（应用化学专业论文）BowmanBirk型大豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及性质研究.pdf

摘要 摘要 胰蛋白酶抑制剂广泛存在于动、植物和微生物中，泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的多 肽或者蛋白质。 研究表明大豆中至少含有5 种胰蛋白酶抑制剂，但目前其中只有库尼兹( k u n i t z ，k t i ) 、 包曼一伯克( b o w m a n b i r k ，b b i ) 两种类型抑制剂被分离。 对粗b b i 的提取研究。首先采用乙醇对b b i 进行进取，通过单因素实验确定了比较适宜 的乙醇提取条件，包括乙醇浓度4 0 - - 一8 0 、液料比( 乙醇质量干燥脱脂大豆粉质量g ) 4 6 、 提取时间3 0 6 0 m i n 和提取温度3 0 6 0 。然后利用正交试验得出最佳的乙醇提取条件为： 乙醇浓度6 5 ，液料比( 乙醇质量干燥脱脂大豆粉质量g ) 为5 ，提取时间6 0 n i n ，提取温度 6 0 。乙醇提取后，又采用等电点法。调p h 值，b o w m a n b i r k 型大豆胰蛋白酶抑制剂的等 电点为4 2 ，使胰蛋白酶抑制剂在等电点时达到最大沉淀，然后加入丙酮，沉淀溶液中的胰蛋 白酶抑制剂。并做单因素实验得出最佳丙酮用量为：丙酮质量g ，调p h 值后溶液质量g = 2 。 再进行超滤，选出超滤的各项参数。包括超滤压力6 0 k p a ，超滤温度3 5 。最后进行真空干 燥得出粗b b i 晶体。根据b r a d f o r d 法按最佳乙醇提取条件和最佳丙酮用量以及上述超滤条件 测得b b i 粗晶体得率为6 1 m g g 。根据b a p n a 法以s i g m a 公司b b i 为标准品测得b b 粗晶 体中b b i 的总含量为9 3 7 。 对粗b b i 纯化的研究。本实验采用d e a e 一2 5 离子交换层析和s e p h a d e xg 一5 0 凝胶柱过滤， 得出的纯品，根据8 a p n a 法以s i g m a 公司b b i 为标准品测得实验所得纯品纯度为9 9 8 。 采用b a p n a 法测定b b i 抑制活性，得出b b i 的量与吸光度变化值之间的正比变化关系。 本课题还对b b i 的稳定性做了研究，分别改变影响b b i 抑制活性的条件以得到b b i 稳 定性方面的数据。对b b i 抑制活性影响的因素有温度、p h 值、还原剂。分别在不同的温度下 处理b b i 。同时采用b a p n a 法测定b b i 抑制胰蛋白酶吸光度变化值。得出b b i 的热稳定性。配 制不同p h 值的缓冲液处理b b i ，p h 3 0 ，采用1 0 m o l l 的甘氨酸- h c i 缓冲液；p h 4 o “0 ， 采用o i m o l l 的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液：p h 7 0 ，采用0 1 m o l l 磷酸二氢钠磷酸二钠盐缓 冲液：p h 8 0 9 0 采用o 1 m o l l 的t r i s h c i 缓冲液；p i l l 0 0 1 2 0 采用0 1 m o l l 甘氨酸一氢氧 化钠缓冲液，处理1 2 h 观察其抑制活性的变化，然后用p h 8 0 的缓冲液处理1 2 小时，再观察 其抑制活性的变化。 p h 值的变化对b b i 的抑制活性的改变是可逆的。又通过实验还原剂 d t t 对b b i 的抑制活性的影响得出b b i 对还原剂也有很强的稳定性。 本实验也对b b i 的失活进行了研究。采用超声波法。超卢频率为1 0 0 k h z ，在不同的超声 时间处理下，测定b b i 抑制活性。发现在1 0 0 k h z 的超声处理3 m i n ，b b i 完全欠活。 关键词：胰蛋白酶抑制剂；b a p n a ；超滤；稳定性；超声波 v i i 东北农业大学农学硕士学位论文 s t u d yo n e x t r a c t i o n 、s e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o no fs o y b e a nb o w m a n - - bi r k i n h i bi t o r a b s t r a c t t r y p s i ni n h i b i t o ri sw i d e l yc o n s i s ti na n i m a l s 、p l a n t sa n dm i c r o o r g a n i s m ，g e n e r a l l y ，t h e ya r e p o l y p e p t i d ea n d p r o t e i nw h i c hc a l li n h i b i t ea c t i v i t i e so ft r y p s i n i tc a na l s og r e a tad y n a m i cb a l a n c e w i t hc o r r e s p o n d i n gp r o t e o l y t i ce n z y m e st oa d j u s tm a n yi m p o r t a n tl i f ea c t i v i t i e si nt h el i v e s i th a sb e e nr e s e a r c h e dt h a tt h e r ea r ef i v ek i n d so ft r y p s i ni n h i b i t o r si ns o y b e a n ，b u to n l yt w o k i n d so ft h e m ，k u n i t zs o y b e a ni n h i b i t o ra n db o w m a n - b i r ks o y b e a ni n h i b i t o rw e r ee x t r a c t e d s t u d yo ne x t r a c t i o no fr o u g hb b i a tf i r s tw ee x t r a c t e db b lw i t he t h a n o lf r o md e f a t t e d s o y b e a np o w d e r t h r o u g ht h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t ，w ec a ng e ts u i t a b l ec o n d i t i o ns c o p eo f e t h a n o le x t r a c t i o n t h ec o n d i t i o n si n c l u d ec o n c e n t r a t eo fe t h a n o l4 0 - - 8 0 、f l u i da n dm a t e r i a l r a t i o ( q u a l i t yo fa l c o h o lg q u a l i t yo fd e f a t t e dd r y i n gs o y b e a np o w d e rg ) 4 - - 6 、t i m eo fe x t r a c t i o n 3 0 - - 6 0 m i n 、t h et e m p e r a t u r eo f e x t r a c t i o n3 0 6 0 t h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n t so f f o u rf a c t o r s a n dt h r e el e v e l s ，t h eb e s tc o n d i t i o n so fe t h a n o le x t r a c t i o nw e r ed e t e r m i n e d a f t e re t h a n o le x t r a c t i o n a d j u s tp ht ot h e i s o e l e c t r i cp o i n to fb b i ，p h 4 2 t h et r y p s i ni n h i b i t o rh a st h em a x i m u m p r e c i p i t a t i o na tt h ei s o e l e c t r i cp o i n t t h ea c e t o n ew a sa d d e di n t o i tf o rp r e c i p i t a t i n gt h et r y p s i n i n h i b i t o r si nt h el i q u o r t h r o u g ht h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tt h eb e s ts u i t a b l eq u a l i t yo fa c e t o n e c a nb ed e t e r m i n e d t h e nu l t r a f i l t r a t i o nw a sg i v e n t h r o u g he x p e r i m e n tt h ep a r a m e t e r so ft h r e e k i n d so fu l t r a f i l t e r a t i o nc a nb ed e t e r m i n e d t h e yi n c l u d ep r e s s u r e 、t i m ea n dt e m p e r a t u r eo f u l t r a f i l t r a t i o n f i n a l l y , v a c u u md r y i n gw a su s e dt og e tr o u g hb b ic r y s t a 。 s t u d y o nt h e p u r i f i c a t i o n o ft h er o u g hb b i i nt h i s s t e p ，d e a e - 2 5i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h ya n ds e p h a d e xg 一5 0g e lf i l t r a t i o nc o l u m nw e r eu s e d t h ep u r eb b lw h i c hw eg e t t h r o u g he x m p e r i m e n ta n dt h es t a n d a r db b io fs i g m aw e r ei nc o m p a r i s o ni nt r y p s i ni n h i b i t o r y a c t i v i t y t h eb a p n a m e t h o dw a su s e dt od e t e r m i n et h ei n h i b i t o r ya c t i v i t i e so fr o u g hb b i ，p u r i f i e d b b ia n db b io fs i g m a b yc o n t r a s t ，i d e n t i f yr e l a t i o n s h i pb e t w e e nb b ii nt h eq u a l i t ya n dv a l u eo f a b s o r b a n c ec h a n g e s a n dc o m p a r et h ep u r i f i e db b lw h i c hg o tb ye x p e r i m e n ta n db b io fs i g m a t h ee x p e r i m e n t sa l s ow e r e d o n eo nt h es t a b i l i t yo fb b i s e p a r a t e l yc h a n g e sa f f e c tb b i i n h i b i t o r y a c t i v i t yc o n d i t i o n s t og e tb b is t a b i l i t yd a t a t h ef a c t o r s t h a ta f f e c tb b ih i h i b i t o r y a c t i v i t yi n c l u d et e m p e r a t u r e ，p h ，r e d u c t a n t d ow i t hb b ia td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e m e a n w h i l e ， t a k i n gb a p n ad e t e r m i n a t i o nb b ii n h i b i t et r y p s i nc h a n g e si na b s o r b a n c ev a u l e s t h r o u g ht h i s ，w e c a ng e tt h et h e r m a ls t a b i l i t yo fb b i p r e p a r a t i o no fd i f f e r e n tp hb u f f e rh a n d l i n gb b i p h 3 0b y v i i i a b s t r a c t m o l ls o d i u md i h y d r o g e np h o s p h a t e - t w os o d i u mp h o s p h a t eb u f f e r p h 8 0 9 0b y0 1m o l l t r i s h c lb u f f e r p h10 0 12 0b y0 1m o l lg l y c i n e n a o l hb u f f e r w i t h12h o u r st oo b s e r v et h e c h a n g e si nt h ei n i h i b i t o r ya c t i v i t y a n dt h e nd ow i t hi ta g a i nw i t ht h eb u f f e rp h 8 0f o r12h o u r s t h ep hc h a n g et h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo fb b ii sr e v e r s i b l ei n h i b i t i o n a tl a s ta d o p t i o no ft h e r e d u c t a n td t tw h i c hi n f l u e n c eb b ii n h i b i t o r ya c t i v i t yt od r a wac o n c l u s i o nt h a tb b ih a ss t r o n g s t a b i l i t ya g a i n s td t t a l t h o u g ht h et r y p s i ni n h i b i t o ro fp l a n ti s e s s e n t i a lt op l a n t ，a n da l s oh a sv e r yi m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a lf u n c i t o n s t h et r y p s i ni n h i b i t o ri nf e e dw h i c hh a st h en e g m i v ee f f e c t so i lt h eg r o w t h a n dd e v e l o p m e n to fl i v e s t o c k y h e r e f o r e t h es t u d ya l s oe x m i n e st h eb b id e a c t i v a t i o n u s i n g u l t r a s o n i cm e t h o d u l t r a s o u n df r e q u e n c yo f10 0 k h z ，i nd i f f e r e n tt i m eu l t r a s o u n dt r e a t m e n t ， d e t e r m i n e dt h ei n h i b i t o r ya c t i v i t i e so fb b i k e y w o r d s ：t r y p s i ni n h i b i t o r ；b a p n a ；u l t r af i l t e r s ：s t a b i l i t y ；u l t r a s o n i cw a v e i x c a n d i d a t e ：w a n gc h a n g l i a n g s p e c i a l i t y ：a p p l i e dc h e m i s t r y s u p e r v i s o r ：p r o f z h a n gy o n g z h o n g 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 一 。 ( 洼! 翅逡查墓丝益噩挂别壹魉鲍：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：曼荭良 日期：加醒年石月哆日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：宅缪艮日期：矽矽年乡月哆日 导师签名字长扛悬日期歹睹钿弓日 引言 1 引言 胰蛋白酶抑制剂广泛存在于动、植物和微生物中，泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的多 肽或者蛋白质，能与相应的蛋白水解酶形成一定的动态平衡，调节生命体内许多重要的生命 活动。胰蛋白酶抑制剂具有广泛的生物活性和作用，对于急性腺炎、肺气肿、出血性和败血 性休克等疾病有独特的疗效，植物来源的胰蛋白酶抑制剂还有抗某些病虫害的天然防御功能， 能削弱或者阻断昆虫消化道内的蛋白酶对植物蛋白质的消化作用而使昆虫非正常发育或死 亡。而胰蛋白酶抑制剂在植物中广泛存在，主要分布在豆科，禾本科等植物中。 大豆属于蝶开形花科，大豆属。别名黄豆。我国许多古书上曾称大豆为菽，诗经中 就有：“中原有菽，庶民采之”的记载；西晋杜预对菽字注释：“菠，大豆也”；秦汉以后就以 豆字代替菽字了。大豆原产于我国，据推算，我国种植大豆已有4 7 0 0 多年的历史。欧美各国 栽培大豆的历史很短，大约在1 9 世纪后斯才从我国传去。本世纪3 0 年代，大豆栽培已遍及 世界各国。 已研究表明大豆中至少含有5 种胰蛋白酶抑制剂，但其中只有库尼兹( k u n i t z ，k t i ) 、包 曼一伯克( b o w m a n b i r k ，b b i ) 两种类型抑制剂被分离。其生化性质如表卜1 ： 表1 - 1k t i 与b b i 的生化性质 t a b 1 1b i o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fk t ia n db b i 生化性质 k t ib b l 分子量2 1 ，5 0 07 ，9 7 5 氨基酸残基数 1 9 77 2 等电点4 5 4 2 二硫键 27 对热、酸的稳定性不稳定稳定 1 1 蛋白酶抑制剂的分类 蛋白酶抑制剂( p r o t e a s e i n h i b i t o r ) 普遍存在于自然界中。在植物、动物及微生物中均有蛋 白酶抑制剂在存在。目前已发现的蛋白酶抑制剂数量庞大，根据其抑制的蛋白酶种类基本上 可将它们分为丝氨酸蛋白酶类、巯基蛋白酶类、羧基蛋白酶类及金属蛋白酶四大类。而植物 中的蛋白酶抑制剂，以丝氨酸蛋白酶抑制剂为主。本实验所研究的大豆b o w m a n b i r k 型胰蛋 白酶抑制剂属丝氨酸蛋白酶抑制剂。 根据抑制剂的氨基酸排列顺序，拓朴学性质级结合机制，义可将丝氨酸蛋白酶家族分为 1 6 个家族，其中已有一些通过x r a y 单晶衍射的方法阐明其二维结构，在植物中已发现其 东北农业人学农学硕l j 学位论文 lnmi mii mi 中的7 个亚家族，其中主要以b o w m a n b i r k 家族、k u n i t z 家族、p i i i i 家族研究最多。 1 1 1k u n i t z 亚家族 k u n i t z 型抑传# 0 j ( k t i ) 是丝氨酸蚩白酶抑制剂的一个主要的类型，分子量约为2 0 1 0 0 。内 含1 8 1 个氨基酸残基，2 个二硫键( c y s 3 9 一c y s 8 6 ，c y s l 3 8 c y s l 4 5 ) ，其活性中心是a r 9 6 3 一 i l e 6 4 ，且一个k s t l 分子抑制剂能钝化1 个分子胰蛋向酶。s k t i 结构为直径约3 - 5 n m 球体， 由12 个反平行1 3 带十字交叉构成，其疏水性侧链起到主要稳定作用，因而通常称k s t i 属1 3 折叠蛋白。1 w a s a k i 等人对来自土豆的单头k u n i t z 抑制剂进行酶解，得到了一个含有4 0 个氨 基酸残基的活性片段。该片段中含有l y s s e r 的活性中心肽键，对胰蛋白酶仍保持有较强的 抑制力。另一种米白土豆的k u n i t z 型抑制剂的活性片段对胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌酶有很强 的抑制活力，这两种片段的共同点是都含有l y s s e r 活性肽键( 如图1 所示) 。 图1 1 土豆蛋白酶抑制剂的活性片段 f i g 1 1a c t i v es e c t i o no fp o t a t ot r y p s i ni n h i b i t o r 1 1 2p i i 和p i i i 家族 p i i 和p i i i 家族是一类诱导型的蛋白酶抑制剂。其中p i i 家族包括马铃薯蛋白酶抑制剂 i 和蕃茄蛋白酶抑制剂i ，它们的分子量为8 1 k d ，只有一个活性中心，主要抑制胰蛋白酶， 而对胰凝乳蛋白酶抑制作用较弱。p i i i 家族包括马铃薯蛋向酶抑制剂i i 和番茄蛋白酶抑制剂 i i ，由两个重复序列构成，分子量为2 4 k d ，包含两个活性中心，能抑制胰蛋白酶和凝乳蛋白 2 引言 酶。b e e k w i l d e r 等人发现马铃薯蛋白酶抑制剂i i 的两个活性中心具有不同的反应特性，其中 第二活性位点具有强烈抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的能力，而第一活性位点只能抑制胰凝 乳蛋白酶，且对突变很敏感，容易丧失活性。 1 1 3s e r pinb 亚家族 b 族( s e r p i nb ) ，最初是因为其与鸡卵精蛋白存在极高的序列同源性而被称为卵清蛋白样 丝氮酸蛋白酶抑制剂( o v - s e t - p i n ) ，也是一个大的亚家族，在人体中，至今已发现有1 3 个序列 高度同源的成员，在动物，植物，及病毒中也都发现了s e r p i nb 亚家族的成员。不象卵清蛋 白本身，大多数s e r p i n b 蛋白在细胞内产生作用，定位于细胞质或细胞质和细胞核之中。 1 1 4b o w m a n - bir k 亚家族 b o w m a n b i r k 死家族是丝氨酸蛋白酶抑制剂的另一个主要类型，目前已从多种植物种 子中分离纯化得到b b i ( b o w m a n b i r ki n h i b i t o r ) 。从进化的角度讲，b o w m a n - b i r k 起源于 k u n i t z ，并将取代之。 1 1 4 1b o w m a n - b ir k 型胰蛋白酶抑制剂的分子结构和活动中心 b b i 是由7 1 个氨基酸所组成的单肽链，包含7 个二硫键。在二硫键与分子内氢键作脂下 形成两个对称的三轮列区( t r i c y c l i cd o m a i n ) ，每个区中都有相当规范的结合环。第个结合环中 都有一个独立的与丝氨酸蛋白酶相互作用的活性点，因此被称为双头( d o u b l e h e a d e d ) 抑制剂。 结合环由9 个氨基酸残基构成，其中位于环口处的两个半胱氨酸残基侧向形成二硫键( 图1 2 ) 3 东北农业大学农学硕上学位论文 z 琵霞 秽一6 p 1 1斤齐， p 1 4 4 环 一吨h 图l - 2b b l 分子结构 f i g 1 - 2t h em o l e c u l es t r u c t u r eo fb b i 结合环中的p l 位氨基酸残基的类型决定了该结合环可以抑制何种类型的丝氨酸蛋白酶， 研究发现胰蛋白酶抑制剂p 1 氨基酸残基多是赖氨酸或精氨酸：胰凝乳蛋白酶抑制剂p 1 氨基 酸残基多是亮氨酸或苯丙氨酸：而弹性蛋白酶抑制剂p 1 氨基酸残基则多为丙氨酸。当b b i 的活性环中赖氨酸被亮氨酸取代后，便失去对胰蛋白酶的抑制作用而抑制胰凝乳蛋白酶。b b i 的活性环中p 2 位的丝氨酸与p 3 位的脯氨酸是高度保守，这表明这两个氨基酸残基对予维持 结合环甚至抑制荆结构和功能是必需的。近来研究发现b b i 中的两个结合环存在差异。i 环 可抑制胰蚩白酶，l 可抑制胰凝乳蛋白酶。故b b i 可形成与胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶1 ：1 结 合或与两种酶同时结合的复合物。大豆b b i 经胃蛋白酶处理后可得到两个肽段，其中较长的 肽段含有赖氨酸一丝氨酸肽键，保留了8 4 的胰蛋白酶的抑制活力，较短的肽段含有亮氨酸 一丝氨酸肽键，保留有1 6 抗胰凝乳酶的活力。m c b r i d e 等根据b b i 的氨基酸序列，人j ：合 成了由1 1 个氨基酸残基构成的环状多肽，该环状多肽与天然的b b i 活性位点中的环有极相 似的构象与生物学活性。该环状多肽的构象受到共价键、分子内氢键及顺、反式脯氨酸的共 同影响，通过相邻的1 3 折叠片层形成1 3 发夹结构而变得十分稳定( 图1 3 ) 。 4 p t e i i a a n e 4 2b b i 的作用机制 图1 3b b i 结构 f i gl 一3s t r u c t u r eo f b b i s y n t h e t i c m r l il n h l b i t o r 大豆中的胰蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，它可以和胰腺分泌的丝氨酸蛋白酶 系发生反应。胰蛋白酶抑制剂与靶酶相互作用，通常如酶与底物之间的相互作用样，属于 互补型作用机理。两者反应时，抑制荆暴露在外的活动中心与靶酶的活动中心通过氢键相连 接，形成稳定的共价型复合物，从而导致酶活动中心的闭锁，使靶酶的话性丧失。与通常的 酶催化反应相比，蛋白酶与抑制剂之间反应的米氏常数很低，放蛋白酶与抑制剂的亲和力人。 二者可以迅速结合形成复合物。与一般酶的底物不同，抑制剂与酶结台后其活动中心的肚链 并不裂解或裂解速度极慢。因此，该复合物虽然可以分解成游离的酶和变性或未变性的抑制 剂，但解离速度非常缓慢，b b i 与靶蛋白酶结合作片j 机制如下： e + i 告c 警e + i 其中e 为靶蛋白酶，1 为b b i ，c 为蛋白酶一抑制剂复合物i 为水艇后被修饰的抑制 剂，k o n 和k o n * 为结合常数，k o f f 带lk o 俨为解离常数。 东北农业火学农学硕+ ：学位论文 1 2 植物蛋白酶抑制剂的分布 1 - 2 目前已从五十余种植物材料中分离得剑蛋白酶抑制剂，其中以植物种子含量最多。见表 表1 - 2 植物蛋白酶抑制剂的分布 t a b 如、卜2d i s t r i b u t i o no ft r y p s i ni n h i b i t o ri np l a n t j 。7 ：， 1 3 蛋白酶抑制剂的作用机理 蛋白酶抑制剂与靶酶的结合作用方式可分为三类： 第一类包括绝大多数丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制剂中的活性中心环深入到靶酶的催化位 点，以类似底物或产物的方式结合。活性中心与催化位点的结合力相当强。为防i 卜两者脱离， 抑制剂的活性中心基团与酶的活性基团要形成盐键、氢键而封闭活性中心( 图卜4 ) 第二类包括巯基蛋白酶抑制剂，抑制剂分子与活性中心附近的区域相结合，在空间上占 据了本应属丁底物分子的区域，阻碍了底物分子向活性中心靠近，从而阻止靶酶的活性中心 与底物的接触( 图卜5 ) 第三类，抑制剂的分子不占据靶酶的识别位点，而是与酶分子并列相伴，并在与酶的活 性基团形成氢键同时封锁酶与底物的结合部位。凝血酶抑制剂( 水蛭素h i r u d i n ) 即属丁这种 形式( 图卜6 ) 6 弓l 言 c 图卜4 丝氨酸蛋白酶抑制剂与酶结合的空间模型 f ig 1 4s p a c em o d e lo fs e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o ra n de n z y m ec o m b i n a t i o n 图卜5 巯基蛋自酶抑制剂与酶结合的空间模翟 f i g 1 5s p a c em o d e lo fc y s t e i n ep r o t e i n a s ei n h i b i t o ra n de n z y m ec o m b i n a t i o n 7 东北农业人学农学硕一l 学位论文 图卜6 水蛭素与凝血酶结合的空间模型 f i g 卜6s p a c em o d e lo fh i r u d i na n dt h r o m b i nc o m b i n a t i o n 1 4 植物蛋白酶抑制剂的三大生理功能 1 4 1 内源性蛋白酶调节因子 蛋向酶抑制剂作为蛋白水解酶活性的调：符因子，在种子发育及萌发过程中调：肖蛋白酶的 活性，阻止对种子或幼苗不利的各种不良蛋白水解反应。一个在趣的现象是：种子中的蛋白 酶抑制剂兼备q 淀粉酶抑制剂的功能，这种抑制剂称为双功能抑制剂( b i f u n c t i o n a li n h i b i t o r s ) 。 在种子成熟过程中，蛋白酶抑制活力与a 淀粉酶抑制活力是平行关系。它们主要是保护禾谷 类种子免受内源性水解酶的攻击，当其行使a 淀粉酶抑制剂功能时可以参与调1 y 内源q 淀 粉酶活性：而行使蛋向酶抑制剂功能时，对建立的胚乳贮藏蛋白氨基酸库的平衡是有用的。 舣功能抑制剂现象表明，蛋白酶抑制剂和淀粉酶抑制剂很可能起源丁同- t - t 先，在种子发育 和葫发过程中行使相似的功能。一般的假说认为，它们主要是保护禾谷类种子免受内源水解 酶的攻击，行使q 淀粉酶抑制剂功能时可以参与调节内源a 淀粉酶活性：当行使蛋白酶抑 制剂功能时，对建立胚乳贮藏蛋白氨基酸库的平衡是有用的。蛋白酶抑制剂作为蛋白质的一 种特殊类群，它们与蛋白酶共存于植物组织，两者之间相互作用，相互制约，在自然条件下 达成动态平衡，从而起到调。1 ，蛋白酶活性、制约蛋白质代谢的作用，阻j 卜植物止常发育过程 中不良的蛋白水解反应。 8 引言 1 4 2 抵抗病虫害和病原体侵染 早在二# 个多世纪以前，人们就观察到了植物蛋向酶抑制剂的抗虫作用。五十代初，l i k p e 等首先观察到大豆浸提物能够使杂拟谷盗( t r i b o t i u m c o n f u s u m ) 生长缓慢，发育不良。同时还 检测剑人豆浸提物对杂拟谷盗幼虫蛋白酶有抑制作用。后来，b i r k 等也发现人豆浸提物能抑 制赤拟谷盗( t r i b o l i u mc a s t e n e u m ) 幼虫的生长。b r o a d w a y 和d u f f e y 的研究表明，大豆胰蛋白 酶抑制剂s t i ( s o y b e a nt r y p s i ni n h i b i t o r ) ，以及马铃薯蛋白酶抑制剂p i 2 ( p o t a t oi n h i b i t o rt o ) ，分 别在0 18 l 和o o s g r l 的浓度下，就能抑制美洲棉铃虫( h e l i c o v r e p a z e a ) 和甜菜夜蛾( s p o d o p e r a e x i g u a ) 幼虫肠道的绝大部分胰蛋白酶的活性。当饲喂含有这两种抑制剂的人j f 饲料时，幼虫 的取食量明显下降，表现出营养不良、虫体变轻、幼虫生长期增长等现象。如b b i 家族对丁 许多往农业生产上造成重人经济损失的害虫都具有抗性，其中包括玉米螟( c h i l op a r t e l l u s ) ， 蝗虫( l o c u s t am i g r a t o r i a ) ，棉铃虫( h e l i o t h i sa r m i g e r a ) 、杂拟谷盗( t r i b o l i u mc o m f u s u m ) 等。巯 基蛋白酶抑制剂对赤拟谷盗( t r i b o l i u mc a s t a n e u m ) 、大谷盗( t e n e b r o i d e sm a u r i t a n i c u s ) 、米象 ( s i t op h i l u s o r y z c c e ) 等谷仓害虫的蛋白消化酶具有明显的抑制作用。另外当植物受害虫和病原 体的侵染时，植物细胞会产生超敏反应，使细胞代谢发生改变，诱导产生多种病原体相关蛋 白，其中包括蛋白酶抑制剂。当蛋白酶抑制剂被昆虫摄食并在体内积累时，它与昆虫消化道 中的蛋白酶作霹；形成酶一抑制剂复合物( e d ，将显著降低昆虫肠道内蛋白水解酶的活性，影 响食物中蛋白的正常消化和许多酶原的激活，同时刺激消化酶的过量合成和分泌，扰乱昆虫 正常代谢，最终导致昆虫死亡。王琛柱等研究了大豆胰蛋白酶抑制剂对棉铃虫幼虫消化生和 生长发育的影响，表明蛋白酶抑制剂对昆虫抗营养效应在于它对蛋白酶的激活和抑制作用， 从而导致各种蛋白酶间的协调性破坏，昆虫消化过程受阻。大豆胰蛋白酶抑制剂与棉酚或丹 宁混用对棉铃虫中肠蛋白酶和生长率的影响，表明大豆胰蛋白酶抑制剂与棉酚或丹宁的协同 作用比三者的单独作用更能有效的抑制幼虫的生长发育和中肠蛋白酶活性，进一步阐明了蛋 白酶抑制剂与一些抗虫次生性物质之间存在的增效作用。 1 4 3 植物贮藏蛋白 植物种子和营养器官如块茎中均已报道有大量蛋白酶抑制剂存在，含量可达总蛋白质的 1 0 1 0 。蛋白酶抑制剂与种子贮藏蛋白一样主要在种子发育过程中合成并积累，含贮藏蛋 白较多的豆类植物成熟种子中，蛋白酶抑制剂的含量也相当高。蛋白酶抑制剂一般在贮藏蟹 白之前开始合成，种子成熟时，其抑制制水平也达到最高含量。另一方面，种子萌发时，蛋 向酶抑制剂开始逐步被降解，含量也逐步减少。参与蛋白酶抑制剂降解的酶，主要是巯基蛋 白酶，如大豆种子的蛋白酶k 1 ，这些蛋白水解酶在种子萌发后开始表现活性，并在萌发过程 中逐渐增强。种子储藏蛋白的特征之一就是含有较高比例的天冬氨酸、谷氨酸，而种子蛋白 酶抑制剂也是如此。在花生蛋白酶抑制剂中天冬氨酸与谷氨酸的含量分别为1 1 8 的8 6 ， 在菜豆蛋白酶抑制剂中天冬氨酸与谷氨酸含量分别为1 4 和8 8 ，远高丁抑制剂中其它氨基 9 东北农业人学农学硕l ：学位论文 酸的平均水平。蛋白酶抑制剂在种子内的分布场所也表明它们具有贮藏蛋白的特征。水稻、 大麦、稗草等种子的胚萌发后，幼芽和根尖均有大量蛋白酶抑制剂并很快下降，暗示着蚩白 酶抑制剂可以在分生组织中合成并很快被降解，为幼苗的生长和发育所利用。比较胰凝乳蛋 向酶抑制剂在马铃薯不同发育时期在各组织中的相对含量发现，该抑制剂是一种储藏蛋白， 它在块苇发芽时急剧减少。此后，该抑制剂义在叶片和苇中合成、积累，直剑块芩的形成， 这时植株地上部分的抑制剂开始减少，并开始在块苇中犬锗出现。这种抑制剂和其他一些丝 氨酸蛋白酶抑制剂也出现在马铃薯和乔茄的脱落n i ，的液泡中，以蛋白体的形式积累。同样， 蛋白酶抑制剂在烟草愈伤组织培养中人量积累，但当愈伤组织转入新培养基时又减少，这表 明这些抑制剂作为储藏蛋白在新愈伤组织的形成和生长中被利崩和降鳃。一般认为休眠时期 的种子中蛋白酶被抑制以保证贮藏物质不被浪费，而在萌发时蛋白酶抑制剂开始卜降，蛋白 酶开始恢复活性。莴苣、小麦、人麦、水稻、火豆、黑麦及豌豆种子中的蛋向酶抑制与蛋白 酶存在这种浓度上的相关性，但这种相关性在其他一些物种中并不存在，所以蛋白酶抑制剂 与蛋白水解酶的相互作用并不是抑制蛋白水解酶的唯一因素。同时蛋向酶抑制剂的降解，能 够为幼苗的生长提供氮源和碳骨架。在块茎中存在蛋白酶抑制剂，可能与它们是人类和牲眚 的食物相关。 1 5b bi 在医药领域的应用 1 5 1b b i 的抗癌活性 研究发现素食者中乳腺癌、结肠癌和前列腺癌的发病率均较低，流行病学调奁发现种籽 类食品( 如豆类、玉米谷物) 对这些癌症的发生具有防御作用。y a v e l o w 等曾选择种籽中的蛋白 酶抑制剂进行研究，发现无论在体内还是体外，它均显示抑癌活性。其中一种典型的大然蛋 白酶抑制剂就是从大豆中分离出的b b i ，据推测，b b i 蛋白酶抑制剂家族在植物中的作用类 似a 1 抗胰蛋白酶在人体中的作用，两者都具有高度的抗癌活性，在对各自机体防护中发挥 重要的作用。在b b i 浓缩制剂( b b ic o n c e n t r a t e ，b b i c ) 帝ib b i 纯化制剂( p u r i f i e db b i ，p b b i ) 抑 癌活性的动物试验中，发现b b i 的抑癌作用具有如下特点：点：可抑制由多种物理或化学 致癌因素引发的肿瘤；在二种动物种属( 小鼠、人鼠和地鼠) 中均有效；可作用于不同的 组织器官 结肠、肝脏、肺、食道，以及颊囊( 口腔上皮) 】；通过不同途径( 包括腹腔。卜注 射、静脉注射、局部给药、以及膳食摄入) 给药均有效；可抑制多种类型的肿瘤( 鳞状细胞癌、 腺癌、血管肉瘤等) ；涉及不同类型的细胞，包括上皮细胞( 结肠、肝脏、肺、食道和颊囊) 以 及结缔组织细胞( 如纤维母细胞，其在体外和肝脏中均有效) 。虽然b b i 作为抗癌冈子的作州 机制还不清楚，但现己证实蛋白酶抑制剂能够往肿瘤形成的初始阶段逆转其发展过科，这可 能是通过阻断了因接触致癌因素而启动的某个过程来实现的。另外，b b i 还能影响某些癌基 因的表达( 如c m y c 和c f o s 等) 、某些蛋白水解反应的活性( 在暴露于诱癌剂的组织中这种 反应的活性有所提高) 及降低诱癌因素引起的基因表达。 l o 引言 目前，对b b i 作为抗癌制剂的研究已进入到临床试验阶段。一项在1 9 名良性前列腺增 生( b e n i g np r o s t a t i ch y p e r p l a s i a ，b p h ) 伴下尿道综合征的男性患者中开展的b b i c 临床i 期 试验显示，b b i c 不存在毒性剂量限制，在所有接受b b i c 治疗的患者中血浆前列腺特异 性抗原( p m s t a t i c 2 s p e c i f i ca n t i g e np s a ) 的水平都有明显下降。一些患者的下降幅度其至达到 4 3 。此外，血清甘油三酯的水平和前列腺容量都有明显下降，问卷调查显示患者的尿道功 能也有所改进。 a r m s t r o n g 等在另一临床i 期试验中，给予2 4 名口腔白斑患者2 5 8 0 0 糜蛋白酶抑制 单位( c h y m o t r y p s i ni n h i b i t i o nu n i t ，c i u ) 的b b i c 后，发现2 4 4 8h 内即可检测到其在尿中 的代谢产物，说明b b i 能够被人体快速吸收。当口服剂量达到8 0 0 c i u 时，机体仍能很好地 耐受，且无毒性反应w a n 等将人类前列腺癌转移病灶细胞( l n c a p 细胞) 植入无胸腺的 n c r n u 2 m 裸鼠前列腺腺体内，造出人类前列腺癌异体移植的模型，再喂饲实验动物空白膳 食和加入含1 b b i 或l 、2 、3 b b i c 的膳食6w ，结果显示b b i 或b b i c 可减少 肿瘤细胞的最终着床率，延长肿瘤细胞的复制时间，且降低前列腺癌荷瘤裸鼠体内的p s a 浓度，表明b b i b b i c 可用于前列腺癌的治疗。另有实验证实p b b i 和b b i c 能够降低二甲 肼( d i m e t h y l h y d r a z i n e ，d m h ) 导致的大鼠结肠癌的发生率，且未观察到p b b i 或b b i c 对 动物生长有任何毒副作用，这提示p b b i 和b b i c 也可用于结肠癌的预防且不会带来副作用。 b b i 可增强顺铂( 抗癌药物) 及辐射对肿瘤细胞的杀伤力，而对正常细胞又具有选择性 辐射保护的特性。因而可使用b b i 作为癌症放