（光学工程专业论文）基于一级傅立叶级数相调制法的纳秒级荧光寿命测量.pdf

中文摘要 摘要： 针对纳秒量级荧光寿命的测量，提出一种改进的相调制法，提取周期性激发 信号和相应的发射波形信号傅立叶级数中的一级项，按照相位法测量荧光寿命的 原理求得荧光寿命t 值。 据此设计测量系统，用以在硬件层面上验证改进的相位的法的有效性，为测 量系统的实用化打好基础。系统主要由激发光源、光谱仪、数字示波器三部分组 成。激发光源受高频周期性电信号调制，激励样品发光，用光谱仪完成波长的选 择，由光电倍增管( p m t ) 将光信号转换为电信号得到激发光和发射光的光强 随时间周期性变化的发光波形，利用数字示波器完成模拟信号和数字信号的转换 ( a d 转换) ，最后利用v b 程序进行数据处理求得t 值。 本文为此设计了一种快速有效、低成本的新型激发光源，采用晶体振荡器为 信号源，三极管为受控高频开关，调制发光二极管产生激发光。光源波长可以从 9 4 0 n m 改变至u 3 8 0 n m ( 离散) ，可以被1 0 m h z 到5 0 m h z 的高频周期信号调制( 离散) 。 本文还对频率的选择、信号的传输、光电倍增管输出信号的电流电压转换、 示波器的数据采集等问题进行了分析，发现1 0 m h z 到5 0 m h z 是最佳频率范围。在 此情况下，器件的选择、信号线连接方式以及系统各部分的最佳整合都对有效测 量十分重要。 实例测量甲苯酚紫乙醇溶液( o 0 0 3 3 m o l l ) 的t 值为4 0 3 o 8 7f i t s ，与德国 p i c o q u a n t 公司t c p s c 仪器测量结果4 2 4n s 相当。 关键词：荧光寿命；傅立叶级数；相调制法；发光二级管；晶体振荡器 分类号：t n 2 4 7 ；t n 2 9 ：t h 7 4 4 1 a b s t r a c t a b s t r a c t ：an e wm e t h o df o rm e a s u r i n gn a n o s e c o n df l u o r e s c e n c el i f e t i m ei s i n t r o d u c e di nt h i sp a p e r t h em e t h o di sb a s e do i lp h a s e - d e m o d u l a t i o nt e c h n i q u ea n dt h e f i r s th a r m o n i e si n 山ef o u r i e rs e r i e so f b o t ht h ee x e i t a t i o na n dt h ee m i s s i o nw a v e f o i t i i $ a s i m p l et e s ts y s t e m , c o m p o s e do f 孤o s c i l l o s c o p e 1 i ts p e c t r o s c o p ea n dl l ne x c i t a t i o n l i g h ts o u i c e , w 勰d e s i g n e dt oa n dp r o v e dt h em e t h o di sa v a i l a b l e t h ee x c i t a t i o nl i f l l t 愀i sm o d u l a t e db yah i 曲f r e q u e n c ye l e c t r i c a ls i g n a lo f f e r e db yac r y s t a lo s c i l l a t o r , w h i c hi sf o c u s e do nas a m p l e 1 1 l es p e e 劬o ft h ee m i s s i o nl i g h to fs a m p l ea n dt h e e x c i t a t i o nl i g h tm d e t e c t e db ys p e e t l r o s e o p e , a n dt h e nt h el i g h ts i g n a li sc o n v c t t o dt o e l e c t r i c a ls i g n a lb yp m t 1 1 ”w a v e f o r m so ft h ce x c i t a t i o na n dt h ee m i s s i o na b o t l l a n a l o gs i g n a l sb u tc o n v e r t e di n t od i g i t a ls i g n a l sb yao s c i l l o g r a p h , w h i c hl l s m i t st h e d a t at oac o m p u t e r a tl a s t , t h ec o m p u t e rc a nd e a lw i t l at h ed a t at oo b t a i nt h e f l u o r e s c e n c el i f e t i m e a t y p eo f h i g h f r e q u e n c ym o d u l a t e dl i g h ts o u r c ed e v i c ei si n v e n t e da taa c c e p t a b l ec o s t 1 1 l ch i 曲一f r e q u e n c yv a r i e si o m h zt o5 0 m 1 z , 越w e l l 勰t h ew a v e l e n g t ho fl i g h t c h a n g e sf r o m9 4 0 h mt o3 8 0 n t o f u l t h c r m o r e , a l ln e c e s s a r yd e t a i l sw e d i s c u s s e d i n c l u d i n gt h es u i t a b l ef r e q u e n c y c o v e r a g e ( 1 0 - 5 0 m h z ) ，t h es i g n a lt r a n s m i s s i o n , t h ei nc o n v e c t i o n , t h ea dc o n v e c t i o n , t h ec o n n e c t i o no f p m ta n do s c i l l o g r a p h , e t e 1 1 l er e s u l to fm e a s u r i n gt h ef l u o r e s c e n c el i f e t i m co ft h ee r c s y lv i o l e te t h a n o ls o l u t i o n ( 0 0 0 3 3 m o l l ) i sa v a i l a b l e ( 4 0 3 0 8 7 地) c o m p a r e dw i t har e s u l to f at c p s c e q u i p m e n t ( 4 2 4n s ) k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n c el i f e t i m e ；f o u r i e rs e r i e s ；p h a s e - d e m o d u l a t i m c a s t t r c m c n t ； l i g h te m i t t i n gd i o d e ；c r y s t a lo s e i u a t o r c i a s s n 0 ：t n 2 4 7 ：t n 2 9 ：1 1 7 4 4 1 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解北京交通大学有关保留、使用学位论文的规定。特 授权北京交通大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年月日签字日期：年月日 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研 究成果除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得北京交通大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字e t 期：年月日 致谢 本论文的工作是在我的导师黄世华教授的悉心指导下完成的，黄世华教授严 谨的治学态度、独到的见解、科学的工作方法给了我极大的帮助和影响，在人生 态度的问题上也给予了谆谆教诲。在此衷心感谢三年来黄世华老师对我的关心和 指导。 由芳田老师、梁春军老师在学习和科研工作上给予了我很多的关心和帮助， 光信息科学与技术研究所的吴重庆老师对于我的科研工作提出了宝贵的意见。侯 延冰老师、姚志刚老师，以及理学院的赵中龄老师、陈世谦老师和电信学院的钱 满义老师对我论文中的研究工作给予了热情帮助，在此表示衷心的感谢。 在实验室工作及撰写论文期间，邓召儒、尚超、陈多佳同学对我的研究工作 给予了热情的帮助，黄金昭、唐爱伟、石志刚同学对于我的科研工作提出了许多 的宝贵意见，在此表示衷心的感谢。 最后要特别感谢我的家人和朋友们，你们永远是我的骄傲! 1 引言 1 1 什么是荧光寿命 基态电子被激发到高能态后，会通过辐射 s 跃迁或者非辐射跃迁释放能量回到基态。 在单分子模型中，跃迁速度，即高能态的 电子数量减少的速度，正比于该时刻高能态的 s 电子数量，得到微分方程如下： 圈1 电子的激发与跃迁 掣：一州( f ) ，口0 ( 1 1 ) a t 求其解为( f ) = n ( o ) e - “，令口= l f ，则有 ，( f ) = ( o ) 一7 产生的瞬时光 强，( f ) 是单位时间内产生的能量，j 下比于一 m d ( f ) 缸= h a ，a n ( t ) 。因此，荧光发 射的荧光光强随时间变化的波形具有如下数学表达式： l ( t ) = ，( o ) e 1 “ ( 1 2 ) 当t 2 f 时，荧光强度衰减到初始强度的1 ，e ，这个时间，就是该荧光物种在测 定条件下的荧光寿命，也称作能级寿命。仅当荧光强度按照指数规律衰减时，荧 光寿命才有确切的含义【i 】。 在单分子模型中，电子在高能级的停留时间t 可取( o ，m ) 区间内的任意值，其 概率密度贝f ) 正比t 时刻于高能态上的电子个数： 厂( f ) z ( f ) = ( o ) f ，( f p ：l 1 3 由此。可解得单电子停留时间的概率密度，( f ) = 二p 一咖，其统计平均值为： ；= f f ( t ) t d t = f e - , t d t = f ( 1 4 ) 所以r 值也是电子在激发态的统计平均停留时间。 进行发光材料的研究，需要了解发光中心的跃迁性质。发光中心间的相互作 用，外场对发光中心的作用，以及发光中心与材料中杂质和缺陷的相互作用等等， 都可能影响发光中心的跃迁性质，因此荧光寿命的测量是研究这些相互作用的重 要手段。另外，许多复杂的分子问作用过程，例如超分子体系中分子间的簇集、 蛋白质高级结构的变化等，都可能反映在跃迁过程中。所以荧光寿命的测量不仅 是发光材料研究，也是化学、生物等领域研究所需要的一种重要实验手段 1 2荧光寿命测量的现有技术及工作目标 根据材料的不同，以及跃迁过程的不同，r 值覆盖从飞秒( f s ，1 0 。1 5 s ) 到毫 秒( m s ，1 0 3 s ) 甚至更长的范围。微秒、毫秒级的寿命，技术上已经十分成熟。 较为困难的，是纳秒、皮秒、飞秒量级的寿命测量。 针对纳秒到皮秒量级荧光寿命的测量手段： 1 时问相关单光子计数法( t i m e - c o r r e l a t e ds i n g l e - p h o t o nc o u n t i n g , t c s p c ) ， 可以测到数十p s ： 2 频闪技术( s t r o b et e c h n i q u e s ) ，即取样法； 3 相调制法( p h a s em o d u l a t i o nm e t h o d s ) ，难以测到璐以上； 针对皮秒到飞秒量级荧光寿命的测量手段： 1 条纹相机法( s t r e a kc a m e r a s ) ，最高到数百臼； 2 上转换法( u p c o n v e r s i o nm e t h o d s ) ； 允许跃迁的荧光寿命通常为i i s 量级。针对n s 量级的方法，如时间相关单光子 计数法大都需要结构复杂、造价昂贵的仪器。而很多情况下我们不需要像t c s p c 那样全能的仪器，在方法、器件上适当的改进，就可以开发出小型化、高性价比 的仪器，在一定范围和条件下达到需要的精度要求。 在我们过去的工作中，设想了一种改进的相调制法，即在相调制法的基础上， 提取周期信号傅立叶级数中的一级项进行相调制法的数学处理，有效降低了测量 系统的实现难度，大大减小了噪声的影响，并在软件模拟中得到了很好的效果。 作者的工作，就是要据此开发相关硬件设备，探索新测量原理的可行性，并 力争仪器的实用化，使之能真正应用于发光材料的研究工作中。 该方法需要的仪器主要是荧光光谱仪和数字示波器，是实验室的常备仪器。 采用l e d 作为激发光源成本也较低，并且易于调制。总体来看。该系统的开发难 度小，有望在硬件上得以实现。目前，测量纳秒量级荧光寿命的仪器依赖进口， 而我们组一直在做荧光寿命测量的工作，已经积累了一些经验。因此，这是一件 非常有实用价值，同时具有可行性的、值得尝试的工作。 2 2 基于一级傅立叶级数的相调制法 2 1相调制法测量原理 单指数衰减的相调制法原理如图2 所示。用角频率为m 的j 下弦调制激发光目力， 激发被测样品。设样品的荧光寿命为r ，稳态下激发光觑f ) 和样品的发射光“f ) 可 分别表示为： e ( f ) * l + m s i n ( 叫) ，一lc m c i ( 2 1 ) ，( f ) 。l + 【m ( 1 + 1 0 2 r 2 ) 1 2 】s 缸( 耐一，) ，户a r a a a ( 国f ) ( 2 2 ) 与耳f ) 相比，( f ) 有相同的频率。，但相位滞后了妒。根据相调制法原理，测 得两波形的相位角或调制度之比，就能得到荧光寿命r 值 2 1 ，如式2 3 所示。 f = t a n m( 2 3 ) 01 mm m o e m 田2 相调制法原理图 2 2激发频率的选择 相调制法的出现较早，是比较成熟的测量方法，已经应用于微秒和毫秒级的 荧光寿命测量中。但在纳秒级的测量中却有许多难题，主要集中于以下三个方面： 1 缺少稳定、严格正弦的激发光源； 2 信噪比低：噪声、电磁干扰、电流信号转换效率低等原因，造成不能对光 强信号进行稳定有效的测量； 3 器件响应速度不够( p m r 、示波器) 。 造成这些问题的原因，主要是激发频率的较高造成的。不同的时间范围的荧 光寿命需要不同的激发频率，纳秒量级荧光寿命测量需要的频率一般大于1 0 m h z ， 从而带来了系列的问题。 由式( 2 3 ) 可知，r 和相移矿的关系并非线性。激发频率太低会造成rm 接近零 值，从而毋也接近零，耳f ) 和足力波形重叠在一起，极易造成误差。设r = 1 0 n s ，采 用正弦波激发，重复频率i k h z ，则t a n 驴= r - 2 x 1 0 ，因此毋2 1 0 一， 相移角度仅有0 0 0 3 6 。，难以准确测量。若激发频率提高为i m h z ，则有t a n 毋= 2 1 酽，从而妒一2 丌1 0 2 = 3 6 。由此可见，适当提高激发频率能显著提高 系统的分辨率。 而当厂过高，会使得妒一丌1 2 时，t a n 咖一一，斜率非常大，因此测量庐时极 微小的误差都会引起t a n 矿极大的改变。所以频率过高会放大原始误差，也使系 统不稳定。 设相位角的读数误差为4 办为保证荧光寿命的误差小于r ，毋应该限制在一 定的范围之内： 了a r = 丽a # 2 a 一# s i n 2 # ( 2 4 “1 了一忑丐面一一“ u 整理后得到矿的取值范围： ! 。咖三竺。 ! f 石一戤血2 a _ _ t 1 ( 2 5 ) 2 2 j 。7 由式2 3 ，可以推出。的合理取值范围，并可知u 的取值与r 成反比，待测的 r 短，则u 越高。例如，若a 毋= l 。，如果要求f 为5 ，妒则应保持在2 2 。 6 8 。之间。如果要求准确度为l o ，毋的范围则可能扩大到1 0 。8 0 。对于1 0 t s 的寿命，相应的口范围为2 8 k h z 9 0 k h z ，对于i o n s 的寿命，相应的。范围则是 2 8 删z 9 0 删z 。而对于i n s 的寿命，相应的u 范围则高达2 8 删z 9 0 0 m t t z 。从我 们的目的而言，选择5 0 删z 左右的激发频率是可行的。 电磁波根据其频率范围，被划分为中波、短波的波段范围，各有其应用。如 表l 所示。可见，要进行a s 量级的r 值测量，m 的取值范围主要覆盖了中波和短 波的频段。属于无线电应用的范围。由此，电路中屏蔽不良的导线会像天线一样 将电磁波发射到空间中，同时也接受空间中的电磁波。所以干扰和噪声的问题比 较严重。在此频段，普通l c 、r c 振荡电路难以稳定有效的工作，从而导致缺少 稳定、有效的激发光源。此外，由于p m t 只能通过5 0 q 的电阻将电流信号转换为 电压信号，转换比率太低。造成信噪比小，难以锝到有效的数据。 至于器件的响应速度问题，p m t 的璐量级的响应速度和高增益使之成为光电 探测器件中优选的器件。示波器则随着电子技术的高速发展而不断出现新的高带 宽示波器，试验室现有的t d s 5 4 0 d 带宽5 0 0 m h z ，已经基本能满足要求。 总之，相调制法在纳秒级荧光寿命测量中的瓶颈，是由较高的激发频率造成 的两大问题：缺少稳定有效的激发光源；信号太弱，信噪比过低，提取不到 有用信息。 表1 电波划分频段及其应用 电波名称波长起始点频率起始点主要用途 超长波 一3 呲 长波( l f )列车和海上无线通讯 一】加婿h 中波( m f )a m ，“播船舶无线通讯 一3 舭 短波( h f )航空和船舶无线通讯 i 眦一如眦 超短波( f ) 电视转播，f mj “播，业余爱好者无线通 l m 一 铀m 月i 易 讯无线传呼 极短波( i j l - 1 f )电视传播，移动电话，车载电话 1 s e r e 一3 g 微波( s h f )卫星转播，卫尼通讯，雷达 l f m 一3 0 l - k 毫米波( e h f )短距离无线通讯( 卫星) 一加0 6 咆 亚毫米波 2 3 基于一级傅立叶级数的相调制法 针对相调制法在纳秒级灵光寿命测量中的难恿，我们组曾提出了- 一种改进的 相位法，可以用任意波形的周期性光耳f ) = 耳t + t ) 作为激发光测量荧光寿命。把 周期为t 的周期函数以f ) 在 - t 2 ，t 2 i - _ 展为傅立叶级数： 厶 刖。詈+ r 薹= l a n 州删+ 8 缸删刀 ( 2 6 ) 2 詈1 + ，i = 至ja n s i g n e tw 刀 其中，：2 扛：+ k ，甲。：。t a n ( ) 。 样品发光曲线，( f ) 正比于激发光耳f ) 和单指数衰减函数e q 7 的卷积， ，( f ) j 二p o 叫，f e ( t ) d t ( 2 7 ) 将( 2 3 ) 代入( 2 4 ) ，整理后得到： 7 0 ) 1 + ，蓦g 缸，删+ 甲 一九) ( 2 8 ) 其中咖。砌n ( ”f ) ，是觑f ) 和聃的n 次谐波问的相位差； s = 1 ( 1 稚舻a 1 勺。由此可得： r = t 龃九 聊 0 ，此为饱和的短路状态。 此时l e d 工作电流l c 由电源提供，流过限流电阻r 的电流i e = i b + i c ，并且由 晶振提供的i b 是不能忽略的，如果用公式i c t ( u b e v b o r 估算l e d 工作电流， 结果会偏大。此外，p n p 型三极管是v f 0 v 时导通，低电平有效，有文献指出p n p 型三极管的功率驱动性能更好。但如图1 5 ( c ) 所示，p n p 型的b 极电流方向是指向 晶振的，这可能会造成某些型号的晶振不能很好的工作。 表3n p n p n p 型昌体管工作状态列表 电路符号饱和放大截止电流流向 n p n j c u b e o u b e o , u b e 0u b c 0u b c 0 p n p j c 型 b l u b e ( 0 u b e 0 i 产 ， ic 。 1 a-7 | 7 7 ， 分忻r 1 1 + 仰) v _ |，i l，一 v r + v ( - ) “凶+ v d i c 曲线 工作 v c e ( b ) l e d 工作点 田1 4 三极管驱动电路工作状态分析 l e d 两端的驱动电压信号要作为光信号检测时的参考信号以及示波器的触发 信号，需要对其进行稳定、有效的实时监测。一般性观测可以使用示波器探头， 但一来示波器高频探头售价昂贵( 以泰克公司p 6 2 3 0 a 探头为例，市价为3 0 0 0 元 人民币左右) ，一般台示波器只配置一个探头，不能满足同时测两个以上的信号 的需要。二来探头需要良好接触( 参见4 3 高频信号的观测) ，仅靠人工操作稳定 性不能保证，并会在长时间的测量工作中不必要地占用人力资源。 在此情况下，采用高频信号传输所用的缓冲放大器( 也称为电压跟随器) ，对 驱动电压进行监测。缓冲放大器具有极高的输入电阻( 1 0 s m q 量级) ，对原电路影 响小，同时有5 0 q 的输出电阻，与同轴电缆的特性阻抗相匹配( 参见3 5 高频信 号的传输) ，能不失真地将输入端的电压信号以2 ：l 的比例传输至示波器显示。 缓冲放大器芯片的选择应注意以下几方面： 1 带宽高于5 0 0 m h z ( 参见2 4 方波周期信号的激发) ； 2 输入输出电压范围合适( 0 - - - 5 v ) ； 3 电源电压范围合适。电源，尤其是高频性能好的线性电源，体积大，成 本高。如果不能和光源其他器件采用同一个电源，就会大大增加光源的 体积和成本。 基于以上考虑，选择m a x 4 2 0 1 ( 3 d b 带宽：7 8 0 m h z ，电源电压：5 v ，可 单电源工作；输入电压2 7 5 v - 4 8 v ；输出电压：4 - 2 1 v ：参见附录b ) 。综上所 述，激发光源的电路原理如图5 所示，实测驱动信号和激发光信号波形如如图1 5 所示。需要说明的是，m a x 4 2 0 1 输出电压范围较窄，发光二级管的负引脚处电压 值的峰值高于2 1 v ，因此将缓冲放大器输入端连接于三极管与限流电阻r 之问， 监测与l e d 两端之间的电压等价的限流电阻r 两端之间的电压。由于受晶体管、 发光二级管等的影响，跟晶振的零负载输出电压波形相比，略有不同。另外，发 光信号由光电倍增管转换为电信号，再通过数字示波器进行a d 转换后得到发光 信号波形因此发光信号原为负值，且强度较弱。为了方便观察，已将其转换为 正值，并与驱动电压以不同坐标值显示 1 6 j e 峦銮亟厶堂亟堂僮垃塞麴壁级蕴当壹佥测量丕统鲤仕途让 3 3单色仪 o mz t h ， 田1 5 驱动电压波形和激发光发光波形 荧光光谱仪主要由起分光作用的单色仪，以及将光信号转换为电信号的光电 倍增管组成。实验室所用的j o b i ny