诱变已获得了水稻、小麦等新品种。几年里，经离 子注入获得有价值的育种材料已有3 0 0 0 多份，从中选育的优良品种已经大面积 推广。其中晚粳d 9 0 5 5 被评为安徽省优质米新品种【l ”，皖麦3 2 号已通过品种 审定。另外，离子注入在诱导棉花变异、蔬菜育种方面也有良好效果1 1 4 j i ”】。 在诱变改良微生物方面，用离子注入法选育高产菌株，已经大幅度提高了 多种工业微生物发酵产物的产量。姚建铭等对d 一淀粉酶和利福霉素产生菌进行 改良，筛选到高产利福霉素菌种，其发酵水平比出发菌高4 0 ，口一淀粉酶菌株 酶活水平由3 0 0 u m 1 提高到5 1 0 u m l 【i 。许安、虞龙等利用离子注入技术使二 步v c 混合菌山梨糖到古龙酸的克分子转化率从原来的8 0 稳定地提高到9 4 ， 创国内外二步发酵法新高，高产菌株已供企业生产使用，新菌株在3 0 0 吨发酵罐 上糖一酸克分子转化率最高达9 7 ，处于国际领先水平，使我国两个最大的v c 厂家每年增加效益数千万元，大大提高了我国v c 生产的国际竞争力7 j 。经离 子注入筛选的花生四烯酸( a a ) 生产菌生物量3 5 9 l 发酵液，总脂占4 5 ，其中a a 占总脂的5 0 以上，2 5 0 l 气升式发酵罐中，a a 得率为4 1 3 9 l 【l ”。仅两年多的 时间，产品占国内市场的9 5 ，并出口东南亚和南美。截止目前为止，菌种发 酵水平仍处于国际最好水平。离子注入选育高产利福霉素菌株【i9 】等生产菌也取 得了明显的成效。 离子注入也活跃在分子生物学领域。鲁润龙教授报道了离子注入体外质粒 引起超螺旋环状d n a 断裂而成为开环d n a 结构口。 1 2 3 2 离子束介导转基因 低能离子注入的质量沉积效应很容易对细胞产生刻蚀作用，打破细胞壁这 一屏障。这种刻蚀作用提供了外源遗传物质进入细胞的途径，在此基础上发展 起来的离子束介导遗传转化技术已在水稻、棉花、小麦等多种植物上取得成功 2 1 ”2 3 】。日本也有研究小组报道用离子束介导的方法将外源基因导入烟草花粉并 再生出转化植株f 24 1 。与基因枪法等其它转基因方法相比，离子束介导法的优势 在于：取材方便，一次可以大批量操作；注入离子的溅射刻蚀产生的微孔和孔 洞形成了外源d n a 的良好通道，离子所带的正电荷还对带负电荷的外源d n a 产 生向内拉力；同时，注入离子对细胞内d n a 的轻微损伤更有利于转入d n a 的重 组和整合i 。j 。 借助离子束介导的方法转移活性裸露d n a 大分子已成为当前基因工程研究 的热点。吴敬德等通过离子束介导法将紫玉米总d n a 导入水稻品种中，在稳定 遗传的变异株上表现出供体玉米的紫色性状【2 “。 宋道军等用离子束介导将银杏供体d n a 导入西瓜品种中，银杏内酯在西瓜 s m d y i m p l e m e n t a t i o no f t h ec o n t r o lp r o g r a mf o rt h ea s i p pm i c m b e a m5 含肥丁业大学f i ! j l 论文 筇一章 品利，中的表达量为4 5 9 9 9 8 m g g ，实现了超远缘分子杂交1 2 ”。离子束介导远缘 杂交使得人们可将某些不同品种的优势组合起来，创造下一代优良新品种。 1 2 3 3 离子束与生命起源和进化 生命起源一直是困惑学术界的难题之一。现代科技成果证明离子在生命活 动中起着十分重要的作用。王相勤等人1 2 8 】通过低能离子注入生物小分子的研 究，发现n + 注入乙酸钠可形成甘氨酸钠，n + 注入甲酸盐、乙酸盐不仅能形成晴 基，而且能形成环状氨，溶于水后形成新的氨基酸。由此可以推测，原始大气 中的氮电离后，注入并沉积到地表有机盐分子中引起靶原子移位和重排，可能 是最初生物有机小分子形成的重要途径之一。 1 2 3 4 环境和人类健康 一个世纪以来，人们对电离辐射给予了特别的关注，其心情是兴奋与恐惧， 希望与不安。兴奋与希望是因为电离辐射给人类带来了很多前所未有的好处， 能够解决人类生存发展面临的许多难题，能够诊断和治疗人体的疑难疾病；恐 惧与不安是因为电离辐射同时又存在着明显的或潜在的危险，过量的辐射或使 用不当会伤害人体，影响健康，对人类造成危害或灾难。 对于放射性职业人员和社会公众一般所关心的是低剂量下( o 5 g y ) 电离 辐射产生的生物效应问题。对于非随机效应，这个低剂量值远低于发病的阈值， 因此不必担心；而对于随机效应由于没有剂量阈值，只要受到照射，不管多少 都可能产生生物效应引起病变，这正是人们所忧虑的问题之一。遗憾的是，由 于现实中没有发现在低剂量下生活和工作的人群，因电离辐射导致导致的恶性 病变与其他人群有明显的不同，无法得到确切的估计。现在人们只能根据高剂 量下生物效应的结果外推和大量动物实验的结果，对这一问题做出统计估计。 但近些年的大量研究表明，将高剂量的结果外推到低剂量区域可能并不能反映 事情的真实情况。 实际上，人类受到来自两个方面的辐射源的照射：天然放射性源和人工放 射源。人类在地球上受到三类天然放射源的照射：宇宙射线、宇宙放射性核素 和原生放射性核素。宇宙射线是来自地球外层空间的高能粒子流，有初级宇宙 射线和次级宇宙射线之分。宇宙放射性核素是由初级宇宙射线与大气中各种元 素的原子核发生作用时产生的。原生放射性核素是从地球诞生至今一直还存在 于地壳中的放射性核素。天然放射性源是客观存在的，它对人体的照射称为天 然本底辐射。而人工核辐射源的照射主要包括：医疗照射、核试验下落灰、核 动力生产中的废物和放射性同位素技术应用所使用的加速器、反应堆和放射源 等。自然界中，粒子辐射不管是天然的还是人工的，总有少数有静止质量的粒 子注入到生物体内，影响生物的进化和公众健康。美国肺癌死亡人群中，每年 约有一万五千人因居室氡气粒子入射引起的。可是，辐射生物学一直以来仅考 虑能量沉积造成的损伤，即使八十年代兴起的重离子治疗肿瘤研究，仍然回避 s t u d y i m p l e m e n t a t i o no f t h ec o n t m lp r o g r a mf o rt h ea s i p pm i c r o b e a m 6 鱼坐王些厶兰些! ：堡兰 一一! 二兰 了注入肿瘤部位的慢化离子沉积作用。 调查研究表明：我 国居民受到的天然放射 性照射水平比世界正常 本底地区偏高，这是因 为我国一些地区土壤中 放射性比活度偏高，造 成我国食品中天然放射 性核素比活度也偏高， 居民食入后受到的剂量 会有所增加。我国居民 每年受到的各种电离辐 射剂量当量平均值为 图i 4 我国国民受到的各种电离辐射剂量比较2 4 8 m s v 人，每部分的 贡献如图1 - 4 所示，天然本底是最主要的，为9 3 4 ：在人工放射源中，医疗 照射占很大比例【2 引。人类永远关注自身的健康，并力求采用先进手段攻克疾病。 离子束生物技术为此提供了新的有效手段。如吴李君博士等人【30 j 模拟居室氡气 放射的c t 粒子对哺乳动物细胞的诱变作用，发现细胞存在核外损伤的目标，也 就是说，居室环境中氡气的危害比原来估计的要大得多。文章在美国科学院 院刊上发表，引起普遍关注。他们的研究还表明，即使低于5 k e v 的离子同 样可以引起哺乳动物细胞突变。而环境中的静电甚至可以产生1 0 万伏的高压。 可见，环境中低能离子、低剂量暴露对健康的影响不容忽视【3 。特别地，离子 注入技术可以模拟太空辐射对人体的危害作用，为人类太空飞行事业提供科学 的依据和指导。 总之，离予束生物工程学作为一门年轻的、正在蓬勃发展的交叉学科，是 物理科学与生命科学相结合的产物。十多年来，离子束生物工程学以其学科交 叉的优势显示出强大的生命力。 i 3 单粒子束装置研究的重大意义 i 3 1 各种微束装置简介 历史上用于辐射生物学的微束装置种类很多，具体来说，可以分为两大类： 电磁微束和粒子微束。其中，电磁微束主要包括紫外线微束、激光微束和x 射 线微束；常见的粒子微束主要包括以下几种：电子微柬、质子微束、口粒子微 束等【j ”“j 。其中最简单的是建立在荧光显微镜下的聚焦紫外线。 1 3 2 现代微束装置建立的必要性 s t u d y & i m p l e m e n t a t i o no f t h ec o n t r o lp r o g r a mf o rt h ea s i p pm i c r o b e a m 一7 垒坐王些查兰塑! ! 堡壅一一笙二里 历史上用来辐射生物学的微束种类很多，而且已经有了一些粒子微束，最 早的可追溯到二十世纪五十年代【3 1j 。但由于早期技术落后，这些粒子微束普遍 存在的缺点是：所得到的束线的能谱很差、剂量较低而且因为缺少粒子探测系 统而使辐射的剂量难以精确控制，而且，由于当时技术的限制，每次只能辐射 数目很少的细胞。这些不足严重地制约了探测细胞中辐射敏感点的研究工作的 深入进行，不能回答类似于低剂量辐射下的细胞生物学效应问题。 近几十年来，随着各种新技术的出现，使得现代微束装置( 单粒子束装置) 的出现成为可能。单粒子束将提供对选定细胞注入预定数目的离子并精确地注 入到指定位置的手段，解决了以往“宽束”所不能解决的定点定量辐射问题， 可用来研究传统方法所不能解决的一系列重要的辐射生物学问题。装置建成后 将为相关领域研究提供技术支撑，如人口与健康领域的信号在细胞内、细胞间 传导途径、细胞近旁效应等：农业高新技术领域中的细胞手术和分子育种；新 材料领域的微孔膜制备；空问技术领域的航天电子器件单粒子翻转；环境领域 的环境低剂量辐射与细胞癌变等。特别是单粒子束细胞手术，将在动植物和微 生物育种上发挥巨大作用，既可促进相关行业科技进步，又可创造重大社会经 济效益。 1 3 3 国外比较成熟的两家单粒子束装置简介 低剂量辐射 生物效应的研究 是目前国际上研 究的热点之一， 其关键是研究单 个粒子照射单个 细胞产生的生物 效应以及研究单 个细胞受到照射 以后相邻细胞的 通信情况；环境 低剂量辐射危害 人类健康的研究 例如因居室氡粒 子辐射引起的肺 癌也需要一种新削1 - 5g r a yl a b 的荷电粒子微柬束线示意图 的辐照手段。从辐射生物学看，向细胞特定部位投射一个或多个粒子，可以定 量研究能量分配与生物效应的关系。 s t u d y i m p l e m e n t a t i o no f t h ec o n t r o lp r o g r a mf o rt h ea s i p pm i c m b e a m 8 台肥工业大学舰f j 论文 第一章 九十年代以来，欧美和f 本把离子束作为生命科学研究中的支撑技术之一 而受到高度重视。1 9 9 5 年，f 1 本微束单细胞照射装置建成，1 9 9 6 年离子束照射 拟南芥菜获得2 0 的高突变率，现正克隆突变基因用于植物基因工程。几乎在 同时，美国、英国、意大利等发达国家竟楣开始开发单粒子束细胞定位照射系 统来实现定点定量辐射，以探讨单一粒子与生物体的相互作用。研究的目的， 一是利用离子冲击发光和讯号的检出、图像的再构成从原子分子尺度上计测细 胞的精细结构，二是利用离子束超微加工、细胞手术、部分损伤和切割基因， 这对阐明细胞的功能，以便人类将来更好的利用这些功能以及发展细胞工艺学， 有目的的控制生物过程等具有重要意义p 。 到目前为止，世界上已建立起来的用于细胞生物学实验的微束装置( 研究 低离子范畴) 有四个：英国的g r a y l a b o r a t o r y c a n c e r r e s e a r c h t r u s t m i c r o b e a m ， 美国的c o l u m b i au n i v e r s i t yr a r a fm i c r o b e a m ，美国的t h ep a c i f i cn o r t h w e s t n a t i o n a ll a b o r a t o r y 和德国t h ed a r m s t a d tm i e r o b e a m 。这些装置的主要参数见 表卜1 ： 一一j 表1 1 世界上已建成的四台单粒子束装置主要参数对照表 g r a y 实验室的装置更适合于处理单个细胞受到照射以后研究相邻细胞的 通信；c o l u m b i a 大学的装置处理速度快，每小时可达3 6 0 0 个细胞。这两台装 置都是利用v a nd eg r a a f f 加速器把离子加速至4 m e v 左右再通过束传输系统 进入瞄准器，形成单粒子束。装置的主要部分包括加速器、束线传输、粒子的 s t u d y i m p l e m e n t a t i o no f t h ec o n t r o lp r o g r a mf o rt h ea s i p pm i c r o b e a m9 台肥= r ： 业大学坝i ：论文 ! f ；一章 准直与探测、细胞识别与计算机控制等，其中粒子的准直和探测是关键。专门 编制的计算机控制程序可对细胞自动定他、照射和对被照射过的细胞进行回访。 将宽束转变为微米量级束径微束的关键部件是蹒准器。而离子探测器和束线电 子开关的组合为定量辐射提供了依据。侈：就探测器来说，美国c o l u m b i a 大学和 英国g r a y 实验室分别使用了气体电离室和闪烁体探测器。就探测位置来看，美 国的气体电离室探测器属于细胞后探测，而英国的闪烁体探测器属于细胞前探 测。从探测的效果这一角度来看，这两种探测方法各有利弊【3 8 】。 图1 6 细胞前探测示意图( g r a y 实验室) 图1 - 7 细胞后探测示意图( c o l u m b i a 大学) 单粒子束技术涉及了核物理、真空技术、生物学、电学、光学、材料科学、 计算机图像处理和控制技术等多门学科。图1 8 是单粒子束装置原理图，它包 括离子束的产生、加速、传输、准直、粤l 粒子检测和控制、细胞精确定位、细 胞前后的粒子数探测、细胞图像在线分午j ；等等。 图1 8 单粒子月f 系统原理图 当然，单粒子束装置也随着技术进步和实验要求提高在不断完善。未来， 微束束径将缩小到微米以下，照射速度提高到5 0 0 0 1 0 0 0 0 细胞d , 时，并采用 自动聚焦等手段来提高精确定位照射的糕度。 1 4 本论文研究自】主要结构和内容 为了进军国际前沿，中科院离子束生物工程学重点实验室正致力于发展单 粒子束技术。“九五”期间，等离子体所在。国家自然科学基金的资助下，分别派 员前往了美国c o l u m b i a 大学、英国g r a y 实验室参加微束辐射细胞研究工作， 并引进了美国t e x a s 大学赠送的c n5 5 m ：v 静电加速器。同时，研究室有物理、 s t u d y & i m p l e m e n t a t i o no f t h e c o n t r o lp r o g r a m f o r t h e a s i p p m i c r o b c a m 1 0 台肥t 业人学坝f 。论文 第一章 化学、生物、工程、计算机等背景的研究人员可进行学科交叉，在以往的离子 束生物工程学装置的研制中已取得丰硕成果，生产加工方面与等离子体所研制 中心合作。因此，研制单粒子束精确定位照射细胞系统的条件完全成熟。该项 目还获得了1 9 9 9 年国家自然科学基金面上项目的资助。“十五”期问，单粒子 微束装置的研制又成为“十五”国家重点科技攻关项目“离子束应用技术研究” 的四大子课题之。年底a s i p p 微束装置的建成填补了我国在这一领域的空白。 本课题作为实施单粒子束照射细胞系统的一部分，主要任务是通过对 a s i p p 微束装置计算机控制的研究，设计“a s i p p 微束装置计算机控制系统” 软件，确保实验过程中定量辐射的精确度和定位辐射的准确性，实现真正意义 上的“定点辐射”和“定量辐射”。与此同时，对实验过程中产生的一系列实验 数据进行必要的分析，为进一步进行离子束生物工程中的诱变方向性问题和估 计低剂量电离辐射的生物体效应研究提供理论依据。本论文主要围绕本课题的 目标和内容展开： 第一章回顾了离子束生物工程学的发展历史，简单介绍了离子束生物工程 学的学科特点及基本原理，论述了发展单粒子束装置的重要意义。 第二章介绍了a s i p p 微束装置的特点、发展目标，以及建立a s i p p 微束装 置计算机控制系统的必要性和作用。 第三章详细讨论了a s i p p 微束装置系统控制结构、系统流程、计算机控制 系统系统设计以及优化策略。 第四章主要介绍了细胞辐射过