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摘要 层状纳米材料增强电化学生物传感器的研究 摘要 基于生物活性物质的直接电化学行为的第三代生物传感器是当前电 化学传感器的研究新方向，它不但在了解生物氧化还原过程的动力学和热 力学，探索生命体内生理作用机制等理论研究方面具有重要意义，而且在 选择性、灵敏度和测量范围等性能方面也比前两代酶传感器有新的突破。 近年来，人们开始将纳米材料应用于传感器体系，以实现生物活性物质在 电极上的直接电子转移，构造第三代生物传感器，并取得了显著的效果。 其中层状纳米材料被认为是最具优势的生物一无机杂化材料的母体之一。 因此用具有层状二维结构的纳米材料固定生物蛋白和酶，实现直接电化 学，构造第三代传感器的研究是非常有意义的。 本文采用了被认为具有发展潜力的纳米二维层状材料固定辣根过氧 化酶或葡萄糖氧化酶，实现氧化还原酶在电极上的直接电子转移，构造安 培型电化学传感器，取得了一定的研究进展。研究结果如下： 1 采用新型的纳米材料剥层m n 0 ：纳米片作为固定辣根过氧化酶 ( 心) 的载体，发现m n 0 2 纳米片固定化的辣根过氧化酶仍保持着良好 的生物活性。然后利用剥层m n 0 2 纳米片固定 强修饰玻碳电极，研究 发现由于m n 0 2 纳米片的引入，h i 冲在电极上实现了有效可逆的直接电子 转移，电极表面电子转移常数为6 8 6 s 。并且修饰电极对底物过氧化氢有 良好响应，响应时间小于3 s ，在信嗓比为3 时，最低检出限为o 2 lu m 0 1 - l ，线性范围为l 1 0 一4 3 1 0 4m o l l ，成功制各了安培型第三 代生物传感器。 2 采用成核晶化隔离法合成纳米层状水滑石z n a 1 c 0 3 l d h s ，以其 作为h i 廿和葡萄糖氧化酶( g o d ) 的固定载体，考察了纳米水滑石对 冲 摘要 和g o d 生物活性的影响，发现纳米z n a l c 0 3 l d h s 具有良好的生物相 容性，保持了酶的构象及其生物活性。然后分别将纳米z n a 1 c 0 ，l d h s 固定 冲和g o d 制备修饰电极l d h s m 冲g c 和l d h s g o i d g c 。研究 发现 冲在l d h s 搬p g c 电极上成功地实现了直接电化学行为，对底 物h 2 0 2 有良好的响应，成功构造了第三代h 2 0 2 生物传感器。g o d 在 l d h s g o d g c 电极上成功地实现了直接电化学行为，但是没有观察到其 对底物葡萄糖的响应，尚需进一步进行研究。 关键词：直接电化学，生物传感器， 他o ：纳米片，纳米水滑石，辣根过 氧化酶( 心) ，葡萄糖氧化酶( g o d ) i i 摘要 t h et h i r dg e n e r a t i o ne l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rb a s e do nt h e l a y e r e dn a n o m t e r i a lm o d i 6 e d e l e c t r o d e a b s t r a c t r e c e n t l y ，m u c ha t t e n t i o nh a sb e e nd e v o t e dt ot l l ed e v e l o p m e mo f 廿l et t l i r d g e n e r a t i o nb i o s e n s o r s 、：h i c hw e r eb a s e do nd i r e c te l e c t r o c h 啪i s t 巧o fr e d o x e n z y m e s 踟dh a dam o r ep o t e i l t i a lp e r s p e c t i v et h a i lo t l l e rt w og e n e r 砒i o n so f e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r t h ed i r e c te l e c t r o c h e m i s t 叮o fr e d o xe n z y m e sc a n e s t a b l i s ham o d e lf o rm em e c h 锄i s ms t u d yo fe l e c n o n e x c h a n g e 啪o n g e m 可m e si nb i o l o 西c a ls y s t e m s ，a i l dp r o v i d eaf o u n d a 【t i o nf o rd i s c u s s i n gt h e p o s s i b l e m e c h a i l i 锄 o f1 e 协e r m o d y n a m i c s a i l d d y n 啦i c s o ft h e b i o m 0 1 e c u l e sr e d o x w i t ht h e d e v e l o p m e n t o f n a l l o t e c l l l l o l o g y ，m a i l y n a l l o m a t e r i a l sw e r eu s e dt oi m p r o v ed i r e c te l e c t r o nt r a i l s f e rb e t w e e nt h er e d o x e n z y m e p r o t e i na 1 1 de l e c t m d e s a n dt i l el a y e r e dm a t e r i a l sw e r ec o n s i d e r e do n e o f t h em o s tp o t e n t i a li n o 娼a 1 1 i cm 纳敝t oi m m o b i l i z et h eb i o m o l e c u l e s i nt 1 1 i sp a p e r ，m e 抛c t i v em a t e r i a l 卜_ l a y e r e dn a i l o m t e r i a l sw e r eu s e dt o i m m o b i l i z et h e 心a n dg o d n ee l e c t r o ne x c h a l l g eb e t 、e e nt h ee n 巧m e a 1 1 dg ce l e c t r o d e sw a s 口e a t l ye n h a n c e di nt h el a y e r e dn a n o m t e r i a l sf i l m m i c r o e n v i r o n m e m b a s eo nt h e d i r e c te l e c t m c h e m i s t 可o fo x i d a s e ，t h et h i r d g e n e r a t i o n b i o s e n s o rw a sf a b r i c a t e d t h i st h e s i si n v o l v e st l l e f o l l o w i n g s u b j e c t s 1 an e wk i n dn 锄o m a t e r i a 呐0 2n a n o s h e e tw a su s e da s 廿1 em a t r i xt o i m m o b i l i z em eh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( 冲) t h e 如f 冲i m m o b i l i z e di nt h e m n 0 2n a n o s h e e t sf i l mm a i n t a i n e di t sb i o a c t i v i t y - h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e e n t r 印p e d i n m n 0 2n a n o s h e e t s f i l m sc a s to n g l a s s y c a r b o ne l e c 们d e i i i 摘要 d e m o n s ”a t e dd i r e c tv o l t 锄m e t r i cr e s p o n s e s f e a t u r i n gh r p f e ( i i i ) f e ( i i ) r e d o x c o u p l e t h ee l e c t r o c h e m i c a l p a r 锄e t e r sa p p a r e n th e t e r o g e n e o u s e l e c 仰nt r a n s f e rm t ec o n s t a n tw a se s t i m a t e dt ob e6 8 6 s t h e e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yo fh r pe m b e d d e di nm n 0 2f i l m st o w a r dh 2 0 2w a s s t u d i e d t h el i n e a rr a n g ef o rh 2 0 2d e t e n n i n a t i o nw a s 舶m1 1o 。t o4 3 1 0 4m 0 1 l 一w i t had e t e c t i o nl i m i to f o 2 1 m n 0 1 l 。1b a s e do ns n = 3 2 t h el a y e r e dd o u b l eh y 出o x i d e s ( l d h s ) n a n o p a n 烈ew a sp r e p 玳db y t h em e t l l o d i n v o l v i n gs e p a r a t en u c l e a ：t i o n a r l d a g i n g h r p a l l dg o d i m m o b i l i z e di 1 1 廿1 el d h sn a l l o p a r t i c l ef i l mm a i m a i nt 1 1 e i rb i o s t m c t u r e ，d u et 0 t h eg o o db i o c o m p a t i b i l i t yo f l d h s t h e h 唾 i n c o 巾o r a t e d i nl d h s n a n o p 缸i c l ef l l m se x l l i b i t e dap a i ro fw e l l d e f i n e da l l dq u a s i r e v e r s i b l ec y c l 迅 v o l t a m m e t r i cp e a k sc h a r a c t e r i s t i co f 冲坷e ( i i i e ( i i ) r e d 0 xc o u p l e t h e r e s u l t i n gb i o s e n s o re x h i b i t e dg o o dr e s p o n s et o 1 2 c 1 2 t h eg o di n c o l p o r a t e di n l d h s n a n o p a r t i c l em m se x h i b 沁dap 鑫i ro fw e l l d e f i n e da n dq u a s i r e v e r s i b l e c y c l i cv o l t 锄m e t r i cp e a l ( sc h a r a c t e r i s t i co fg 0 口- f a d 眦d h 2r e d o xc o u p l e b u tm ee l e t m c a t a l y t i ca c t i v i t ) ，o fg o dt o w a r db d - g l u c o s ew a sn o tf o u n d b e 铆e e n o 7 o 5 vv s a 必g c l k e yw o r d s ： d i r e c te l e c 廿o c h e m i s 扛y ，b i o s e l l s o r ，m r l 0 2n a n o s h e e t s ， l a y r e r dd o u b i eh y d r o x i d e sn a n o p a r t i c l e s ， h q r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，g l u c o s eo x i d a s e 北京化工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 作者签名：墨迹日期： 弘0 0 s s 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大 学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可 以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名： 导师签名： 鬟觥 生歪皇丑垒 日期：塑笪：芏 日期：丝五车g 旦 第章绪论 1 1 电化学生物传感器概述 第一章绪论 生物传感器( b i o s c n s o r ) 是一类以生物活性物质( 如酶，抗体。核酸，细胞等) 为生物敏感基元，并将其固定在信号转换器，通过信号转换器将生物化学信号转化为 相应物理化学信号的检测器。生物传感器对被测物具有高选择性及高灵敏度，这是其 在分析领域中的最大优势。 其中以生物活性物质为敏感基元，以电化学电极为信号转换器，以电势、电流或 电容为特征检测信号的生物传感器称为电化学生物传感器( e l e c t m c h e m i c a lb i o s e n s o r ) ， 也称为生物电极“。电化学生物传感器具有灵敏度高，易微型化，能在复杂体系样品 中进行检测等优势，并且所需的仪器简单、便宜，因而电化学生物传感器在生物传感 器研发及其商业化领域中处于重要地位，已被广泛应用于医疗保健、食品工业、农业、 环境等领域j 。 1 1 1 电化学生物传感器的工作原理 电化学生物传感器工作原理如图l _ l 所示。 图1 1 电化学生物传感器的工作原理示意圈 f i 窖王- i s c h e m a 吐cp r i n c i p l eo f e i e c t r o c h e m i c a ib i o s e n s o t 电化学生物传感器的核心部件是检测器，它主要由两部分组成：一是生物敏感元 件，它由对被测定的物质( 底物) 具有高选择性分子识别功能的膜构成；二是换能器， 它能把膜上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质信息转变为电信号，电信号经过 电子技术处理后，可在仪器上显示或记录下来。 分子识别是分子之间的一种独特的功能。我们称具有分子识别能力的生物分子为 分子识别是分子之间的一种独特的功能。我们称具有分子识别能力的生物分子为 北京化工大学硕士学位论文 生物功能物质。到目前为止，人们已经发现的具有分子识别能力的生物分子有酶、抗 原和抗体、结合蛋白质、植物凝血素和激素受体等。广义地说，微生物也可以被认为 是一种生物功能物质，因为它们通常具有高选择性地同化( 摄取) 某些特定有机化合物 的能力。生物功能物质能够识别相应的生物分子，具有很高的选择性。基于生物功能 物质所制备的生物传感器同样也具有很高的选择性，可以从不经过前处理的样品中直 接检测欲测定的物质。 1 1 2 电化学生物传感器的分类 电化学生物传感器按照生物功能物质的不同可以分为酶传感器、免疫传感器、微 生物传感器、d n a 传感器、组织传感器和细胞传感器等。 按生物传感器与底物的作用机理的不同，又可将电化学生物传感器分为生物催化 型传感器和生物亲和型传感器。生物催化型传感器包括酶传感器，组织传感器，微生 物传感器等；而生物亲和型传感器包括免疫传感器和d n a 传感器等。 按照电化学测量信号，电化学生物传感器主要分为电流型、电位型和电容型。其 中，电流型( 安培型) 生物传感器( v o l t a i i l m e m cb i o s e n s o ro ra m d e r o m e 仃i cb i o s e n s o r ) 具有灵敏度高，可测量的浓度范围宽，选择性高等优异性能，因此有不少电流型电化 学生物传感器已经成功地实现了商业化3 j 。 1 1 3 电化学生物传感器的发展状况 电化学生物传感器是最早问世的生物传感器。2 0 世纪6 0 年代，c l a r k 等最早提出酶 电极的设想，他们把酶溶液夹在两层透析膜之间形成一层薄的液层，再紧贴在p h 电极、 氧电极或电导电极上，用于监测液层中的反应。在1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 把含有葡萄 糖氧化酶的聚丙烯酸胺凝胶膜固定到氧电极上制备了第一支葡萄糖传感器，这一工作 对生物分析来说具有里程碑的意义。国际上从2 0 世纪7 0 8 0 年代开始对生物传感器进 行了广泛研究和探索。1 9 7 2 年，y e l l o ws p r i n g s 仪器公司制造出第一个商业化的用于 血糖和尿糖检测的生物传感器，之后l e e d s ，n o n l l m p 和b e c k m a n 仪器公司也相继推出 用于血糖和尿糖检测的电化学传感器。 按照酶分子与电极间电子传递的机理不同，安培型酶传感器大致经历了三个发展 阶段4 ，5 1 ： 以酶的天然电子传递体氧来沟通酶的电活性中心与电极之间的电子通道，实现 电催化的生物传感器为第一代安培型酶传感器，其工作原理如图l 一2 所示。此类生物传 感器通过检测反应物的消耗( 如溶解0 2 的减少) 或产物的增加( 如h 2 0 2 的生成) 来反 映被测物的浓度变化。由于溶解氧的消耗量受氧分压的影响，这给准确定量检测带来 北京化工大学硕士学位论文 困难。而检测h 2 0 2 一般在较高的电位+ o 6 一十o 8 vv s | a g ，a g c l 下进行，这样高的检测 电位使抗坏血酸、尿酸、乙酰氨基酚等活性物质干扰严重。以上问题严重影响了第一 代安培型酶传感器的广泛应用。 以小分子电子媒介体来代替氧沟通酶的电活性中心与电极之间的电子通道，通过 检测媒介体在电极上被氧化的电流变化来测量底物浓度的变化，由此构造了第二代安 培酶传感器。电子媒介体( m e d i a t o r ) 是指承担着使生物活性物质的活性中心再生任 务，其本身则被还原，在给定电位下，能在电极上再次氧化的有机分子，如亚甲蓝， 硫堇，巯基乙酸，四甲基联苯胺或二茂铁等。一般电子媒介体都具有良好的氧化还原 可逆性和较低的式量电位，较氧更容易被还原态的生物活性物质的电活性中心所还 原，而它自身则又可在电极上再次被氧化。在安培酶电极的响应过程中，酶( e ) 的 活性中心与底物( s ) 发生化学反应，并通过电子媒介体实现酶电活性中心与电极之 间的电子传递，其工作机制如图1 2 所示。这种传感器降低了检测电位，已成功开发出 性能优良的产品，但也由于电子媒介体的引入使其在临床应用时受限于生物相容性的 要求。 3 “g e n e r a t i o n 州一 篡：基裟二。抓。 l 一删矗c a lm e d i a l o r2 “2 b n e r a n o n 图1 - 2 电极附近的酶分子和电极之间的电子转移 f 电1 - 2e l e c 仃o n 缸甜塔f e rb e t w e e ne n 碍m ea n de l e c t r o d e 不需要电子媒介体的存在，利用生物功能物质与电极间的直接电子转移即直接电 化学实现酶的直接电催化，由此构筑的安培酶传感器为第三代安培酶传感器。其工作 原理如图卜2 所示，以辣根过氧化酶测h 2 0 2 传感器为例，其响应机理为： 酶层：h r p r e d + h 2 0 2 + h r p o x + h 2 0 电极：h r p 0 x + e 。 h r p 他d 前两代酶传感器均属于间接电催化，其最大缺点是必须借助电子媒介体而使酶传 感器结构复杂并伎其在使用上具有较大局限性。而基于酶在电极上直接电子转移的第 三代酶传感器是当前酶传感器的研究新方向，它不但在了解生物氧化还原过程的动力 北京化工大学硕士学位论文 学和热力学，探索生命体内生理作用机制等理论研究方面具有重要意义，而且在选择 性、灵敏度和测量范围等性能方面也都比前两代酶传感器有新的突破。 1 2 酶的直接电化学 1 2 1 酶的概述 绝大多数酶( e n z y m e ) 是一种具有催化活性的蛋白质，具有两性电解质性质。酶 分子量较大，大都具有一、二、三、四级结构。酶受到某些物理因素( 如加热、紫外 线照射等) 及化学因素( 如酸、碱、有机溶荆等) 作用时，会破坏酶的高级结构( 构 象) 丽丧失酶活性。 1 2 1 1 酶的结构及性质 酶根据组成成分不同可以分为单纯酶和结合酶。单纯酶为单成分酶，其活性仅取 决于它的蛋白质结构，如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及核糖核酸酶等；结合酶由 蛋白质部分( 也称为脱辅基酶或酶蛋白) 和辅因子两部分组成【6 ，”。 ( 1 ) 蛋白质 各种蛋白质有其特定的氨基酸序列，此即蛋白质的一级结构；氨基酸多肽链通过 氢键进行螺旋、折叠和回折等，构成具有三维立体空间特征的二级结构；二级结构通 过氢键、酯键、离子键和疏水键作用，按一定方式再进行盘曲折叠而形成蛋白质的三 级结构。具有三级结构的蛋白质单元一般称为蛋白质的亚基，每个亚基可由一条肽链 或多条肽链组成，它已具备了蛋白质的活性。有些蛋白质只包含一个这样的亚基，而 有些蛋白质包含多个亚基并由其组合构成完整蛋白质，此即蛋白质的四级结构。 每种蛋白质的表面特征都是特异性的，其表面某些特殊区域的结构特征决定了蛋 白质的生物效应。对于酶蛋白而言，此即酶的高度专一的催化活性，这是由于每种酶 蛋白都具有很复杂的表面，在它的肽链骨架上伸出不同的侧链，这些侧链的长短及所 带电荷均可不同，只有那些具有能与其表面结构良好吻合的分子结构特征的底物才能 与酶有良好的结合，进而发生反应。在酶蛋白的这些表面活性位点，主要是由于特定 的氨基酸序列而确定底物在其上的取向并由此导致了酶的高度特异性及催化性能。在 这些活性位点中，最常见的氨基酸有组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、谷氨酸和 天冬氨酸等，在它们侧链上分别是具有反应活性的咪唑环、氨基、巯基、羟基或羧基 等基团，因而能对底物的反应进行催化。 ( 2 ) 辅因子 酶的催化活性不是仅靠酶蛋白就能实现的，辅因子在酶所催化的反应中起着传递 氢、电子、原子和化学基团的作用，某些金属元素起着底物与蛋白的“搭桥”作用。二 北京化工大学硕士学位论文 者共同作用才表现出酶的催化活性。酶的辅因子分为辅基( p r o s l h e t i cg r o u p ) 和辅酶 ( c o e n z y m e ) 。与酶蛋白结合的较松散的( 一般为非共价结合) 并可用透析方法除去的 称为辅酶；与酶蛋白结合牢固( 一般以共价键结合) ，不能以透析方法除去的称为辅 基。 辅基和辅酶的化学本质主要是两种物质：一类为金属元素，如铜、锌、镁、锰、 铁等，另一类为小分子有机物，如维生素( v i t a i n i n ) 、铁卟啉( i r o n - p o r p h 蜘n ) 等。 ( 3 ) 酶的活性中心 酶的活性中心是指酶蛋白分子中与催化有关的特定区域，它能与底物结合并发挥 催化作用。酶的活性中心般位于酶分子的表面，具有特定的空间结构，其中包括底 物结合部位即结合中心( b i n d i i l gc e n t e r ) 和促进底物发生化学变化的部分即催化中心 ( c a t a l 舛cc e n t e r ) 。前者决定酶的专一性，后者决定酶的催化反应性质。 活性中心的空间结构是由酶蛋白质结构所决定的，破坏了酶蛋白的结构，必然破 坏酶的活性中心，从而使酶丧失催化活性。此外酶蛋白活性中心以外的其余部分具有 维持构象及保护微环境的作用。酶分子的亲水性，酶分子所带电荷及分布，以及活性 中心周围的环境对于酶的催化特性也都具有重要意义。 1 2 1 2 酶的催化特性 酶与一般催化剂相比具有以下特性日】： ( 1 ) 催化效率高：酶催化反应的速率比非酶催化反应高1 0 7 一1 0 旧倍。 ( 2 ) 专一性强：一种酶只能催化某一种或某类反应，称为催化的专一性。酶 的专一性分为两种类型： 反应专一性：有些酶对底物的要求非常严格，只作用于一种底物，丽不作用 于任何某他物质，这种专一性称为“绝对专一性”；有些酶对底物的要求比上述绝对 专一性略低一些，它的作用对象不只是一种底物，这种专一性称为“相对专一性”。 结构专一性：当底物具有旋光异构体时，酶只能作用于其中的一种，这种对 于旋光异构体底物的高度专一性称为“旋光异构专一性”，它是酶反应中相当普遍的 现象：当酶作用的底物是含有双键的不饱和化合物，底物就具有几何异构( 顺反异构) 现象，而酶只作用于底物顺式和反式中的一种，而不作用于另一种，这种专性称为 几何异构专一性。 ( 3 ) 反应条件温和：酶催化反应一般在p h = 5 8 的水溶液中进行，为常压反应， 反应温度范围为2 0 4 0 。 ( 4 ) 具有可调控性：酶催化反应是可调控的，如采用抑制剂调节、共价修饰调 节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。 酶的催化作用机制主要有： 北京化工大学硕士学位论文 ( 1 ) 定向作用：底物分子进入酶的活性中心，增大了底物分子在该区域的有效 浓度，并使酶蛋白发生一定构象改变，使反应所需的酶活性中心中的必需基团正确排 列并定向，以便能与底物契合。 ( 2 ) 张力或变形作用：底物分子在酶活性位点表面结合，使底物分子中的不稳 定化学键产生张力或形变，因而较易发生断裂。 ( 3 ) 共价催化：酶与底物通过形成具有高反应活性的亲核或亲电共价中间物实 现催化。 ( 4 ) 酸碱催化：酶是一种广义的酸碱催化剂，即质子受体和质子供体的催化剂。 这是由于酶蛋白中含有多种供质子或受质子的功能基，如氨基、羧基、巯基、酚羟基 及咪唑基等。酶的最适p h 值接近中性，因此为在近于中性条件下进行酸碱催化创造 了有利条件。 ( 5 ) 疏水效应：活性中心往往靠近或处于酶蛋白表面疏水性的凹陷或裂隙中， 其较极性环境中低的介电常数使带电物之间的电作用力显著升高。 1 2 1 _ 3 酶的分类 根据酶催化的反应类型，1 9 6 1 年国际生物化学联合会酶学委员会将酶分为六大 类： ( 1 ) 氧化还原酶( o x i d o r e d u c t a s e ，e c1 x x x ) ：催化底物氧化或还原，反应时需 要电子供体或受体。生物体内众多的氧化还原酶在反应时需要辅酶的共同参与。 ( 2 ) 转移酶( 廿a 1 1 s f e ra s e ，e c2 x x x ) ：催化功能团从一个底物转移给另一个底 物。它们的底物必须有两个，一个是供体，一个是受体。如转氨酶转移的功能团是一 个很小的基团氨基；糖基转移酶转移的是较大的基团糖基，甚至是一条多糖链。 ( 3 ) 水解酶( 1 ly d r 0 1 a s e ，e c3 x x x ) ：催化底物的水解，需要水分子参与。水解酶 分子结构简单，来源丰富，广泛地用于生物催化的手性合成反应中，如脂肪酶、酯酶、 蛋白酶等。 ( 4 ) 裂合酶( 1y a s e ，e c4 x x x ) ：催化底物分子裂解成两个部分，其中之一含有 双键，这与水解酶不同。这类酶催化的反应具有可逆性，裂解的键可以是碳碳、碳氧 或碳氮键等，如醛缩酶。 ( 5 ) 异构酶( i s o m e r a se ，e c5 x x ，x ) ：催化底物分子内的重排反应特别是构型 的改变。如葡萄糖异构酶。 ( 6 ) 连接酶( 1 i g a s e ，e c6 x x x ) ：连接酶又称合成酶( s y i l _ m e t a s e ) ，催化两个底 物连接成一个分予，在反应时由三磷酸腺甙( a t p ) 或其他高能化合物供给反应所需 的能量，例如脂酰c o a 合成酶。 北京化工大学硕士学位论文 1 2 2 蛋白质和酶的直接电化学 生物分子的电子迁移反应是生命过程的基础，人们付出很多努力去理解生物分子 内和生物分子间的电子迁移反应机理。生物酶分子具有优良的催化性能和高选择性， 因此一直是化学、生物学、医学，特别是生命科学的重要研究对象。很多酶催化是在 酶的氧化型和还原型之间互相转化，其过程中经历电子转移。电化学方法适合于研究 生物大分子的电子迁移反应，如酶的电子迁移。因此蛋白质和酶的电化学研究应运而 生。 蛋白质和酶的直接电化学研究具有重要的意义。它可以为人们了解生物氧化还原 过程的动力学和热力学提供更加便利和有效的方法，这对了解生命体内的能量转换和 物质代谢，了解生物分子的结构和各种物理化学性质，探索生命体内生理作用阻及作 用机制具有重要的意义。例如，在生命体内许多涉及氧化还原蛋白质的化学反应都发 生在带电荷的生物膜上或其附近，因而其电子的传递必然会受到电场的作用或影响。 这种电场的作用和影响与电化学研究中的工作电极表面或其附近的情况十分相似，所 以，氧化还原酶在电极上的电化学研究，以氧化还原酶与电极之间的电子传递过程来 模拟生命体内的电予传递过程的机理和生理作用具有重要意义。此外酶氧化还原活性 中心与电极之间的电子传递，在电流型酶传感器中起着关键性的作用，因此研究酶在 修饰薄膜电极上直接电子转移，利用电极取代酶的电子媒介体，这为开发第三代酶生 物传感器提供了新的思路1 9 i ，含有功能蛋白质的修饰薄膜在生物传感器和生物催化方 面展现了良好的应用前景。 目前，蛋白质和酶的直接电化学研究仍只局限于一些结构和功能比较清楚的氧化 还原蛋白质和酶，如均含有血红素的细胞色素c ( c y tc ) 、细胞色素b 5 l 、细胞色 素p 4 5 0 12 1 、肌红蛋白( m b ) 【1 3 】、血红蛋白( h b ) 【1 4 】，过氧化氢酶( c a t a l a s e ) ， 辣根过氧化酶( h r p ) | _ 1 6 】，含有黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 的葡萄糖氧化酶( g o d ) m 以及含c u 的漆酶( l a c c 踮e s ) l ”l 等。表1 一l 给出了几种研究比较广泛的氧化还原酶 的结构参数。 有许多因素影响了电极和蛋白质之间的直接电子转移。包括：( 1 ) 电活性基团深 埋于蛋白质结构中；( 2 ) 蛋白质在电极表面吸附失活；( 3 ) 蛋白质在电极表面的不适 合的取向和电极表面因污染而钝化。 为了实现蛋白质在电极之间的直接电子转移，人们主要采用了如下方法：( 1 ) 使 用高纯的蛋白质溶液和特别干净的电极：( 2 ) 在电极表面修饰媒介体分子吸附合适取 向的酶分子；( 3 ) 在金电极表面化学吸附硫醇单分子层，另一端键合蛋白质：( 4 ) 引 入无机纳米粒子吸附蛋白质，修饰在电极上。 北京化工丈学硕士学位论文 1 3 无机纳米材料增强电化学生物传盛器的研究 纳米结构所具有的小尺寸效应、表面与界面效应使无机纳米材料呈现出独特性 能。无机纳米材料具有无毒副作用，良好生物相容性，耐腐蚀等优异的性能，受到生 物材料研究者的广泛关注。无机纳米材料作为一种有潜力的生物纳米材料已经被广泛 地用于生物、医药等领域【2 4 1 。 目前，第三代电化学生物传感器正在快速发展，但它的灵敏性和应用范围存在着 一定的局限性。这是由于：( 1 ) 没有种简便的方法来固定生物活性物质；( 2 ) 一些 生物活性物质( 如酶，细胞，微生物等) 的活性中心在一定程度上被蛋白质所掩蔽， 因此生物活性中心与电极之间的直接电子传递就比较困难。因此人们研究将无机纳米 材料引入电化学生物传感器体系，从而提高电化学生物传感器的电信号响应灵敏度及 稳定性。 1 3 1 纳米材料及其性质 现在普遍认为尺寸在1 1 0 0 衄范围内的物质属纳米材料范畴，其物理和化学性质 与1 0 0 m 以上的颗粒有着明显的区别。纳米材料具有比表面积大、表面活性中心多、 吸附能力强，表面亲水性强等优异性质。研究者将纳米材料应用于生物电化学传感器 中，实现了生物活性物质与电极之间的直接电子转移，提高了电化学生物传感器的电 信号响应灵敏度及稳定性。 纳米材料增强电化学生物传感器性能的可能机制为： ( 1 ) 由于纳米材料比表面积大、表面自由能高，因而生物活性物质在纳米颗粒 表面的吸附量有所增加，并且得到强有力的固定，有效地防止了生物活性物质在测试 北京化工大学硕士学位论文 溶液中的流失。因而可以显著提高电极的电流响应灵敏度及稳定性。 ( 2 ) 纳米材料具有的表面效应使其表面存在许多悬空键，具有很高的化学活性 并且纳米固体材料表面亲水性更强，这些性能能够增强无机材料的生物相容性。 ( 3 ) 纳米材料具有宏观量子隧道效应【2 “，微观粒子具有贯穿势垒的能力称为隧 道效应。隧道效应能够促进酶的氧化还原中心与电极间通过纳米粒子进行电子传递。 因此纳米材料可以在保持生物功能物质活性的基础上，实现固定化生物活性物质 之间、固定化活性物质与电极之间有效的电子传递。 1 3 2 增强电化学生物传感器的纳米材料分类 目前用于增强电化学生物传感器性能的纳米材料有多种，根据维度约束的不同可 以划分为零维纳米材料、一维纳米材料和二维纳米材料3 类 2 6 】： ( 1 ) 零维，指在空间三维尺度均受到约束，如纳米颗粒、纳米团簇等【2 7 l ； ( 2 ) 一维，指在空间有两维处于纳米尺度，受到了约束，例如纳米线、纳米棒、 纳米管等： ( 3 ) 二维，指在三维空间中有一维在纳米尺度，如超薄膜、多层纳米结构等。 1 3 2 1 零维纳米材料 纳米粒子的特殊性质被研究者用于开发各种各样的高灵敏度高选择性的检测方 法和器件。零维纳米材料作为应用于电化学生物传感器领域中最为广泛的纳米材料， 倍受关注。其中应用最早的纳米粒子是纳米金胶颗粒，它是最稳定的金属纳米粒子， 被应用于多个体系来实现氧化还原蛋白质或酶与电极之间直接电子转移，提高了生物 传感器的性能。如陈洪渊研究组拉州先后成功地将h r p 、血红蛋白( h b ) 、肌红蛋白 ( m b ) 、乳酸脱氢酶( l d h ) 和辅酶( n a d ) 固定在纳米金胶的仿生功能界面，实 现了氧化还原蛋白质和酶的直接电化学，研制出了一氧化氮、乳酸、过氧化氢等第三 代生物传感器，研究表明纳米金胶的引入能够明显地提高传感器的灵敏性，使检出限 浓度降低。纳米金颗粒能与巯基结合构成分子自组装膜( s a m s ) ，具有很好的生物 相容性，b a i 【3 0 j 将直径6 m 的金胶体自组装在功能化修饰的金电极表面，构造了自组 装单分子膜( s a m ) ，研究了纳米金胶在电容型免疫传感器上的应用，通过电极间阻 抗的变化，实现对抗体的监测，其检出限达到了5 0 n g l - i 。 人们在研究纳米金胶对电化学生物传感器增强作用的同时，也开展了对其它纳米 金属粒子的研究。c h e n 等人p i 】将g o d 吸附在纳米p t 上来修饰碳纳米管电极。结果 表明其稳定性和灵敏度都有明显的改善。唐芳琼等人p2 。” 将g o d 固定在纳米银、纳 米铜上，也先后得到电信号增强的生物传感器。c a i 等人1 3 4 j 还研究了纳米银增强的纳 米金标记的d n a 电化学生物传感器，灵敏性提高了两个数量级，检出限达到了5 0 口m 。 北京化工大学硕士学位论文 半导体材料( 氧化物) 具有良好的生物相容性【 】，相比纳米贵金属材料更加廉价。 因此将一些具有生物相容性的半导体氧化物引入电化学生物传感器体系中倍受关注。 纳米t i 0 2 颗粒具有高比表面积，很好的生物相容性，相对较高的导电率等优异的性能， 因而被广泛地应用于蛋白质( 如细胞色素c ，肌红蛋白m b ，血红蛋白h b ，辣根过氧 化酶h r p 【3 6 】等) 在电极表面的固定化修饰，研究它们在电极上的直接电化学行为。此 外人们还研究了纳米z 向2 p ”，纳米s n 0 2 渊，纳米n b 2 0 5 i3 9 1 ，纳米f e 3 0 4 【矧，纳米z n o f 4 1 j 等纳米氧化物颗粒对氧化还原蛋白及酶的直接电化学作用，以及在电化学传感器中的 应用。 1 3 2 2 一维纳米材料 1 9 9 1 年i i i i m a 发现了纳米碳管，它优异的物理化学性能引起了人们的关注，掀起 了对典型一维纳米材料一纳米管的研究热潮。由于纳米碳管表现出的金属性或半导体 性质，近年来，许多科学家将其应用于电化学生物传感器中，固定蛋白质或酶，保持 其活性，研究酶和蛋白的直接电化学行为。c a i f 4 2 4 3 】等研究发现多壁碳纳米管能有效 地实现h r p 和g o d 在电极上的直接电子转移，成功制各了性能优异的第三代生物传 感器。r u s l i n 2 【4 4 i 等应用单壁碳纳米管实现了h r p 在电极上的直接电化学行为。 z h o u f 4 5 】对比了t i 0 2 纳米管和t i 0 2 纳米颗粒对m b 的直接电化学行为和催化行为的影 响，发现具有一维纳米管结构的t i 0 2 更具优势。 1 3 2 3 二维纳米材料 作为典型二维纳米材料的层状纳米材料被认为是生物修饰电极中最有前景的材 料1 4 6 】。层状材料一般分为阳离子型层状材料( 即层板带负电，层间以阳离子平衡电荷) 和阴离子型层状材料( 即层板带正电，层间以阴离子平衡电荷) 。早在2 0 世纪7 0 年 代用具有层状结构的黏土材料来修饰电极就引起了许多电化学工作者的关注，这是因 为层状黏土具有许多离子聚集体的优异性质：材料廉价易得，独特的层间离子交换性 自，层板可调控性，很好的热和化学稳定性等。丽作为有效的生物无枫材料来说，必 须满足以下条件，例如在母体结构上能够固定高密度的生物分子，具有开放的是结构 使底物分子容易接近，良好的生物相容性和稳定性。而二维层状材料的低维结构决定 了其具有开放结构，有利于多种有机大分子的插入。这种二维层状表现出高的比表面 积，有利于进行生物分子的固定化。层板带电荷，层间通过范德华力和氢键力等弱键 力键合，这使层间域具有可扩展性( 溶胀作用) ，使生物分子通过静电力引入层问与 层板作用成为可能。另外二维结构更易纳米结构化，具有机械和热稳定性，因此层状 黏土被认为是有潜力的生物分子载体，固定生物催化剂一酶【4 7 醇j 。 二维层状材料与生物分子的杂化材料在生物传感器和生物反应器领域倍受关注。 p o y a r d 等人 删将阳离子层状黏土( l 印o n i t e ) 和g o d 用戊二醛偶联固定在铂电极上， l n 北京化工大学硕十学位论文 研究了g o d 在铂电极上的直接电化学行为，制成灵敏度更高的第三代葡萄糖传感器 检出限达到了n m 级，充分证明了具有二维结构的层状纳米材料的良好应用前景。 1 4 层状纳米材料的简介 1 4 1 阳离子型屡状二氧化锰简介 1 4 1 1 层状二氧化锰的结构 自然界中的二氧化锰以多种晶型存在，如a 、d 、”6 等，其中6 型二氧化锰具有 层状结构，其结构示意图如图1 3 。层状二氧化锰由m n - o 八面体构筑主体层板，氧 原子位于八面体角顶上，锰原子在八面体的中心，【m n 0 6 】八面体与相邻八面体沿棱结 合形成二维层板结构，由于层板中部分m n 以+ 3 价形式存在，m n 0 2 层板带一定的负 电荷，层间可交换的带正电离子h + ，n a + 等平衡电荷，此外层间还存在一些水分子， 主客体均以有序的方式排列，因此层状二氧化锰具有超分子结构特征。超分子结构是 主、客体间通过非共价键缔合作用形成的，这种非共价键一般为静电力、氢键和范德 华力等。 0 5 n 1 t l 图l - 3 层状二氧化锰的结构示意图 f i g 1 3s 讥i c t i l r a lm o d e lo f b i m e s s i t e 0 7 m n 1 4 1 2 层状二氧化锰的主要性质 ( 1 ) 层间阳离子的可交换性 层状二氧化锰层间存在的阳离子具有一定的交换能力，能够用其它金属离子、氢 离子或有机铵盐将其置换出来。o o i 刚和s u i b 川等分别将四甲基铵、四乙基铵、四 丙基铵和四丁基铵离子插入层状氧化锰中，系统地研究了层板的扩张。 ( 2 ) 可剥层性 o o 1 1 等最早发现层状氧化锰剥离现象，他们用四甲基铵离子插层氧化锰，随后 用水多次洗涤插层产物，当水洗四次后，得到剥离的氧化锰灰浆，x r d 显示为无定 型态，干燥后又可以复原为层状结构，作者认为用水可以洗出层间部分四甲基铵离子， 从而引起层板的坍塌。s a s a h 【5 2 】等用四丁基铵( t b a ) 离子插层氧化锰，改变t b a + 北京化工大学硕士学位论文 与氧化锰层间可交换的h + 浓度比值，得出一个普遍插层规律，如图l