（微生物学专业论文）含羞草根瘤菌的数值分类及种群鉴定.pdf

摘 要 i 摘 要 本论文采用表型性状研究、sds-page、16s rdna 全序列分析、dna-dna 杂交 测定及 g+c mol%等方法对分离自云南省西双版纳地区的 66 株含羞草根瘤菌进行了种 群地位的研究及环境污染物耐受性方面的测试，同时从含羞草根瘤菌的分类、研究方法 及种群的鉴定等方面对含羞草根瘤菌的研究进行了综述。 对 16s rdna pcr- rflp 所获得的 5 大类群的代表菌株进行 16s rdna 全序列克隆 测序。 20 株代表菌株在系统发育树中归于 3 个系统发育分支， 其中代表菌株 hbu66044、 hbu66029 等 10 个菌株位于 burkholderia 属；代表菌株 hbu66322、hbu66194 等 9 株 菌位于 cupriavidus 属；菌株 hbu66289 位于 rhizobium 属。 对66株供试菌株进行了89项生理生化和抗性研究，结果表明分离自含羞草植物的根 瘤菌具有较丰富的表型多样性，且大多为快生根瘤菌，归于rhizobium、burkholderia和 cupriavidus三个系统发育分支，同时发现了一批可以耐高盐和高抗生素的抗逆性菌株。 通过sds-page全细胞蛋白电泳、box-pcr分析进行研究，发现这两种方法获得图谱类 型较多，且菌株图谱类型大多依宿主及采集地点不同而表现出差异。结合表型生理生化 结果，将多种方法所得性状、特征相同菌株归为一种类型，最终将所有66株含羞草根瘤 菌归分为55个表型和遗传型菌株类型。 经 dna-dna 杂交及 g+c mol%测定结果可知，菌株 hbu66286 与模式菌株 burkholderia phymatum lmg21445 杂交同源性达到 83.4%，g+c mol%也在 burkholderia 属的 g+c mol%范围内（6467%），符合种内水平，说明是该菌株为瘤状伯克霍尔德 菌（burkholderia phymatum） 。菌株 hbu66322，hbu66194，hbu66166，hbu66232 与其 16s rdna 全序列同源性最高的模式株 cupriavidus taiwanensis lmg 19424 dna-dna 杂交值在 060%之间，且 g+c mol%也接近模式株 g+c mol%（67.3%） 。 菌株 hbu66049，hbu66029，hbu66044，hbu66305 与其同源性较高的模式株 burkholderia phymatum lmg 21445 的 dna-dna 同源性在 060%之间，g+c mol%也 在 burkholderia 属的 g+c mol%范围内。 综合以上研究表明，分离自云南版纳地区的 66 株含羞草根瘤菌归于根瘤菌的 3 个 属，分别为 rhizobium、burkholderia、cupriavidus，其中菌株 hbu66322，hbu66194， 摘 要 ii hbu66166，hbu66232、hbu66029，hbu66044 可能是不同于已知种的 dna 杂交新 种。各类群代表菌株对重金属及苯酚有较强的耐受性，而且部分菌株还可耐高盐、耐酸 碱并能耐一定浓度的抗生素，为根瘤菌应用于土壤修复应用与研究提供了理论依据。 关键词 含羞草 根瘤菌 种群鉴定 数值分类 dna-dna 杂交 abstract iii abstract this thesis reviewed recently developed rhizobial systematics, summarized the main methods applied in rhizobia identification and studied on the heavy metal and phenol tolerance. the phylogenetic positions of representative strains symbiotic with mimosa were revealed by 16s rrna gene sequences. it indicated that all strains separated into rhizobium、 burkholderia and cupriavidus.the representative strains hbu66117 、 hbu66074 、 hbu66003、hbu66305、hbu66304、hbu66247、hbu66049、hbu66044、hbu66029、 hbu66286 were located in the subbranch of burkholderia.the strains hbu66294、 hbu66322、hbu66194、hbu66166、hbu66232、hbu66133、hbu66131、hbu65028、 hbu66045 distributed in the cupriavidus branch, and hbu66289 in the rhizobium genus. sixty-six rhizobial strains were studied by numerical analysis of 89 phenotypic characteristics.the results showed that 45 of all tested strains were clustered into 5 groups at a similarity level of 80%. the strains in this study with a high level resistance to saline、ph、 antibiotics were found. some strains can resist to 5% nacl, and grow at yma medium with ph12.0, some strains even resisted to 300 g/ml of antibiotic. this result showed that there is a great phenotypic diversity among the isolates. in order to indentify the strain furtherly, whole cell protein sds-page and box-pcr were applied to central rhizobial strains. the patterns of sds-page and box-pcr showed that it can get more message from the strains. based on the results of above methods, all strains were classified 55 different styles of all strains . central strain hbu66286 which were related to burkholderia were chosen for determination of dna base composition and dna-dna hybridization in comparison with the type strains of related described rhizobial species. the dna relatedness between hbu66286 and b.phymatum was 83%, which demonstrated that hbu66286 belonged to b.phymatum. and the dna homology of the representative strains hbu66322、hbu66194、 hbu66166、hbu66232 with reference strain c.taiwanensis lmg19424t ranged from 0 60%.the dna homology of the representative strains hbu66049、hbu66029、hbu66044、 hbu66305 with reference strain b.phymatum lmg21445t ranged from 0-60%.the g+c abstract iv mol% of them were all in the g+c mol% range of the genu burkholderia or cupriavidus.it showed that they may be new distinct new species. to determine that the strains hbu66322，hbu66194，hbu66166，hbu66232， hbu66049，hbu66029，hbu66044，hbu66305 that isolated from mimosa spp. related to burkholderia、cupriavidus species, the ability to renodulate the 10 species of leguminous plants were checked, over a four-week period, all of test strains only can formed nodules with the leucaena glaucaplant on the roots of plant. nine rizobium strains from mimosa were used to analyse resistance and the maximum resistance level （mrl） to heavy metals and phenol.the result showed that most of strains had strong resistance for heavy metals and phenol.some strains even were tolerant to zn2+of 5 mmol/l、hg2+ of 0.5 mmol/l、cu2+ of 0.6 mmol/l、phenol of 1700 mg/l. meantime the strains of burkholderia have stronger resistance than the strains from cupriavidus. from above analysis, we discovered that strains isolated from nodules of mimosa have great diversity. the strains isolated from mimosa were mainly distributed in rhizobium、 burkholderia and cupriavidus branches respectively.meantime 8 strains may be new speises. these finding also shows that the strains of burkholderia have stronger resistance than the strains of cupriavidus. this will be especially meaningful if we can apply these strains with stronger rolerance of heavy metals and phenol to the contaminated region. key words mimosa spp. rhizobia microbial identification numerical taxonomy dna- hybridization 第一章 绪论 1 第一章 绪论 1.1 引言 根瘤菌是广泛分布于土壤，能与豆科（或榆科）等植物共生结瘤固氮的一类革兰氏 阴性细菌的总称1,2，其菌体着色不均匀呈环节状，正常细胞以鞭毛运动，无芽孢3。它 可与植物形成共生体，也可作为腐生菌或内生菌存在土壤或非豆科植物体内。根瘤菌与 豆科植物形成的共生体系可将大气中的游离态n2还原为化合态氮， 既可满足宿主植物的 需要，还可将多余的氮提供给与之混种或间种的植物3,4。 1888年，荷兰学者beijerinck m w用植物叶片汁培养基第一次成功分离到根瘤菌， 并将其命名为bacillus radicicda。100多年来，根瘤菌-豆科植物共生固氮体系受到生物界 的广泛关注，至今并已成为该研究领域的热点，长盛不衰4。在该共生体系中豆科植物 可为根瘤菌提供能源和固氮酶适合的环境，是自然界生物固氮最有效的形式4-6。据初 步统计，全球每年生物固氮量达1.75 108t 7，是世界工业氮肥产量的4.37倍8,9，其中根 瘤菌-豆科植物共生体系所固定的氮约占全球生物固氮总量的65% 10,11， 相当于全世界工 业合成氮肥量的2倍，在生物固氮中占具首要地位12。 依疏密关系可将微生物与植物划分为共生固氮、联合固氮和自生固氮三种体系。共 生固氮体系中有根瘤菌与豆科植物共生和弗兰克氏菌与非豆科植物共生等，其中以根瘤 菌与豆科植物共生体系固氮能力最强。 世界豆科植物有748属近2万种，然而已研究与根瘤菌共生关系的豆科植物还不足 0.5%， 绝大部分植物根瘤菌的分离和研究还处于空白状态。 我国豆科植物有108属约1100 种13，在不同条件下都有分布，与之相应的根瘤菌种类多，分布广，具有极大的开发研 究空间。传统的根瘤菌主要隶属于变形杆菌纲，随着研究的深入，有研究者在-变形 杆菌纲也发现了能与豆科植物共生的根瘤菌，burkholderia tuberum和burkholderia phymatum是首次被报道的-变形杆菌纲根瘤菌（简称-根瘤菌）14。-根瘤菌的发现扩 大了根瘤菌的范围，为根瘤菌的分类研究开辟了新方向15。与含羞草共生的根瘤菌大部 分为-根瘤菌，且对重金属及有机污染有较强的抗性。如能将这些根瘤菌应用到污染的 土壤、矿山，或接种到豆科植物使之形成根瘤，将能起到改良土壤和防止水土流失的作 用16。 河北大学理学硕士学位论文 2 1.2 含羞草根瘤菌 1.2.1 宿主植物含羞草简介 含羞草（mimosa spp.），原产自美洲热带地区，少数分布于全球的热带、温带地区， 约有500种。早年引入我国，主要分布于华东、华南、西南等地，生于旷野荒地、灌木 丛中，长江流域常有栽培供观赏。全草可供药用，有安神镇静的功能，鲜叶捣烂外敷治 带状泡疗17,18。 图1-1 含羞草图片 table.1-1 the picture of mimosa 1.2.2 含羞草根瘤菌 随着对根瘤菌的深入研究，发现与豆科植物共生的根瘤菌具有极大的多样性，与宿 主的关系也非常复杂。一株菌可以在不同种甚至不同属的植物中结瘤；同一种植物可以 与不同种属的根瘤菌结瘤。截止到2010年3月中旬，已合格发表的根瘤菌共有13个属76 种，其中67种隶属于-变形杆菌纲，9种属于-变形杆菌纲19 (见表1-1)。 对含羞草根瘤菌的研究始于 1969 年， campelo 和 doberince 两位学者初次对含羞草 根瘤菌进行了分离20。 相对于其它豆科植物， 与含羞草共生结瘤的根瘤菌种类较为多样、 复杂且特殊。 2001 年 9 月， 台湾学者陈文明发表了分离自含羞草植物的 变形杆菌纲根 瘤菌（以下简称 -根瘤菌）21，继台湾诺尔斯通菌 ralstonia taiwanensis 之后，chen， vandamme 及 barrett 等学者对 m.pudica、m.diplotricha、m.bimucronata、m.scabrella、 m. casta 和 m. pigra 等含羞草类植物的根瘤菌做了大量系统研究，发现其根瘤菌主要归 于 burkholderia 和 cupriavidus 两个分支19-21。 第一章 绪论 3 表 1-1 截止 2010 年 3 月已发表的根瘤菌种及其宿主 table. 1-1 the current rhizobia species and their hosts（updated march, 2010） 根瘤菌属 根瘤菌种 宿主植物 rhizobium r. cellulosilyticum r. daejeonense r. etli r. galegae r. gallicum r. giardinii r. hainanense r. huautlense r. indigoferae r. legumi nosarum r. loessense r. lusitanum r. miluonense r. multihospitium r. mongolense r. oryzae r. phaseoli r. pisi r. sullae r. tropici r. undicola r. yanglingense 分离自杨树锯末22 分离自氰化物处理器23 phaseolus vulgaris , mimosa affinis24 galega orientalis25 phaseolus vulgaris26 phaseolus vulgaris26 desmodium sinuaturn27 sesbania herbacea28 indigofera spp. 29 pisum sativum, trifolium pratens vicia faba, et al 30 lespedeza spp. 31 phaseolus vulgaris32 lespedeza chinensis33 robinia pseudoacacia34 medicago ruthenica35 oryza alta36 phaseolus vulgaris30 vicia faba30 hedysarum coronarium l. 37 phaseolus vulgaris, leucaena leucocephala38 neptunia natans39 gueldenstaedtia multiflora40 mesorhizobium m. albiziae m. amorphae m. caraganae m. chacoense m. ciceri m. gobiense47 m. huakuii m. loti m. mediterraneum m. plurifarium m. septentrionale m. tarimense47 m. temperatum m. thiogangeticum m. tianshanense albizia kalkora41 amorpha fruticosa42 caragana ermedia43 prosopis alba44 cicer aretinum45,46 astragalus sinicus46,48 lotus corniculatus46,49 cicer aretinum46,50 acacia senega51 astragalus adsurgens52 astragalus adsurgens52 分离自蝶豆(clitoria ternatea)的根际53 glycyrrhiza pallidiflora46,54 ensifer e. abri 55,56 e. americanum e. arboris e. fredii51 e. indiaense 55,56 e. kostiense e. kummerowiae e. medicae e. meliloti e. mexicanus56,64 s inorhizobium morelense 65 e. adhaerens56.89 e. saheli e. terangae e. xinjiangense acacia spp. 56,57 acacia senegal56,58 glycine max56,59 acacia senegal56,58 kummerowiae stipulacea56,60 medicago truncatula56,61 medicago sativa,melilotus,trigonella56,62,63 sesbania pachycarpa, acacia spp. 56,63 acacia laeta, sesbania spp. 56,63 glycine max56 bradyrhizobium b.elkanii b. japonicum b. liaoningense b. yuanmingense b. canariense glycine max67 glycine max68 glycine max69 lespedeza70 lupinus spp.,adenocarpus spp.,et al71 azorhizobium a. caulinodans a. doebereinerae sesbania rostrata72 sesbania virgata73 methylobacterium m .nodulans crotalaria74 burkholderia b. caribensis b. cepacia b. mimosarum b. nodosa b. sabiae b. phymatum b. tuberum mimosa diplotricha, mimosa pudica75 alysicarpus glumaceus76 mimosa sp. 77 mimosa sp. 78 mimosa caesalpiniifolia79 aspalathus carnosa, machaeriumn lunaium76 aspalathus carnosa, machaeriumn lunaium76 cupriavidus c. taiwanensis mimosa spp. 80,81 devosia d. neptuniae neptunia natans82 herbaspirillum h. lusitanum phaseolus vulgaris83 ochrobactrum o. cytisi o. lupini cytisus scoparius84 lupinus honoratus 85 phyllobacterium p. t rifolii86 p.ifriqiyense87 p.leguminum87 shinella s.kummerowiae kummerowia stipulacea88 河北大学理学硕士学位论文 4 至今，已发现与含羞草共生的根瘤菌一共有 8 个种，主要分布在 rhizobium， burkholderia，cupriavidus 三个属。除了菜豆根瘤菌(r. etli)属于 -变形杆菌纲外，其余 7 种都隶属于 -变形杆菌纲，占已发现的 8 种 -变形杆菌纲含羞草根瘤菌总数的 87.5%75-79。现将含羞草根瘤菌所在的三个属及草螺菌属简要介绍如下： 草螺菌属草螺菌属（herbaspirillum）：该属仅含 herbaspirillum lusitanum一个种，该种是第 四个被发现的 -根瘤菌种83，分离自葡萄牙的菜豆根瘤。 根瘤菌属根瘤菌属（rhizobium）：该属由 frank 1889 年建立的，是根瘤菌种属中最早建立 的属，现有 12 个种。该属宿主几乎遍布整个豆科植物，其中 rhizobium etli24能与含羞 草植物结瘤，而该种在禾本科植物根部内生菌中也有发现21。 伯克霍尔德菌属伯克霍尔德菌属（burkhoderia）：该属是一个较新的属，由yabuuchi 1992年建立 的，从假单胞杆菌属（pseudomonas）中划分出来，是一类重要的土壤微生物，也是土 壤微生物区系的重要组成部分90，模式种为洋葱伯克霍尔德菌burkhoderia cepacia，该 种可导致洋葱软腐病76，但这个种的其它菌株不致病，反而对植物生长起促进和保护作 用，且固氮是burkhoderia属的普遍特点。b. tuberum和b. phymatum是首次报道的-根瘤 菌91，它们分离自aspalahtus和machaerium的根瘤。该属的许多种具有较强的抗逆性， 能降解苯酚及吸收重金属92,93。目前伯克霍尔德菌属中共有7种根瘤菌，除b.cepacia外， 其余六种均能与含羞草结瘤。它们分别为： 加勒比伯克霍尔德菌 burkholderia caribensis75 含羞草伯克霍尔德菌 burkholderia mimosarum77 根瘤伯克霍尔德菌 burkholderia nodosa78 萨比亚伯克霍尔德菌 burkholderia sabiae 79 瘤状伯克霍尔德菌 burkholderia phymatum76 肿块伯克霍尔德菌 burkholderia tuberum76 贪铜菌属贪铜菌属（cupriavidus）：该属仅含台湾贪铜菌 cupriavidus taiwanensis（原台湾 诺尔斯通菌）1 个种，该种是第三个确定的 -根瘤菌种，具有较强的抗逆性，能降解苯 酚及吸收重金属94,95。 为了验证 -根瘤菌确实可以和含羞草植物建立共生结瘤固氮关系， 陈文明等人做了 大量工作，对 ralstonia taiwanensis、来自南非分离自 m. bimucronat 菌株 br3461 和分离 第一章 绪论 5 自台湾入侵含羞草植物 m. pigra 的菌株 map3-5， 进行了 gfp 荧光蛋白标记侵染试验和 固氮酶活的测定，确证了这些菌株的共生固氮性能19,20,21,94,95。 1.3 含羞草根瘤菌的分类鉴定技术 应用于含羞草根瘤菌的研究方法与根瘤菌相同。目前，含羞草根瘤菌的鉴定研究主 要是以表型和遗传特征相结合的多相研究方法。16s rdna pcr-rflp 分析及表型特征 数值分类通常被用于对根瘤菌菌株的初步分群，16s rdna 全序列分析、dna-dna 杂 交和dna g+c mol%测定则用来确定根瘤菌的种属关系。此外，对含羞草根瘤菌的研究 方法还有全细胞可溶性蛋白电泳、多位点酶电泳、基因外回文重复等96。各种分类鉴定 方法详情见下表： 表 1-2 各种表型多样性研究方法比较 table.1-2 the evaluation of different phenotypic diversity research approaches 研究方法研究方法 原理原理 应用应用 评价评价 数值分类数值分类 根据等权原则，选择 100-200 个特征进行分析， 对结果进行量化， 最后借助 计算机对表型数据进行处 理，最终得到分群信息 对大量未知菌株进行初步 分群，一般在 80%的相似 性水平上划分种群 工作量较大，然而它既能 反映供试菌表型多样性的 程度，还能获得菌株的许 多表型性状特征 全细胞脂全细胞脂 肪酸分析肪酸分析 在不同属、 种甚至不同的亚 种的细菌之间， 脂肪酸碳链 的长度、双键的位置、取代 基团等存在差异 区分属、种，鉴定未知的 根瘤菌菌株，大量菌株的 比较与聚群 脂肪酸的分析操作过程都 已实现标准化和自动化， 但菌株的培养条件及生理 状态等因素会影响细菌脂 肪酸的组成 多位点酶多位点酶 电泳电泳 将多位点酶的提取物通过 凝胶电泳进行分离， 再特异 底物进行酶带显色， 得到菌 株间同工酶谱带型多态性 对大量未知菌株在种及种 以下水平进行初步分群 快速简便、与 dna-dna 杂交结果高度一致 全细胞水全细胞水 溶性蛋白溶性蛋白 电泳电泳 蛋白质是基因表达的产物， 应用 sds-page 对细菌蛋 白质的组成成份进行分析， 可以反映出细菌间的关系 在种及种以下水平上对大 量菌株进行初步分群，也 可用于结瘤验证 快速简便，重复性好，与 数值分类、dna杂交等结 果一致性好；但培养条件 和电泳条件需要标准化 由于在含羞草根瘤中发现了-根瘤菌的存在，因此，国际上许多学者非常关注-根 瘤菌与宿主植物含羞草的共生关系以及遗传共生基因的研究。随着分子生物学的发展及 河北大学理学硕士学位论文 6 各学科技术的相互渗透，许多分子生物学技术被引入含羞草根瘤菌的研究中。 表 1-3 基因组水平图谱分析方法比较 table.1-3 the evaluation of different genes scene approaches 分类方法分类方法 原理原理 应用应用 评价评价 rapd 随机引物寡核苷酸序列在细菌染色体上 分布的位置和数目不同，用这类引物进 行扩增后，电泳分析其多态性，常选用 多个随机引物，以提供丰富的遗传信息 种内菌株水平遗传多 样性，菌株鉴定 简单快速，易操作， 反应条件敏感，易 出现假阳性，重复 性较差 pfge 寡位点限制性内切酶消化细菌总染色 体，采用分辨率非常高的脉冲场电泳进 行分离， 得到较为简单的 dna 指纹图谱 对根瘤菌种及种以下 进行区分主要用于细 菌基因组重组及大小 的大小的评估 临床诊断中的区分 不同生物型的最佳 方法 aflp 总 dna 用限制性内切酶双酶切， 完全消 化后的片段与双接头连接，并用对应的 引物进行选择性扩增，经聚丙烯酰胺电 泳得指纹图谱 种内菌株水平多样性， 菌株鉴定 灵敏度高，分辨率 强，重复性好；操 作较难， 与 dna 同 源性一致 tp-rapd 在 rapd 基础上发展成的双引物随机扩 增片段多态性，一般用 16s rdna 的 8f 和 1491r 引物，降低退火温度(50）进 行扩增，分析其多态性 种水平分群 快速、准确、可靠 rep-pcr (含含 box-pcr、 eric-pcr 等等) 细菌基因组中存在许多保守的短重复序 列，根据这些短重复序列设计引物，扩 增重复序列间的大小不同的片段，电泳 后得指纹图谱 种内菌株水平多样性， 菌株鉴定 对dna要求不严格 操作简单；对扩增 条件要求严格，重 复性差 1.3.1 标记基因作为标记的分子标记技术 标记基因技术是近年来发展起来的分子生物学技术，现广泛应用于植物、动物及微 生物研究领域中。标记基因必须具有可检测性，且操作简便、灵敏度高、费用低、不受 研究材料及环境背景等因素的干扰，能应用于田间实验等97。把标记基因导入所要检测 的生物个体体内后，可以用肉眼或借助简便仪器对发光的标记物进行直接观察和记录。 目前，依赖于肉眼观察颜色反应或发光现象跟踪检测微生物的标记基因有 葡萄糖苷 酶基因（gus a）、半乳糖苷酶基因（lac z）、发光酶基因（lux ab 或 luc）、绿色 荧光蛋白（gfp）等，它们在根瘤菌的研究中有不同程度地应用98。 2001 年，陈文明将 gfp 绿色荧光蛋白标记技术应用于含羞草根瘤菌的研究，并用 第一章 绪论 7 此法成功实时监测含羞草根瘤菌与豆科植物共生结构的形成过程及功能99。 表 1-4 不同类型分子标记基因方法的比较 table.1-4 the evaluation of different labeled gene molecule approaches 分子标记类型分子标记类型 优点优点 缺点缺点 随机扩增多态性随机扩增多态性dna （rapd） 操作简单、 灵敏、 快捷、 检测速度快、 dna 用 量少、引物非特异性，成本低 稳定性不高、重复性差，扩增片段 的多少与引物的（g+c）%含量有 关 扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性 （aflp） 反映的信息量大，灵敏度高，重复性好，快 速可靠，效率高，是目前最有效的分子标记 费用高，技术难度较大，所需dna 样品要求较纯，引物上选择性碱基 的多寡决定扩增条带的多少 igs-rflp 所需要的dna 量少，灵敏快速，重复性好， 易于分析数据，在种以下及菌株水平上能区 分差异 引物的设计一般需要知道序列信 息，有时还需测序 -葡萄糖苷酶基因标记葡萄糖苷酶基因标记 (gus a 标记标记) 检测简便、快速、灵敏、准确、直观、原位 检测准确、受干扰小 需要检测底物，成本较高，对细胞 有毒害 -半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因 (lac z 标记标记) 检测直接、简便 需要底物x-gal 和诱导物iptg 的 参与，成本高，时有背景干扰、操 作繁琐 发光酶基因标记发光酶基因标记 （luxab 或或luc 标记）标记） 检测直接、灵敏度高、受干扰小、费用少 检测时需要荧光素，活体检测不太 准确、所需暴光的时间较长 绿色荧光蛋白基因标记绿色荧光蛋白基因标记 (gfp 标记标记) 自主表达，无特异性，检测方便灵敏、稳定、 分辨率高，在长波紫外光甚至可见光下直接 观察，费用少 发光强度有时不稳定，不同标记菌 之间的荧光强度可能差异很大 1.3.2 根瘤菌共生基因的研究 在根瘤菌的研究中，研究者常以结瘤基因 nod a、固氮基因 nif h 或 nif c 等共生基 因序列作为研究的基础，并用特定引物对结瘤基因 nod a、固氮基因 nif h 等共生基因进 行的扩增或用标记物质对其进行监测等方法，对根瘤菌进行研究。同时，研究也发现以 nod a 、 nif h 或 nif c 所建的系统树往往与 16s rrna 系统树不相一致100， 这可能是这 些基因大多定位于共生质粒上并且容易发生重组或水平转移的缘故。当前国际上对 burkholderia属含羞草根瘤菌共生基因研究较多， 发现burkholderia根瘤菌的nif h和nod a 同时位于一个 0.5mb 的质粒上 101。对南非的含羞草根瘤菌的研究也表明，-根瘤菌 与已知的 -根瘤菌的 nod a 基因序列同源性较高， 推测可能是结瘤基因在 -纲和 -纲间 转移102。 1.3.3 dna-dna 杂交及 g+c mol%测定 dna-dna 同源性及 g+c mol%的测定已成为细菌分类鉴定中的基本方法并作为描 河北大学理学硕士学位论文 8 述细菌分类单元的一个标准104。在根瘤菌分类中，dna 杂交被公认为是建立新种、属 的必要标准之一。陈文新等采用 dna 杂交方法研究了与紫云英共生的根瘤菌，将这些 菌形成的独立 dna 同源群命名为一个新种华癸根瘤菌(m. huakuii） 。g+c mol%的作 用在于否定，一般认为一个种内的 g+c mol%差异不大于 4-5%，一个属内差异不大于 10%（个别也有超过 10%)。如果两个菌株的 g+c mol%差异大于 5%，就可以判定这两 株不属于同一个种105,106。 可见， g+c mol%和其它分类性状是等同的， 对细菌鉴定来说， 它是对实验菌株的形态和生理生化性状的补充。但如果要建立一个新的分类单元，这项 指标又是重要的和必不可少的。测定 dna g+c mol%的方法主要有热变性温度法、活力 密度法、高压液相色谱法等，以热变性温度法最为常用107，dna-dna 杂交的方法按 作用环境和介质的不同分为固相分子杂交和液相分子杂交两种基本类型，具体方法见表 1-5。 表 1-5 g+c mol%测定及 dna-dna 杂交的方法 table 1-5 the approaches of g+c mol% and dna-dna hybridization 液相复性速率法是根瘤菌分类中最常用的 dna-dna 杂交法之一。 该方法是依据细 菌等原核生物的 dna 通常不包含重复序列，在含盐液相缓冲体系中复性时，同源 dna 比异源 dna 的复性速率快，同源程度越高，复性速率越大，杂交率也越高。利用这个 特点，通过分光光度计直接测定变性后的 dna 在一定条件下的复性速率，进而计算出 dna-dna 之间的杂交率。 该方法的重复性误差较小， 大约在 4.2%左右。 该法操作简便， 测定速度快，但也存在如需要的 dna 量大，对质量要求高且测定结果误差大等不足之 处108。 固相杂交是通过图谱的形式表明dna的同源性的方法。 最早使用的放射性同位素标 第一章 绪论 9 记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，也存在着一系列令人困扰的问 题，如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等，促使人们寻找各种非放射 性探针制备方法109,110。1981年，生物素标记探针问世，它克服了放射性探针的许多缺 点，但是由于生物标本中常有内源性生物素及生物素给合蛋白存在，因而在检测食品或 病原体时，常出现非特异性结合影响检测效果。地高辛(半抗原)标记磷酸探针是近年发 展起来的又一种非放射性标记方法，由于它检测灵敏度可与放射性同位素标记相媲美， 且特异性优于生物素标记，自诞生以来，得到广泛应用111-113。 1.4 根瘤菌对有机物苯酚等的降解研究进展及展望 生物修复作为当前环境修复领域的一大亮点和热点问题正备受关注，以其对环境影 响小、最大限度降低污染物浓度、成本低、便于操作实施等优点而成为环境修复中最有 发展前途的修复方法之一。有研究表明，burkholderia，cupriavidus 两属的根瘤菌对营 养物质的利用多种多样，有些种甚至能利用有机污染物和吸收重金属92-95。 目前，国际上非常重视根瘤菌-豆科植物在重金属及有机污染物方面的利用研究 114-117。在美国加洲北部的铜矿废弃地上发现了生长良好的豆科百脉根属、羽扇豆属和 车轴草属植物， 经水培试验证明， 从其根瘤中分离的根瘤菌对cu具有非常强的耐性 118。 carrasco等研究 116黄铁矿溢出污染的根瘤菌，从紫花苜蓿、野豌豆等豆科植物中分离 得到41株耐300 mg/l的as、100 mg/l的cu和500 mg/l的pb根瘤菌，研究还表明富集的重 金属可能和细菌多糖结合有关。同时，科学家对苯酚降解菌的功能特性和遗传机理也进 行了大量深入的研究，揭示了微生物降解苯酚的代谢途径中编码各类酶所需要的基因及 其表达系统，并阐明了苯酚能够被许多原核和真核微生物利用的原理119。 现在，豆科植物根瘤菌共生固氮体系在污染土壤植被修复和生态重建中的研究已 越来越成熟， 这为污染耕作土壤的控制和修复提供了较为完整的理论和实践基础。 目前， 用于改良污染土壤的豆科植物有三叶草、苜蓿、豌豆、野豌豆、洋槐、含羞草和百脉根 等。 如能将该体系应用到污染的土壤中， 不仅可以吸附重金属或转化其形态， 降低毒性， 而且可以促进土壤营养元素特别是n元素的循环和积累，减少化肥对农田的污染。 河北大学理学硕士学位论文 10 1.5 本研究目的、意义及研究路线 1.5.1 本研究的目的及意义 (1)研究目的 对前期研究所获5大类群的根瘤菌进行种群鉴定，同时发现并保存新种。 对部分含羞草根瘤菌进行碳、氮源利用等生理生化性状的测定。 对含羞草根瘤菌在环境污染物的耐受性方面作探索性研究，为我国根瘤菌资源的 研究和应用提供理论依据和基础材料。 (2)研究意义 发现新种并保存优良的根瘤菌，为农业的可持续发展提供珍贵的种质资源。 揭示根瘤菌与其相关物种的亲缘关系，追溯其在原核生物界的系统发育地位，从 而进一步认识和理解整个生物进化的历史。 1.5.2 实验技术路线 供试菌株 dna 的提取 扩增 16s rdna 对 16s rdna 扩增产物进行克隆测序 对各群菌株进行表型（sds-page、box-pcr）研究 生理生化测试 代表菌株交叉结瘤试验 重金属及有机污染物的耐受性试验 tm 值测定 g+c mol%测定 dna-dna 杂交 第二章 系统发育地位的确定 11 第二章 系统发育地位的确定 本研究是在含羞草根瘤菌分类研究基础上，对前期研究中应用16s rdna pcr- rflp 所获得的5大类群的根瘤菌进一步分类进行地位的研究。本章将对这5群的代表菌 株进行16s rdna 序列测定和序列同源性比较，并与相关属的已知种进行序列相似性的 分析，以确定这些种群和菌株的系统发育地位。 16s rdna 全序列分析是目前研究根瘤菌系统发育的主要方法。因为16s rdna 具 有高度保守性， 对亲缘关系较近的种分辨率不高， 可用于区分不同种的微生物。 总言之， 若菌株之间的16s rrna 相似性大于97%可能属于同一个种。16s rdna 全序列既是发 表新属、新种时必需的分子指标，也是根瘤菌生物多样性研究中确定其系统发育地位必 须的，它能够反映菌株间的系统发育关系120。 2.1 材料和方法 2.1.1 菌株的来源 本章测序菌株为 16s rdna pcr-rflp 分类中、群的代表菌株， 表 2-1 为全部供试菌株及 16s rdna pcr-rflp 分类