（生物化学与分子生物学专业论文）抗生素isomigrastatin发酵条件优化和高产机理研究.pdf

浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密口 。 学位论文作者签名：关7 爹云 日期：妒9 年弓月1 日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名： 圈 日期：沙o 年乡月少7 日 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 1 s o m i g r a s t a t i n ( i s o m g s ) 是从p l a t e n s i s n r r l l8 9 9 3 发酵液中分离得到 的1 2 元环的大环内脂类抗生素，具有抑制肿瘤细胞转移的生物学活性。利用基 因工程技术，将携带有完整i s o m g s 基因簇的载体p b s l1 0 0 1 整合到五种不同模 式菌株的染色体上，成功构建五种生物合成i s o m g s 的工程菌株。 本论文开展了i s o m g s 工程菌的发酵培养条件优化的工作，通过培养基优 化，五种工程菌异源生物合成i s o m g s 的能力均得到提高，i s o m g s 的产量提高 了3 1 8 倍不等，通过对比可以看出工程菌s b l l 0 0 1 合成i s o m g s 的能力明显高 于其余四种工程菌，最高产量为1 2 8 6m g l ，该菌也成为进一步组合生物合成 i s o m g s 的首选的工程菌。通过组合不同培养基之间的成分摸索出更适宜 i s o m g s 合成的培养基，摸索出一种组合b 2 培养基，使i s o m g s 的产量进一步 提高到1 8 6 7m g l ，同时为异源生物合成其他天然产物所需培养基提供了借鉴。 根据文献中报道的i s o m g s 的假想生物合成路径，本实验验证了添加假想前体 碳酸氢钠对i s o m g s 产量的影响，添加2g l 碳酸氢钠使i s o m g s 的产量继续提 高到2 0 7 8m g l 。利用实时荧光定量r t - p c r 技术研究野生菌和工程菌的m g s 基 因簇中每个基因在不同时期的表达丰度，从而发现与i s o m g s 产量密切相关的 基因，为进一步组合生物合成i s o m g s 选择靶基因提供了理论基础。 关键词：异源生物合成；发酵条件优化；假想前体；荧光定量r t - p c r 。 浙江理工大学硕士学位论文 _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ - _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - i - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ _ 。_ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - _ - i _ _ - - _ _ - - a b s t r a c t s o m i g r a s t a t i n ( s o m g s ) ，t h e12 - m e m b e r e dg l u t a r i m i d e - c o n t a i n i n gp o l y k e t i d e ， w a si s o l a t e df r o msp l a t e n s i sn r r l l 8 9 9 3f e r m e n t a t i o nb r o t hw i t ht h eb i o a c t i v i t y a g a i n s tc a n c e rc e l l sm i g r a t i o n f i v ee n g i n e e r e d s t r a i n sw e r ec o n s t r u c t e du p o n i n t r o d u c t i o no ft h ev e c t o rp b s110 01 h a r b o r i n gt h ee n t i r em g sb i o s y n t h e t i cg e n e c l u s t e ri n t of i v em o d es t r a i n s ，w h i c hs u c c e s s f u l l y h e t e r o l o g o u s l yb i o s y n t h e s i z e d s o - m g sp r o d u c t i o n t h ep u r p o s eo ft h i sw o r ki st oi m p r o v e s o m g sp r o d u c t i o nt i t e r si nf i v e e n g i n e e r e ds t r a i n sb yf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no p t i m i z a t i o n 。s o - m g sp r o d u c t i o nt i t e r s w e r ei m p r o v e db y3 - 1 8f o l di nf i v e e n g i n e e r e ds t r a i n sa f t e ro p t i m i z a t i o n a n d s bll0 01 p r o v e di t s e l ft oy i e l dt h eh i g h e s t s o - m g sp r o d u c t i o n12 8 6m g l ，w h i c h w a sc h o s e nt ob et h ec a n d i d a t es t r a i nf o rf u r t h e rr e c o m b i n a n tb i o s y n t h e s i z e d s o m g s p r o d u c t i o n e x c h a n g i n gt h ec a r b o ns o u r c e sb e t w e e nb 2m e d i u ma n dr 2 y em e d i u m r e s u l t e di nt h eh y b r i db 2m e d i u m ，i nw h i c h s o m g sp r o d u c t i o nt i t e rw a sf u r t h e r i n c r e a s e dt o18 6 7m g l t h eh y b r i db 2m e d i u mp r o v i d e dt h e p o s s i b i l i t y f o r h e t e r o l o g o u s l yb i o s y n t h e s i z i n go t h e rn a t u r a lp r o d u c t s a c c o r d i n gt ot h ep r o p o s e d b i o s y n t h e t i cp a t h w a yf o r s o - m g s ，2g ln a h c 0 3a st h ep r o p o s e dp r e c u r s o ra d d e d t ot h ef e r m e n t a t i o nb r o t hf u r t h e ri n c r e a s e dt h e s o m g sp r o d u c t i o nt o2 0 7 8m g l r e a lt i m eq u a n t i t a t i v er t - p c rd e m o n s t r a t e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e11 g e n e si n m g sc l u s t e rt r a n s c r i p t i o n a ll e v e la n d s o m g sp r o d u c t i o nt i t e r si nw i l ds t r a i na n d e n g i n e e r e ds t r a i n sa td i f f e r e n tp h a s e i no r d e rt os e l e c tt h et a r g e t e de n g i n e e r e dg e n e s f o rf u r t h e rr e c o m b i n a n tb i o s y n t h e s i s s o m g sp r o d u c t i o n k e yw o r d s ：h e t e r o l o g o u sb i o s y n t h e s i s ；f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no p t i m i z a t i o n ； p r o p o s e dp r e c u r s o r ；r e a lt i m eq u a n t i t a t i v er t - p c r i i 浙江理工大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i 第一章文献综述1 1 1 抗生素s o m i g r a s t a t i n 的研究进展j 1 1 1 1i s o m i g r a s t a t i n 的分子结构1 1 1 2 m i g r a s t a t i n 的理化性质2 1 1 3i s o m i g r a s t a t i n 的分析方法2 1 1 4i s o m i g r a s t a t i n 的生物学活性2 1 1 5 s o m i g r a s t a t i n 的分离提取过程2 1 2i s o m i g r a s t a t i n 衍生物研究进展3 1 2 1i s o m i g r a s t a t i n 及其衍生物研究进展3 1 2 2i s o m i g r a s t a t i n 衍生物合成进展4 1 2 3i s o m i g r a s t a t i n 及其衍生物生物学活性4 1 3 异源生物合成天然产物5 1 3 1 异源生物合成聚酮化合物的研究进展5 1 3 2i s o m i g r a s t a t i n 生物合成基因簇的概述5 1 3 3 构建生物合成i s o m i g r a s t a t i n 的工程菌8 1 4实时荧光定量r t - p c r 技术1 1 1 4 1 实时荧光定量r tp c r 技术的原理。1 1 1 4 2 实时荧光定量r tp c r 的实验步骤1 1 1 5 本论文的研究目的1 4 第二章s o m i g r a s t a t i n 异源生物合成及发酵条件优化。15 2 1 材料与方法1 5 2 1 1 实验材料1 5 2 1 1 1 实验菌种1 5 2 1 1 2 培养基l5 2 1 1 3 主要试剂16 2 1 1 4 实验设备l7 2 1 1 5 括d m i g r a s t a t i n 的生物合成和检测方法1 7 2 2 结果与讨论18 2 2 1 发酵条件的优化18 2 2 1 1 生长曲线的测定1 8 2 2 1 2 发酵时间对s o m i g r a s t a t i n 合成的影响1 9 2 2 1 3 树脂添加量对s o m i g r a s t a t i n 产量的影响2 0 2 2 1 4 初始p h 值对s o m i g r a s t a t i n 产量的影响2 1 2 2 1 5 接种量对i s o m i g r a s m t m 的合成产量的影响2 2 2 2 2 i s o m i g r a s t a t i n 培养基成分的优化2 3 2 2 2 1 培养基种类的选择：2 3 2 2 2 2 碳源的种类和浓度对i s o m i g r a s t a t i n 合成的影响。2 4 2 2 2 3 有机氮源种类和浓度对i s o m i g r a s t a t i n 合成的影响2 5 2 2 2 4 无机氮源对i s o m i g r a s t a t i n 合成的影响2 7 2 2 2 5 组合培养基对i s o m i g r a s t a t i n 合成的影响2 8 i i i 浙江理工大学硕士学位论文 2 2 2 6 假想前体对i s o m i g r a s t a t i n 合成的影响3 0 2 3 本章小结3 2 第三章r e a lt i m er t - p c r 技术3 3 3 1 引言3 3 3 2 材料与方法3 4 3 2 1 实验菌株和培养方法3 4 3 2 2 主要试剂3 4 3 2 3 主要实验设备。3 5 3 2 4i s o m g s 同源和异源菌株的培养3 5 3 2 5 链霉菌总r n a 的提取3 5 3 2 6 粗提r n a 样品的纯化3 6 3 2 7 总r n a 浓度的检测3 7 3 2 8 反转录反应。3 8 3 2 9 荧光定量p c r 3 9 3 3 结果与讨论4 1 3 3 1 总r n a 粗提样品电泳分析4 1 3 3 2 i s o m i g r a s t a t i n 结构基因转录水平分析4 1 3 3 本章小结4 3 第四章结论与展望。4 5 参考文献4 7 致谢51 在学期间发表的文章。5 2 i v 浙江理工大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 抗生素i s o - m i g r a s t a t i n 的研究进展 抗生素s o - m i g r a s t a t i n ( i s o m g s ) 是从p l a t e n s i sn r r l l8 9 9 3 发酵液中分 离得到的一种1 2 元环的携带戊二酰亚胺侧链结构的大环内脂类抗生素，具有抑 制肿瘤细胞转移的生物学功能1 1 】。k a r w o w s k i 和同事于1 9 9 4 年从p l a t e n s i s n r r l l 8 9 9 3 发酵液中分离到的是s o m g s 的结构类似物d o r r i g o c i na 和b ( d g n s ) ，化学结构是含有戊二酰亚胺结构的线性聚酮化合物【2 】。i m o t o 和同事于 2 0 0 0 年首次从sp l a t e n s i sm k 9 2 9 4 3 f 1 发酵液中分离得到一种抑制人类肿瘤细 胞转移的化合物m i g r a s t a t i n ( m g s ) ，并证明了它的分子结构为1 4 元环的大环内 酯结构，同样含有戊二酰亚胺侧链结构。通过x 射线衍射技术证明了m g s 的相 对和绝对立体化学结构，同样具体抑制肿瘤细胞转移的生物学功能【3 1 。随着对 s o m g s 研究的深入，已证明括。一m g s 是sp l a t e n s i sn r r l l8 9 9 3 生物合成的直 间天然产物，而m g s 和d g n s 是i s o m g s 在水分子的介导作用下分子内结构重 排形成的衍生物【4 】。 1 1 1 s o - m i g r a s t a t i n 的分子结构 i s o m i g r a s t a t i n 的化学结构式如图1 1 所示【1 1 ： 分子式：c 2 7 h 3 9 n 0 7 分子量：4 9 0 图1 1 s o m i g r a s t a t i n 的化学结构式 浙江理工大学硕士学位论文 1 1 2m i g r a s t a t i n 的理化性质 m i g r a s t a t i n 外观呈白色粉末状，p h 为中性的抗生素，无挥发性，熔点5 4 5 5 0 。易溶于甲醇，丙酮，乙酸乙酯，氯仿和二甲基亚砜等有机溶剂。如果与水 分子接触会在水分子的介导作用下发生分子内结构重排，转变成m g s ，d g n s 或l t m 等类似物。常温条件下放置9 0 天理化性质基本保持稳定【5 1 。 1 1 3 s o m i g r a s t a t i n 的分析方法 抗生素常用的定量分析方法：生物效价测定方法和高效液相色谱( h p l c ) 分析法。针对s o m g s 及其类似物m g s ，d g n s 和l t m 文献报道的生物效价测 定方法有：w o u n dh e a l i n ga s s a y , c h e m o t a x i c e l lc h a m b e ra s s a y 等f 6 】。而高效液相 色谱分析法具有快速，高效，灵敏，准确等特点，因此h p l c 更适合于s o m g s 发酵和分离过程中的定量检测。 1 1 4 s o m i g r a s t a t i n 的生物学活性 细胞转移是肿瘤形成的必要前提条件，因此靶向抑制肿瘤细胞转移是针对肿 瘤疾病治疗的非常有潜力的手段。研究发现i s o m g s ，m g s ，d g n s ，l t m 及其 他大环内酯类化合物具有抑制肿瘤细胞转移的生物学功能。此外，在细胞信号传 导，多药物抗药性，作为覃毒碱乙酰胆碱受体拮抗剂，抑制真菌活性等各方面同 样显示出高效的生物学活性【7 d 1 1 。抑制肿瘤细胞转移的机制还没有完全清楚，初 步研究结果显示s o m g s 抑制肿瘤细胞转移的机制并不是通过抑制肿瘤细胞蛋 白质合成或核酸( d n a 或r n a ) 降解实现的。并且，s o m g s 及其多种类似物， 构成了m g s 家族( m i g r a s t a t i nf a m i l y ) 对于抑制人类多种肿瘤细胞转移的生物 活性已得到证实1 1 2 j 。 1 1 5 s o m i g r a s t a t i n 的分离提取过程 s o m i g r a s t a t i n 是s t r e p t o m y c e s p l a t e n s i sn r r l l 8 9 9 3 合成的直接天然产物， 因此在发酵的整个过程中必须将其吸附到x a d 1 6 或x p 2 0 大孔吸附树脂表面， 才能保证其分子结构的稳定性。如果发酵液中不添加树脂，h p l c 检测发酵液中 2 毒 l 室温条件晾干树脂 i i 1 2i s o m i g r a s t a t i n 衍生物研究进展 1 2 1i s o m i g r a s t a t i n 及其衍生物研究进展 沈奔教授等人在研究微生物次级代谢产物的生物合成路经时，证明在 p l a t e n s i s 合成的多种化合物中i s o m g s 是直接的天然产物。采取的一系列研究 方法如下，先从p l a t e n s i s 基因组中克隆出了含戊二酰亚胺结构的聚酮化合物 的生物合成基因簇。当失活其中一条合成路径，导致几种代谢产物( i s o m g s ， m g s ，d g n s ，l t m ) 都不被合成，说明这些代谢产物的合成机制是一致的。然后 浙江理工大学硕士学位论文 根据发酵液中是否添加x a d 1 6 大孔吸附树脂，针对这两种不同的操作方法， h p l c ( 高效液相色谱) 和h p l c m s ( 液质联用) 的验证结果出现明显差异，即 发酵液中添加树脂时，检测到多种次级代谢产物( m g s ，s o m g s ，d g n s ) ；相 反，如果不添加树脂，相应产物的含量明显减少。另外，m g s 和d g n s 在发酵 液，有机溶剂和甲醇水溶液中2 5 可以保存9 0 天理化性质保持稳定。但是 s o m g s 在有机溶液中相对稳定，在水溶液中会快速转变成m g s 和d g n s 。而 且，利用h 2 埔o 标记实验证明了水分子介导s o m g s 分子重排机制的现象。显 然易见括d m g s 是sp l a t e n s sn r r l l 8 9 9 3 合成的直接天然产物，而m g s 和 d g n s 是i s o m g s 的衍生物【4 1 。 1 2 2i s o - m i g r a s t a t i n 衍生物合成进展 从1 9 9 4 ，研究人员首次从sp l a t e n s i sn r r l l 8 9 9 3 中分离到d g n s 到今，利用 生物合成和化学合成方法共同发现的s o m g s 及其类似物接近8 0 种，目前化学合 成的m g s 的类似物种类占据多数，组成m g s 家族( m i g r a s t a t i nf a m i l y ) 。在生物 合成方面，主要以s o m g s 为基础，菌体合成的s o m g s 分泌到胞外时，如果发 酵液中不添加树脂，i s o m g s 就不能及时的被吸附到树脂上，s o m g s 长时间和 发酵液中的水分子接触便会发生分子内结构重排，由1 2 元环大环内酯扩张衍生为 1 4 元环的m g s 或者丌环变成线性分子d g n s 。在化学全合成m g s 方面，主要有两 种合成路线：一种是先合成m g s 大环内酯部分的线性结构和戊二酰亚胺侧链， 然后与大环内酯其余部分的线性结构闭合成1 4 元环的内酯结构；另外一种是先化 学合成大环内酯的1 4 元环状结构并在此基础上和戊二酰亚胺侧链结构连接成完 整的m g s 。除此之外，化学合成方面还包括m g s 的1 4 元环核心的聚合合成，m g s 的类似物m a c r o l a c t a m 和m a c r o k e t o n e 的化学合成等。因此随着m g s 及其类似物化 学合成研究的不断深入，m i g r a s t a t i n i l y 的成员亦越来越多【1 4 1 7 1 1 2 3 s o m i g r a s t a t i n 及其衍生物生物学活性 m g s 家族种类多达8 0 余种，表现出非常有潜力的生物学活性。比如，化学 合成的m g s 的1 4 元内酯环可以有效抑制乳腺癌细胞的转移；化学合成的 m a c r o l a c t a m 和m a c r o k e t o n e 可以抑制胃癌细胞的转移。m g s 家族中其他类似物同 4 浙江理工大学硕士学位论文 样具有抑制细胞转移的活性，在肿瘤治疗方面有望开发成为治疗癌症的潜在新药 物【1 4 】。 1 3 异源生物合成天然产物 1 3 1 异源生物合成聚酮化合物的研究进展 聚酮化合物是一大类由细菌，真菌和植物合成的天然产物，种类包括抑制细 菌( 如红霉素) ，真菌( 如灰黄霉素) ，癌症( 如e n e d i y n e s ) 和免疫抑制剂( 如 雷帕霉素) 等【l 引。已知具有生物学活性的聚酮化合物大约有2 3 来自土壤放线菌。 这类化合物的研究越来越受到重视：潜在的生物学活性提高了开发成新药物的可 能性；独特的结构和合成机制为研究酶催化的分子机制，分子识别提供了契机； 聚酮合成酶的可塑性使之通过组合生物合成手段获得新的类似物【l9 1 。利用异源 工程菌合成聚酮化合物比野生菌有许多优势：野生菌种产生聚酮化合物的产率低 下【2 卅；针对不可培养微生物产生的一些聚酮化合物，利用异源生物合成体系无 疑是最理想的选择1 2 1 】；利用异源合成系统清楚的遗传背景可以更方便的分析聚 酮合酶的催化特性；异源合成系统为直接利用前体合成聚酮化合物提供了很好的 机遇【2 2 1 。 聚酮化合物的合成路径是由聚酮合成酶( p k s ：p o l y k e t i d es y n t h a s e ) 催化完 成的。聚酮合成酶( p k s ) 可以分为三类：i 型p k s ，主要合成大环内酯类，聚 醚类，多烯类等。由多个基因编码酶组合成模块形式发挥酶催化功能，这些模块 在聚酮化合物合成路径中只能催化一次反应。i i 型p k s ，主要合成芳香族化合物， 每一个酶在聚酮化合物合成路径中可以反复催化相同的反应。i i i 型p k s ，一种 可以重复利用的同源二聚体蛋白，不需要酰基载体蛋i 刍( a c p ：a c y lc a r r i e rp r o t e i n ) 可以直接催化泛酰辅酶a 间的缩合反应【2 3 1 。厶d m i g r a s t a t i n 基因簇中编码的的聚 酮合成酶属于i 型p k s ，并且是属于缺失酰基转移酶( a - t - l e s s ) 的i 型p k s ，聚 酮化合物l e i n a m y c i n 和e r y t h r o m y c i n 的相关聚酮合成酶也是属于这种类型 2 3 2 4 。 1 3 2i s o m i g r a s t a t i n 生物合成基因簇的概述 sp l a t e n s i sn r r l l 8 9 9 3 的基因组测序发现了两个i s o m g s 生物合成基因簇， 浙江理工大学硕士学位论文 0 8 8 d 和r a g s ，都编码a t - l e s si 型聚酮合成酶。通过基因工程技术分别失活这两 个基因簇而得到两个相应的突变体，m g s 基因簇失活的突变体完全抑制了 i s o m g s 的生物合成，而在0 8 8 d 基因簇失活的突变体中对i s o m g s 合成变化影 响不明显，这些实验结果表明，m g s 基因簇才是生物合成i s o m g s 的基因簇。 m g s 基因簇基因序列长度大概为6 5 k b ，通过生物信息学和基因失活突变实验证 明了m g s 基因簇的功能。由1 1 个开放阅读框构成，编码1 1 种不同的蛋白酶，分 别是转录激活蛋i 刍( m g s a ) ，离散型酰基转移酶( m g s b ，m g s h ) ，酰基载体蛋白 ( m g s c ) ，谷氨酰胺合成酶( m g s d ) ，聚酮合成酶( m g s e - g ) ，尾部修饰蛋e l ( m g s i k ) 。i s o m g s 聚酮合成酶属于i 型聚酮合成酶，并且是a t - l e s si 型聚酮合成酶1 2 引。 l i m 等人通过把相应的基因失活来验证各个基因的功能。基因m g s a 作为调 节基因，该基因失活的突变体s b l l 0 0 8 ，h p l c 检测该突变体发酵液( 未添加树 脂) 中的次级代谢产物，没有检测到m g s 和d g n ，说明m g s a 在i s o m g s 生 物合成过程中作为转录激活因子而发挥作用【2 引。 基因m g s c 和m g s d 分别编码i i 型a c p 和天冬酰胺合成酶，m g s c 和m g s e ， m g s f ，m g s g 三者p k s 的i 型a c p 同源性只有( 5 1 0 ) 而和另外一种i i 型 a c p ( l n m p ) 的同源性高达4 6 。m g s d 和一种a t p m 9 2 + 依赖性的天冬酰胺合 成酶( 如a s n b ) 同源性达3 1 ，同样失活m g s c 或m g s d 得到的突变体s b l 1 0 0 9 和s b l1 0 1 0 ，h p l c 分别检测该突变体发酵液( 未添加树脂) 里的次级代谢产物， 同样没有检测到m g s 和d g n ，说明m g s c 负责将丙二酰辅酶a 携带到p k s ， 而m g s d 负责在戊二酰亚胺成环之前使氨基酸基团与之相连接【2 5 。 一般的p k s 由多个模块组成，每个模块含有三个关键催化功能位点，即酮 酰基硫酯合成酶( k s ) ，酰基载体蛋白( a c p ) 和酰基转移酶( a t ) 由三部分组 成。m g s e ，m g s f 和m g s g 基因编码a t - l e s si 型p k s ，共编码1 0 个p k s 模块， 都不包括同源性的a t 结构域，而是由离散型m g s b 和m g s h 基因编码a t 结构 域，因此属于典型的a t - l e s si 型p k s 。并且m g s e ，m g s f ，m g s g 三者的k s 和 a t - l e s si 型p k s 的k s 同源性达3 5 7 8 ，而与典型的i 型p k s 的k s 存在明显 差异。同样m g s e ，m g s f ，m g s g 中的1 1 个a c p 和a t - l e s si 型p k s 的k s 同源 性达较高，而与典型的i 型p k s 的a c p 同源性比较低。另外m g s e ，m g s f ，m g s g 的p k s 中包括6 个酮酰基还原酶( i ) 结构域，5 个脱水酶( d h ) 结构域，但 6 工修饰合成i s 0 m g s 的聚酮物中间体【2 5 1 。 基因m g s b 和m g s h 编码蛋白属于离散型的a t 。m g s b 编码的产物是双结 构域蛋白，n 末端是a t 结构域，c 末端是t e 结构域。基因m g s h 编码的预计 产物也是双结构域蛋白，n 末端是a t 结构域，c 末端是氧化结构域( o x ) 。由 m g s b 编码的a t 结构域和r h i z o x i n 生物合成基因簇中编码的离散型a t 结构域 的同源性达到5 2 ，其c 末端的t e 结构域和m i c r o c y s t i n 生物合成基因簇编码 的t e 结构域的同源性为3 6 。同样，分别失活基因m g s b 和m g s h 得到的突变 体为s b l l 0 0 9 和s b l l 0 1 3 ，按照通常的发酵方法进行发酵，值得一提的是，突变 体s b l1 0 0 9 的发酵液中仍然可以h p l c 检测到i s o m g s ，尽管i s o m g s 产量相比 较于野生菌的产量有明显降低。而突变体s b l1 0 1 3 的发酵液中却完全检测不到 i s o m g s 。综合上述实验结果可以得出的结论是m g s b 编码的酶m g s b 在i s o m g s 生物合成机制中是唯一的离散型a t t 2 5 1 。根据l i m 等人研究的实验结果得出了 i s o m i g r a s t a t i n 假想的生物合成路径如图1 2 所示 7 浙江理工大学硕士学位论文 ：盘m | ：= 警m m e i l l 广一 f 一1 r 一一1 f 一一 i l r 1 7 二。m t ：；。 蛳白眵矗 章? 冬 iii “ ，。广。广o o o f o 扩。 ：器m 一卿簪。一：争_ 奄寞多一 ：7 亭n ， ：盛i , l _ m l b - 3 譬拳 州j 二ltk i 0 ：；、 锏t 每明匆 一睁的矗i 争匆固 黟3：气 o o 名吟” ，”等 ?一7?二：二=：一，一一o二。二=二二 篙器- 2 - i i _ w m - ?_ - t, v a g a - 1 1 ，一，一 、 m 一 ， 一 、 鲫二，一，匆! 如埘? 竺勺爸，。鸟朔守- f ! 螂矿函硝鸯 磊 。、。蔷、? 南、? 。f 、? z 一、二一、8 二o _ 8 4 “一、气茹、：菇一“、m 。 pt 扩6e 矿。矿带。? ”f 户，。皆伊 一i f 擘- 却) - q 旦善_ 黔冀乏乏专；o j 黑甄墨必嚣泌 训 一 篙广 ；，7il 1 ? 叩? l广“ i 一，|。吩。，、。，聪、 m ，聪、 ；一jo h o 、，q ， ，jp 、 m j 一“、 | 蔓；砖、7 至；毛父。睾；o ；歹颦一7 ；广m 。 。y j 5 m w ， 6 l 矗i 5 勰6一 图1 2 西d m i g r a s t a t i n 假想的生物合成路径。 1 3 3 构建生物合成i s o - m i g r a s t a t i n 的工程菌 组合生物合成简单来讲是产生非天然的天然产物，即通过改造天然产物的生 物合成路径来达得到产生天然产物新的类似物的要求，天然产物种类的多样性为 药物的发现和发展需求提供便利。针对模式菌种研究清楚的遗传背景，将天然产 物的基因簇通过高效的基因操作技术整合到模式菌种染色体上从而实现成功异 源合成天然产物及其类似物的目的。实现组合生物合成需要满足的条件：具备完 整的天然产物合成所需的基因簇；体外可行的目的基因簇的操作方案；异源合成 体系能够成功合成目的产物或类似物，并使其产量能够满足检测，分离和分析理 化性质等要求1 2 6 ，2 7 1 。鉴于以上条件，五种模式菌种( a l b u s ，sl i v i d a n s ， c e o l i c o l o ，s a v e r m i t i l i ss u k a 4 和s a v e r m i t i l i ss u k a 5 ) 选定为s o m g s 的异源 8 | 精一 口o 、参卜 瞄、 o o 一o 石r 一雌k 象s 浙江理工大学硕士学位论文 合成体系。 细菌人工染色体( b a c ：b a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ) 1 9 9 2 年由h i r o a k i s h i z u y a 首次建立。b a c 的用途广泛，应用价值日益增多，由于克隆效率较高， 操作简便，稳定携带插入的目的基因等原因，b a c 系统为构建复杂基因组的d n a 文库提高了简便，快速的分析方法【2 8 1 。 构建b a c 文库所需的载体p s t r e p t ob a c ( 图1 3a ) 。构建异源合成 d a p t o m y c i n 的重组菌体时，载体p s t r e p t ob a c 用来克隆和表达d a p t o m y c i n 基因 簇2 引。同样借助p s t r e p t ob a c 载体来完成构建s o m g s 异源菌种的工作。载体 p s t r e p t ob a c 特点：复制起始位点；噬菌体由c 1 3 整合酶；抗性标记( a p r a m y c i n ) 和b a m h i 酶切位点【2 9 】。 i s o - m g s 的野生产生菌s t r e p t o m y c e s p l a t e n s i sn r r l1 8 9 9 3 的基因组d n a 提 取后经b a m h i 酶消化，由脉冲场电泳分离得到长度不等的d n a 片段，b a m h i 把长度范围在1 0 0 2 5 0k b 之间d n a 片段和载体p s t r e p t ob a c 连接，得到链接复 合物，并将连接复合物通过电穿孔转化到ec o l id h l 0 b 感受态细胞中。每2 0n g d n a 大概得到1 0 0 0 个阳性转化子。插入目的片段平均长度大小为7 5k b 2 9 1 。 b a c 文库阳性克隆载体p b s l1 0 0 1 ( 6 5k bg e n ec l u s t e r ) 的分离。利用s o - m g s 基因簇中上游基因即m g s a 作为探针，在b a c 文库中杂交得到1 7 个携带有m g s a 图1 3 a ：构建b a c 文库的p s t r e p t ob a c ；b ：携带完整的i s o - m g s 合成的基 因簇的阳性克隆载体p b s l 1 0 0 1 。 野生菌s t r e p t o m y c e s p l a t e n s i sn r r l 18 9 9 3b a c 文库的构建 c l u s t e r 阳性克隆；接着利用下游基因m g s k 作为探针，和这1 7 个阳性克隆载体 9 浙江理工大学硕士学位论文 分别杂交得到一个阳性载体，即p b s l1 0 0 1 ，携带长度为6 5k b 的完整的m g s 基 因簇序列【2 9 1 。 p b s l1 0 0 1 整合到五种模式菌的染色体上。阳性克隆载体p b s l l 0 0 1 分别整 合到五种模式菌株的染色体上，通过抗性筛选，分离和纯化得到五种重组的异源 体系，如下表所示。 菌种 s p l a t e n s i sn r r l 18 9 9 3野生菌种 s b l l 0 0 1m g s11 8 fi n t e g r a t e di n t osa l b u s , a m r s b l l 0 0 2m g s11 8 fi n t e g r a t e di n t osl i v i d a n sk 4 114 a m r s b l l 0 0 3m g s1l - 8 f i n t e g r a t e di n t o c e o l i c o l o rm 5 12 a m r s b l l 0 0 4m g s11 8 fi n t e g r a t e di n t os a v e r m i t i l i ss u k a 4 a m r s b l l 0 0 5m g s11 - 8 fi n t e g r a t e di m os a v e r m i t i l i ss u k a 5 ， a m r 工程菌成功异源表达m g s 基因簇并成功异源生物合成i s o m g s 产物。五种 异源菌株分别在b 2 和r 2 y e 培养基中发酵，发酵时间和发酵方法同野生菌 s t r e p t o m y c e sp l a t e n s i sn r r l1 8 9 9 3 。通过h p l c 检测发酵液的粗提品成分以及 l c m s 和n m r 分析，五种异源菌成功地异源表达m g s 基因簇并成功地异源生 物合成得到西d m g s 产物【2 9 1 。相应产量如表1 1 所示 表1 1 五种异源菌在不同培养基中合成i s o m g s 的产量。 t