核酸化学.ppt

第五章核酸化学,NucleicAcidchemistry,第一节概述第二节核酸的化学组成第三节核酸的分子结构第四节核酸的性质第五节核酸的研究方法,本章内容,98核中（染色体中）真核线粒体（mDNA）核外叶绿体（ctDNA）DNA拟核原核核外：质粒（plasmid）病毒：DNA病毒,脱氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid（DNA）核糖核酸RibonucleicAcid（RNA）,核酸的种类、分布,RNA主要存在于细胞质中,tRNArRNAmRNA其它：小分子细胞核RNA（snRNA）、染色质RNA（chRNA）、反义RNA（antisenseRNA）、双链RNA（dsRNA）、细胞质小RNA（scRNA）、具有催化活性的RNA（ribozyme）、病毒RNA：SARS,核酸:基本结构单元核苷酸,基本元素：C、H、O、N、P；其中P的含量比较稳定，占9%-10%，通过测定P的含量来推算核酸的含量（定磷法）。,第一节核酸的化学组成,两种。DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,一、戊糖,二、碱基,1.嘌呤（Purine）,2.嘧啶（Pyrimidine）,稀有碱基，大部分是上述碱基的甲基化产物,二氢尿嘧啶（DHU）,修饰碱基的简写符号,(为1时可以不写),取代基用下列小写英文字母表示:,例：,三、核苷（nucleoside）,核苷：戊糖+碱基糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键核苷中戊糖与碱基的连接方式：,H,四、核苷酸（nucleotide）核苷酸：核苷+磷酸戊糖+碱基+磷酸,第二节核酸的分子结构,一、DNA的结构一级结构:DNA核苷酸链中脱氧核苷酸的组成和排列顺序。二级结构：DNA的两条多聚链间通过氢键形成的双螺旋结构。三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。,由dAMP、dGMP、dCMP、dTMP核苷酸单体通过3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,（一）DNA的一级结构,核酸链的形成,DNA的一级结构DNA的一级结构是指DNA上的核苷酸排列顺序。(核苷酸相当于氨基酸、单糖的角色）,脱H2O脂键相连,3，5-磷酸二酯键,首,尾,结构式,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表示）核苷酸链具有方向性，当表示一个核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。,A,核苷酸,首端,末端,5PdAPdCPdGPdTOH35PAPCPGPUOH或5ACGTGCGT35ACGUAUGU3ACGTGCGTACGUAUGU,DNA一级结构的简写形式,（二）DNA的二级结构,Watson和Crick于1953年提出了DNA双螺旋结构模型，说明了DNA的二级结构。（即B型DNA）,DNA碱基组成符合：A=T；G=C；A+G=T+C。不对称比率：A+T/G+C；物种不同，DNA碱基组成不同；物种亲缘愈接近，碱基组成也愈接近，该比率越相近似。.具有种的特异性，没有器官和组织的特异性，年龄、营养状况、环境的改变不影响DNA的碱基组成。,1提出DNA双螺旋结构模型的根据,（1）Chargaff定则（1950s,E.Chargaff发现）,（2）x-光衍射分析,2DNA双螺旋结构模型（double-helicalstructure）,1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构。,DNA双螺旋结构模型要点（1）,螺旋中的两条链反向平行，即其中一条链的方向为53，而另一条链的方向为35，两条链共同围绕一个假想的中心轴呈右手双螺旋结构。,疏水的碱基位于双螺旋的内侧，亲水的磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基平面与螺旋轴垂直，脱氧核糖平面与中心轴平行。由于几何形状的限制，碱基对只能由嘌呤和嘧啶配对，即A与T，G与C。这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。,DNA双螺旋结构模型要点（2）,DNA双螺旋结构模型要点（3）,由于碱基对排列的方向性，使得碱基对占据的空间是不对称的，因此，在双螺旋的表面形成大小两个凹槽，分别称为大沟和小沟，二者交替出现。,DNA双螺旋结构模型要点（4）,双螺旋横截面的直径约为2nm，相邻两个碱基平面之间的距离（轴距）为0.34nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺距（即螺旋旋转一圈）的高度）为3.4nm,DNA双螺旋结构模型要点（5）,两条链借碱基之间的氢键和碱基堆积力（即碱基之间的范德华力）牢固的连接起来，维持DNA双螺旋的三维结构。两条链是碱基互补关系。,该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是上个世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。,3、DNA的双螺旋结构的意义,（三）DNA的三级结构,绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋结构。,1）正超螺旋（变紧，过旋）和负超螺旋（变松，欠旋）。2）人类46条染色体的DNA总长可达1.7m，经过螺旋化压缩，实际总长只有200nm。提问：DNA形成三级结构及染色体的意义何在？,在真核生物中，双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕，从而形成特殊的串珠状结构，称为核小体(nucleosome)。核小体结构属于DNA的高级结构。,核小体的结构,核小体、染色质与染色体,二、RNA的分子结构,（一）RNA的分类及特点（二）RNA分子的结构特点,结构特点：1.碱基组成：A、G、C、U（AU/GC）；2.稀有碱基较多，稳定性较差，易水解；3.多为单链结构，少数局部形成螺旋（发夹结构）；4.分子较小。分类：1.信使RNA（mRNA）2.转运RNA（tRNA）3.核糖体RNA（rRNA）,（一）RNA的特点及分类,（二）、mRNA的结构与功能,约占总RNA的3%-5%，含量最少，种类最多。成熟mRNA不含内含子，hnRNA含有。mRNA从DNA转录遗传信息，并作为蛋白质合成的模板，决定蛋白质的氨基酸顺序。,原核生物mRNA真核生物mRNA多顺反子单顺反子转录后不需加工转录后需加工成熟直接翻译成蛋白质翻译成蛋白质半衰期短半衰期长数秒数小时,单顺反子和多顺反子mRNA,2、原核生物mRNA的结构（1）端：翻译起始序列端：翻译终止序列（2）少量的间隔序列（3）无帽无尾,原核细胞mRNA的结构特点,3、真核生物mRNA的结构特点（1）核内不均一（HnRNA）真核生物转录生成mRNA时的初级转录物和各种剪接中间体的混合物称为核内不均一a.10%hnRNA通过去除内含子等剪切，修饰而成成熟的mRNAb.hnRNA的t(1/2)短,0.4hr,内含子(intron)编码序列,外显子(exon)编码序列,真核细胞mRNA的结构特点,（2）真核生物成熟mRNA结构：a.端帽子结构结构：端:经甲基化修饰,以5,5-磷酸二酯键相连的GTP.(m7G5ppp5Np)。m7G不是转录产物功能：与蛋白质合成起始及保护mRNA不易被降解有关。,b.端尾结构结构：端：20-250个多聚腺苷酸结构（polyA）。polyA不是转录产物功能：稳定mRNA,真核生物mRNA5-端帽子结构,真核生物mRNA3-端的polyA结构,约占全部RNA的80%，含量最多。与多种蛋白质结合成核糖体，后者是合成蛋白质的场所。单链，螺旋化程度较tRNA低与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能,5SRNA的二级结构,（三）、核糖体RNA,（四）、转运RNA,约占总RNA的10-15%，分子最小。含有稀有碱基最多的RNA，其稀有碱基的含量可多达20%。tRNA是保守性最强的RNA。tRNA是单链核酸，但其分子中的某些局部也可形成双螺旋结构。,tRNA分子的结构特点,二级结构特征：单链三叶草叶形四臂四环,三级结构特征：在二级结构基础上进一步折叠扭曲形成倒L型,携带氨基酸,辨认并结合氨基酰tRNA合成酶,识别mRNA上的密码,识别并结合核蛋白体,氨基酸臂,DHU臂,反密码臂,可变环,TC臂,酵母tRNAAla的二级结构,第四节核酸的性质,一、一般理化性质二、酸碱性质三、紫外吸收四、变性与复性五、分子杂交,一、一般物理性质,1.DNA白色纤维状固体，RNA白色粉末状固体，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇来沉淀DNA；DNA溶液黏度大于RNA。2.DNA难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于1-2mol/L的NaCl溶液，RNA则相反，可据此分离二者。3.加热条件下，D核糖浓盐酸苔黑酚绿色D2脱氧核糖酸二苯胺蓝紫色,核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解。在细胞内核酸分子受核酸酶作用。,4.水解,二、酸碱性质,两性电解质核酸等电点一般在34左右（DNA的等电点为44.5，RNA的等电点为22.5）。,可在pH2.05.0之间分离各种核苷酸,pH3.5时各核苷酸所带电荷,三、紫外吸收,最大吸收峰在260nm附近可以作为区别蛋白质和对核酸及其组份定性和定量测定的依据，进行核酸纯度鉴定，也可作为核酸变性和复性的指标。,根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度,纯DNA：A260/A280=1.8纯RNA：A260/A280=2.0,（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低）,纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量,若260nm光吸收值为1相当于50g/ml双螺旋DNA,或相当于40g/ml单链DNA或RNA,或相当于20g/ml寡核苷酸。,1.概念：是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。,四、DNA的变性,能够引起核酸变性的因素有：1）温度升高；2）酸碱度改变、pH（11.3或5.0）；3）有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺等；4）低离子强度。,2.DNA的变性的条件,变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。一级结构(碱基顺序)保持不变。紫外吸收值明显增加，即增色效应。DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。DNA解链温度粘度降低，浮力密度增大,3.DNA变性的特征,天然DNA分子在热变性条件下，双螺旋结构破坏，碱基暴露，在紫外光260nm波长处的吸收度明显增加，此现象称为增色效应。变性DNA分子复性形成双螺旋结构时其紫外吸收降低的现象称为减色效应。,增色效应与减色效应,当50%的DNA变性时的温度称为该DNA的解链温度，即增色效应达到一半时的温度；一般DNA的Tm值在70-85C之间。影响Tm的因素DNA的均一性分子中G和C的含量。可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44Tm值随溶液盐浓度增加而增大,DNA解链温度（熔点，Tm）,。,溶解曲线与Tm和G+C含量,Tm与介质离子强度有关,一定条件下，去除变性因素后，核酸恢复二级结构及生物活性的现象；通常使用热复性。,DNA的复性,对于热变性的DNA，在缓慢冷却的条