毕业论文-报春苣苔抗性研究实验报告.doc

报春苣苔抗性研究实验报告专业班级：11园艺（技术教育） 学生姓名：高其森 指导教师：马崇坚 副教授1 前言1.1 研究目的和意义报春苣苔属于报春苣苔属苦苣苔科的一种国家一级保护植物，其药用和潜在作用巨大有待开发，作为一种频临灭绝的植物本课题通过研究其抗性机制，培育抗性更强的品种为创造更适合苦苣苔作准备另外也为保护其种质资源。1.2 报春苣苔生物学特征与自然繁殖环境报春苣苔是苦苔科多年生喜钙植物,花期在每年3月到5月，因其量极其稀少因此被列为国家一级保护野生植物。由其生长特性决定其生长环境，报春苣苔一般生长在山洞口的植物群落中，这些群落植物中绝大部也是喜钙和阴凉植物，最常见的伴生植物是苔藓，报春苣苔相对洞口其他植物分布有些特别，在一定程度上洞口越深其他植物越来越少而报春苣苔却越来越多,洞口的报春苣苔植株比洞内植株长势要好很多,洞口处报春苣苔呈独立簇状花梗很长，叶片茂盛洞内却很多是独立小植株生长极其缓慢，开花比例洞口的比例要大。从其生长环境分析得出报春苣苔生长需要偏碱性土壤，耐旱耐贫瘠能力极强，在有机质含量丰富的地方长势很好。其植物的生长极为缓慢,平均每株年生长量在30-50g，生长只需微弱的光强。2 材料与方法2.1 叶绿素测定材料与仪器2.1.1材料不同年龄，生长状态，不同科的苦苣苔。2.1.2主要仪器与试剂 叶绿素测定仪，天平，皮尺，霍格兰栽培营养液 Nacl Na2 Co32.1.3实验设计 设计方法主要是控制变量法。叶绿素含量变化主要通过测定栽培前与栽培一定时间后每隔15天测定一次次来对比叶绿素含量的变化，测定方法是直接用叶绿素测定仪测量每株报春苣苔的同一位置，一株一般选三个位置测量，位置均匀分布在植株上中下部以免减少误差。植株的生长量测定也是对比栽培前后的植株体重变化量，一般直接用天平测量，每30天测量一次。存活率主要统计最后存活的株数与开始时栽培的数比。2.2 超氧化物歧化酶（SOD）与过氧化物酶（POD）含量的测定 均按照南京建成生物研究所生产的SOD，POD测试试剂说明进行测定2.3可溶性蛋白含量的测定考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量呈正比，可用比色法测定。2.3.1材料、仪器设备和试剂 1.材料：报春苣苔 2.仪器设备：722型分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度试管、离心机 3.试剂：考马斯亮蓝G-250（称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶解于50mL95%乙醇中，加入100mL85%（W/V）的磷酸中，用水定容至1000mL，过滤，此药品试剂常温下可保存30d），标准蛋白质溶液（精确称取结晶牛血清蛋白10mg,加水溶解并定容至100mL，即为100ug/mL的标准蛋白质溶液），磷酸缓冲液（pH7.0）。2.3.2操作步骤 1.标准曲线的制作取6支具塞试管，按表加入试剂。盖上塞子，摇匀。注意：各管震荡程度尽量一致。放置3min，在595nm波长下比色测定，比色反应在1h内完成。以牛血清蛋白含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。2.样品中蛋白质含量的测定准确称取约200mg植物组织叶片，放入研钵，加5mL磷酸缓冲液（pH7.0），在冰浴中研成匀浆。再在4000r/min离心10min，将上清液倒入10mL容量瓶。再向渣中加入2mL磷酸缓冲液，悬浮，4000r/min离心10min。合并上清液，定容至刻度。另取1支具塞试管，准确加入0.1mL样品提取液，加入蒸馏水0.9mL和5mL考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。2.4 丙二醛（MDA）含量的测定2.4.1 仪器设备 紫外可见分光光度计、离心机。2.4.2 操作方法 MDA的提取：称取剪碎的受胁迫的新鲜样品1.0，加入10%三氯乙酸（TCA）2ml和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml三氯乙酸（TCA）进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，上清液为样品提取液。 显色反应和测定：吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml 0.6%硫代巴比妥酸（TBA，用10ml三氯乙酸配制）溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再4000r/min离心15min。取上清液测定532、600、450下的消光度。2.4.3 含量计算 双组分分光光度计法：根据郎伯-比尔定律：D=CL，当液层厚度为1时，=DC，称为该物质的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的消光度值等于混合液在该波长下各显色物质的消光度之和。已知蔗糖与TBA反应产物在450和532下的比吸收系数分别为85.40，7.40；MDA与TBA显色反应产物在450波长下无吸收，其比吸收系数为0，532下的比吸收系数为155。根据双组分分光光度计法建立方程，求解方程得计算公式：C1（mmol/l）=11.71D450（1）C2(umol/l）=6.45（D532-D600）0.56D450（2）式中为可溶性糖的浓度，为MDA的浓度分别代表450 532 600波长下的消光度值。以直线方程法计算时，按公式（1）求出样品中糖分在532处的消光度值，用实测532的消光度值减去600非特异吸收的消光度值再减去，其差值为测定样品中MDA-TBA反应产物在532的消光度值。按MDA在532处的摩尔比吸收系数为1.55 105换算求出提取液中MDA浓度。 以双组分分光光度计法计算时，按公式（3）可直接求得样品提取液中MDA的浓度。用上述任一方法求得MDA的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量。MDA浓度（umol/L）=6.45OD532-0.56OD4502.5 脯氨酸含量的测定2.5.1 仪器设备 可见光分光光度计、离心机、水浴锅。2.5.2 操作方法 脯氨酸提取：取1.0g新鲜样品，在3ml磺基水杨酸溶液研磨提取，使最终体积为5ml。匀浆液转入玻璃离心管中，在沸水浴中浸提10min，冷却后，以3000r离心10min，取上清待测液。2.5.3 含量测定 标准曲线制作：在110脯氨酸浓度范围内制作标准曲线。取标准溶液各2ml，加入2ml 3磺基水杨酸、2ml冰乙酸和4ml 2.5茚三酮溶液，置沸水浴中显色60min。冷却后，加入4ml甲苯萃取红色物质。静置后，取甲苯相测定520nm处的吸收值，依据脯氨酸量和相应吸收值绘制标准曲线。 样品测定：取2ml上清液，加入2ml水，再加入冰乙酸等显色试剂，同标准曲线程序进行显色、萃取和比色。然后把数据代入标准曲线找出样本中的脯氨酸含量整理。2.6 数据统计与处理 统计数据用Excl制成柱形图，从柱形图能直观反映各种指标的变化规律。3 结果与分析3.1不同盐碱条件下报春苣苔叶绿素含量的变化 图一 图二 图一反映的是报春苣苔在不同碱性条件下栽培一定时间后叶绿素的含量变化，其中样本1-6是在pH为10的条件下栽培，样本7-12是在pH为9的条件下栽培的依此类推。从图中我们可以看出总体上讲叶绿素含量变化不是很大，有些植株甚至有强于其他植株的耐碱性。在相对碱性条件下报春苣苔的叶绿素含量在碱性越强的环境下含量越低，减少量就越大，在微碱性条件下叶绿素含量有所增加，说明报春苣苔是能适应微碱性条件的。图二反映的是报春苣苔在不同盐含量水培条件下栽培一定时间后叶绿素的含量变化，其中样本1-6是在NaCl含量为300mmol/L条件下栽培，样本7-12是在NaCl含量为200mmol/L的条件下栽培的依此类推。从图中我们可以看出含盐量高的条件下叶绿素含量减小越多，在含盐量为0的条件下最适合生长。3.2不同盐碱条件下报春苣苔植物体生长量的变化 图三 图四图三反映的是报春苣苔在不同碱性条件下栽培一定时间后植株生长量变化，其中样本1-6是在pH为10的条件下栽培，样本7-12是在pH为9的条件下栽培的依此类推。从图中我们分析得知报春苣苔在PH为9的条件下都能生长，ph大于9植株体重就随着PH增大而减少，最适合报春苣苔生长的PH为7。图四反映的是报春苣苔在不同盐含量水培条件下栽培一定时间后叶绿素的含量变化，其中样本1-6是在NaCl含量为300mmol/L条件下栽培，样本7-12是在NaCl含量为200mmol/L的条件下栽培的依此类推。从图中我们可以看出盐胁迫对报春苣苔生长影响总体影响不大，最适合报春苣苔生长的NaCl含量为0.3.3不同盐碱条件下报春苣苔存活数量 每个处理组均种植的报春苣苔数量为9株，在碱性胁迫条件下ph为10的组内存活株数为6株，Ph为9的组内存活8株，PH为8和7的组内的组内存活株数均为9株。可以得知在PH越低的条件下报春苣苔的生存能力越高。在盐胁迫条件NaCl含量为300mmol/L的组内存活株数为7株，NaCl含量为200mmol/L组内存活9株，NaCl含量为100mmol/L的组内的组内存活株数为9株。NaCl含量为0的组内存活9株。从上述数据得知报春苣苔的耐盐性比耐碱性要强。3.4不同盐碱处理对报春苣苔SOD活性的影响 图五 图六 图五反映的是报春苣苔在不同碱性条件下栽培一定时间后组之间植株体内SOD差异，其中样本1-6是在pH为10的条件下栽培，样本7-12是在pH为9的条件下栽培的依此类推。从图中 我们可以看出我们发现在碱性越强的环境下栽培报春苣苔体内SOD含量就越高，说明报春苣苔能通过提高自身体内的SOD含量来应对碱性环境，是报春苣苔体内的其中一种抗性物质，在酸碱度为10的组内含量能达到180U/mgprot是酸碱度为7环境下的三倍左右。图六反映的是报春苣苔在不同盐含量水培条件下栽培一定时间后叶绿素的含量变化，其中样本1-6是在NaCl含量为300mmol/L条件下栽培，样本7-12是在NaCl含量为200mmol/L的条件下栽培的依此类推。从图中我们可以看出盐胁迫下报春苣苔体内SOD含量差异也很大说明其体内SOD也是报春苣苔调节植物体适应盐胁迫的物质之一，最适合报春苣苔的盐度为100mmol/L。3.5不同盐碱处理对报春苣苔可溶性蛋白的影响 图七图八一般植物在盐碱胁迫条件下蛋白质是减少的，由于叶绿素合成能力的减弱。出现植物饿死现象，另一方面在高浓度盐胁迫处理下，根系的渗透压会上升，根系的吸收能力急剧下降也会导致蛋白质合成能力下降。上图反映的是不同盐碱处理下报春苣苔体内蛋白质含量的差异，上两图均反映出在高盐碱性栽培条件下蛋白质含量会比低盐碱性栽培条件下含量低，说明盐碱胁迫会抑制报春苣苔合成蛋白质，这就是盐碱胁迫下报春苣苔生长受抑制的原因之一。蛋白质含量组与组之间差异不是很大，但随着盐碱浓度的增加差别会扩大，最适合报春苣苔生长的水培环境盐含量在100mmol/L，PH在7最适合。3.6 不同盐碱处理对报春苣苔MDA含量的影响 图九 图十在盐碱胁迫下植物细胞的渗透压需要升高才能够在外部高浓度环境中吸取养分，植物自身能通过合成抗逆产物来提高自身渗透能力来增强逆境生存能力，上图反映的是植物细胞膜在抗盐碱性的作用。膜脂的最终产物是MDA，其含量多少直接反映植物体细胞膜的受伤害程度，也是反映植物对逆境条件的反映程度。图反映的是在盐碱胁迫条件处理下报春苣苔体内含量对比，明显反映出在盐碱性越高的栽培环境下的含量越高，说明报春苣苔能通过提高自身体内的来应对逆境条件。对比每个实验组数据，说明盐碱性越高对报春苣苔细胞膜伤害越大，该部位被氧化越严重。3.7 不同盐碱处理对报春苣苔脯氨酸含量的影响 图十一 图十二旱、盐碱、热、冷、冻是植物生长的逆境，为了应对逆境生存植物体内脯氨酸含量会增加。脯氨酸（Pro）是植物蛋白质的组分之一，并可以游离状态广泛存在于植物体中。在干旱、盐渍等胁迫条件下，许多植物体内脯氨酸大量积累。积累的脯氨酸除了作为植物细胞质内渗透调节物质外，还在稳定生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒以及作为能量库调节细胞氧化还原势等方面起重要作用，脯氨酸含量一定程度反映植物体抗逆的能力，一般来讲脯氨酸含量高的植物抗逆性相对比较强。因此测定脯氨酸含量可以作为作物抗旱的生理指标。上两图分别是报春苣苔在盐碱胁迫处理下体内脯氨酸含量对比，在盐碱严重的组内植物体内脯氨酸含量均比盐碱度低的组含量要高。碱性环境中随着碱度的上升脯氨酸含量上升比较快，相对盐度提升带来的脯氨酸含量上升的幅度要大一些。在酸碱度为11的组内脯氨酸平均含量达到38ug/ml,是酸碱度为空白对照组的4倍左右。在盐胁迫处理含盐量为300mmol/L的组内脯氨酸含量平均35ug/ml，是空白对照组的3倍左右。3.8 不同盐碱处理对报春苣苔POD含量的影响 图十三 图十四图五反映的是报春苣苔在不同碱性条件下栽培一定时间后组之间植株体内POD差异，POD是植物体渗透调节物质之一，研究其变化是抗盐碱研究的重要指标之一。其中样本1-6是在pH为10的条件下栽培，样本7-12是在pH为9的条件下栽培的依此类推。从图中我们可以看出我们发现在碱性越强的环境下栽培报春苣苔体内POD含量就越高，说明报春苣苔能通过提高自身体内的POD含量来应对碱性环境，在酸碱度为10的组内平均含量能达到65U/mgprot，酸碱度为7的组内平均含量为10U/mgprot，两组之间差别有四倍之大。图六反映的是报春苣苔在不同盐含量水培条件下栽培一定时间后叶绿素的含量变化，其中样本1-6是在NaCl含量为300mmol/L条件下栽培，样本7-12是在NaCl含量为200mmol/L的条件下栽培，依此类推。从图中我们可以看出盐胁迫下报春苣苔体内POD含量差异也很大。两图均明显反映出在高盐碱条件下POD的含量明显高于其他组的，说明只有在高盐碱性环境下POD才大量产生作为抗逆境物质。 4 结论与讨论盐碱胁迫条件下对报春苣苔的生长特征是起到负作用的，盐碱胁迫会导致报春苣苔生长减慢，叶色变黄，在水培条件下盐碱性还会导致报春苣苔的根系吸收能力下降，严重的还会导致根系死亡。盐碱条件下叶绿素合成能力也有所降低，随着酸碱度提高合成能力越弱，导致报春苣苔叶色发黄。报春苣苔在盐碱胁迫环境下体内POD，SOD，脯氨酸等抗性物质会显著提高，丙二醛含量也越高，丙二醛是对植物体产生负作用的一种物质，其含量越高说明报春苣苔收到盐碱伤害越大。尽管报春苣苔能在山涧石缝顽强生长，但是生长速度非常慢，不利于种质的保护和繁衍，最适合报春苣苔生长的还是土壤肥沃和盐碱度低的地方。在适合的环境下，报春苣苔的生长速度也是很慢我觉得有必要研究加快其生长条件的研究，就目前研究结果来看，低盐碱是其中一个方面其他有利于加速生长的原因还有待研究。另外报春苣苔的叶子非常薄脆，不利于后期开发保存利用，也有必要研究增强叶子的韧性。报春苣苔的根系一般是浅跟，不是岩土的栽培环境下不利于抗风雨这也是为什么在岩洞等相