（化工过程机械专业论文）生物芯片硅基片制备技术研究.pdf

摘要曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼! 曼曼! 曼曼鼍曼皇皇曼皇曼iiiiii ! 曼鼍曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼皇曼皇舅摘要生物传感器和生物芯片的发展需要生物分子和基底之间产生稳定的电流交换。金刚石被发现是一种理想材料，具有优良的性质，如：物理稳定性、化学稳定性、极高的热传导能力和良好的生物兼容性。掺硼的导电金刚石则表现出宽的电势窗和低的背景电流。本文以金刚石薄膜为对象，了解了金刚石薄膜的形成机理及晶体结构，阐述了金刚石的性质；对金刚石表面进行了化学修饰，用化学氧化和水解处理的方法固定了羧基官能团，并通过红外光谱探讨了各种反应条件对固定效果的影响；借助于1 乙烷基一( 3 二甲氨基丙基) 碳二亚胺( e d c ) 在羧基化的金刚石薄膜上直接共价固定了葡萄糖氧化酶，并验证了固定氧化酶的长期稳定性：最后，探讨处理后的金刚石薄膜作为电极应用在生物传感器中的结构。首先用浓h 2 s 0 4 和浓h n 0 3 的混合液将金刚石表面进行氧化处理，其中浓h n 0 3 是氧化酸，浓h 2 s 0 4 是催化剂。氧化后的金刚石薄膜用n a o h 和h c i 进行水解处理。傅立叶变换红外光谱( f t i r ) 和x 射线能谱( s ) 证实了金刚石表面被氧化水解成了羧基。利用o h 的红外光谱吸光度进行对比分析，表明在：h n 0 3 ：h 2 s 0 4 = 1 ：5 、处理时间在2 0 h 、搅拌状况下处理的结果效果最好。对结果进行方差分析，结果显示酸的配比、反应时间和处理方式对试验的效果影响均不显著，表明氧化后的金刚石表面羧基官能团的浓度较低，这可能和金刚石表面的氢的浓度较低、基片产生的氧化有关。其次葡萄糖氧化酶通过e d c 中间媒介直接共价固定在羧基化的金刚石薄膜上。固定后的酶用分光光度法进行验证，以a b t s 作为显色剂，测出了固定的葡萄糖氧化酶的活性为o 0 0 7 u 2 5 m m 2 。表明葡萄糖氧化酶已经被固定在金刚石薄膜上。并验证了固定的葡萄糖氧化酶的长期稳定性。最后固定酶的金刚石薄膜作为生物传感器的电极使用，比传统的以凝胶或聚合物为基底的酶膜电极灵敏度和准确性都高，可以代替传统的酶膜电极应用在生物传感器中，可以用电化学的三电极系统检测葡萄糖浓度。关键词金刚石；生物传感器；化学修饰；葡萄糖氧化酶a b s t r a c ta b s t r a c tt h ed e v e l o p m e n to fb i o s e n s o ra n db i o c h i pw o u l dn e e dt h es t a b l ee l e c t r i c a lc o m m u n i c a t i o nb e t w e e nb i o m o l e c u l ea n ds u b s t r a t e d i a m o n dh a sb e e nr e c o g n i z e da sa ni d e a ls u b s 仃a t ed u et ou n u s u a l l yg o o dp r o p e r t i e ss u c ha sp h y s i c a ls t a b i l i t y ，c h e m i c a li n e r t n e s s ，ah i g ht h e r m a lc o n d u c t i v i t ya n db i o c o m p a t i b i l i t y t h eb o r o nd o p e dd i a m o n df i l le x h i b i t sw i d ep o t e n t i a lw i n d o wa n d l o wb a c k g r o u n dc u r r e n t i nt h ep r e s e n tw o r k ，w es t u d i e da b o u tt h em e c h a n i s mo ft h ef o r m a t i o na n dt h ec r y s t a l l i n es t r u c t u r eo fd i a m o n d ，d e s c r i b e dt h en a t u r eo fd i a m o n d t h es u r f a c eo ft h ed i a m o n dw a sc h e m i c a lm o d i f i e d 、析也o x i d i z a t i o na n dh y d r o l y s i st r e a t m e n t t h ec a r b o x y l i cg r o u pw a sm o d i f i e dt ot h es u r f a c e a n dw ed i s c u s s e dt h ee f f e c to fav a r i e t yo fc o n d i t i o n st h r o u g ht h ei n f r a r e ds p e c t r u m d i r e c tc o v a l e n ti m m o b i l i z e dt h eg l u c o s eo x i d a s eo nc a r b o x y l a t e dd i a m o n df i l m s 、析t he d c a n dv e r i f i e dal o n g - t e r ms t a b i l i t yo ft h ef i x e do x i d a s e f i n a l l y , w ed e t e c t e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec h a n g i n go ft h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o na n dt h ec u r r e n ts 仃e n g t hu s i n gat h r e e e l e c t r o d es y s t e m f i r s t l yt h ed i a m o n df i l mw a sc h e m i c a l l yt r e a t e di nh 2 8 0 4a n dh n 0 3 ，i nw h i c ht h eh n 0 3i st h eo x i d a t e da c i da n dt h eh 2 5 0 4i st h ec a t a l y s ta c i d t h eo x i d i z e dd i a m o n df i l mw a ss u c c e s s i v e l yt r e a t e d 、杭t l ln a o ha n dh c i t h ef t i ra n dx p sr e s u l ts h o w e dt h a tt h ed i a m o n ds u r f a c ew a sm o d i f i e d 、析t 1 1c a r b o x y lt h r o u g ho x i d a t i o na n dh y d r o l y s i s w ea n a l y s e dt h ea b s o r b a n c eo fo hf r o mf t i r , i ti n d i c a t e dt h a tu n d e rt h ec o n d i t i o no fh n 0 3 ：h 2 s 0 4 - - 1 ：5 ，2 0 h ，s t i rs t a t u sm a d et h eb e s te f f e c t t h ev a r i a n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h er a t i oo ft h eh 2 s 0 4a n dh n 0 3 ，t i m ea n dt h et r e a t m e n tm e t h o dw e r en o ts i g n i f i c a n t l ya f f e c tt h ea b s o r b a n c e i tm a yb ea t t r i b u t e dt ot h eo x i d a t i o no ft h ed i a m o n ds u r f a c e ，w h i c hl e a dt ot h ed e c r e a s eo ft h eh y d r o g e n s e c o n d l yt h eg o dw e r ed i r e c t l yc o v a l e n ti m m o b i l i z e dt ot h ec a r b o x y l i cd i a m o n ds u r f a c e i tw a sa s s a y e db ys p e c t r o p h o t o m e t r y w ec h o s et h ea b t sa st h ec h r o m o g e n i cr e a g e n ta n do b t a i n e dt h ea c t i v i t yo ft h eg o di s0 0 0 7 u 2 5 m m z s h o w e dt h a tg l u c o s eo x i d a s eh a sb e e nf i x e do nt h ed i a m o n df i l m t h el o n gt e r ms t a b i l i t yo ft h eg o dw a si n v e s t i g a t e d i i缩略语f i n a l l y , i l l sa l le l e c t r o d e ，d i a m o n df i l mw h i c hc o v e r e de n z y m ei sm o r es e n s i t i v ea n da c c u r a t et h a nt h et r a d i t i o n a le n z y m ee l e c t r o d e w ec a l lu s ed i a m o n df i l mi n s t e a do fe n z y m ef i l ma sa ne l e c t r o d ef o rb i o s e n s o r s ，a n dd e t e c t e dt h ec o n c e n t r a t i o no ft h eg l u c o s e 、析mat h r e e - e l e c t r o d es y s t e m k e yw o r d sd i a m o n d ；b i o s e n s o r ；c h e m i c a lm o d i f i c a t i o n ；g o dn i缩略语i i i 宣i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 青mlmmmlii i i i 苗i i i i 宣i i i i i i id n ag o dt p dsd e o x y r i b o n u c l e i ca c i dg l u c o s eo x i d a s e缩略语t e m p e r a t u r e p r o g r a m m e dd e s o r p t i o nx r a yp h o t o e l e c t r o ns p e c t r o s c o p yd r i f td i f f u s er e f l e c t a n c ei n f r a r e df o u r i e rt r a n s f 0 1 1 1 1b p ob e n z o y lp e r o x i d em p c v dm i c r o w a v ep l a s m ac h e m i c a lv a p o rd e p o s i t i o nt f aadn f l u o r o a c e t a m i d es s m c cs u l f o s u c c i n i m i d y l - 4 c y c l o h e x a n e - 1c a r b o x y l a t ee d cc v d1 - e t h y l 3 - ( 3 - d i m e t h y l a m i o n p r o p y l ) c a r b o d i i m i d ec h e m i c a lv a p o rd e p o s i t i o n脱氧核糖核酸葡萄糖氧化酶程序控温脱附x 光电子能谱漫反射傅立叶变换红外光谱过氧化苯甲酰微波等离子化学气相沉积三氟乙酸磺基琥珀酰亚胺- 4 环己胺1 羧酸盐1 乙烷基( 3 二甲氨基丙基) 碳二亚胺化学气相沉积h f c v dh o tf i l a m e n tc h e m i c a lv a p o rd e p o s i t i o n热丝化学气相沉积s e mf t i rs c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e扫描电子显微镜f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o m e t e r傅立叶变换红外分光计h p h th i g hp r e s s u r ea n dh i 2 曲t e m p e r a t u r eb d dma b t sp o dh r pb o r o nd o p e dd i a m o n dx - m yd i f f r a c t i o n高压高温掺硼金刚石x 射线衍射2 , 2 - a z i n o - b i s ( 3 - e t h y l b e n z o t h i a z o l i n e 一6 - s u l f o n i c2 ，27 一连氮- 双( 3 乙基a c i d )苯并噻唑6 磺酸)p e r o x i d a s e过氧化物酶辣根过氧化物酶5 5原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：幽美鑫日期：关于学位论文使用授权的声明本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。( 保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：彰逝导师签名：触日i i i第1 章绪论第1 章绪论1 1 研究背景随着人们对生命活动本质认识的不断深入，特别是人类基因组计划的完成，生命科学领域需要开发出能同时大规模处理生物样品和解析生物信息的新技术，于是诞生了生物芯片的概念。生物芯片分为d n a 芯片和蛋白质芯片两类。d n a 芯片是在硅或者玻璃上高密度地固定d n a 生物分子，并对其相关信息进行分析。d n a 是存在于生物细胞核内的遗传信息的储存和携带物质。根据碱基互补配对规律，d n a 侧链的碱基a与t 配对，形成两个氢键；g 与c 配对，形成三个氢键。碱基序列高度有序，这种序列精确地蕴藏了生物的遗传信息。两条互补的单核苷酸链按照碱基配对规律形成一条稳定的双股螺旋的反应叫做杂交，杂交反应可以在溶液中两个互补的分子间发生，也可以在一个溶液中的分子和固定在固相载体上的互补分子间发生，d n a 芯片分析就是利用了标有荧光的单链分子与芯片上的单链序列的杂交反应，并将反应信号用荧光标识出来。应用领域主要有：动植物的试验试样、战争相关疾病与基因诊断、基因治疗、人体基因机能分析研究、与遗传病相关的基因、耐药性的诊断与研究、d n a 碱基序列分析等。蛋白质芯片是数十到数百种各种蛋白质固定在基底表面上，对各种反应进行分析，应用领域主要有：人类疾病的早期诊断和病因分析、对疾病的特种蛋白质是否存在进行分析、对生命现象进行检测和记录、蛋白质相互作用分析、新药和新生物活性物质的开发等。生物芯片中将表面反应的信号转换成电流信号的一类称为生物传感器。生物传感器的发展为临床诊断和药物研发等领域提供了快速、灵敏、精确的检测方法。葡萄糖是人体中最基本的化学构成物质之一，是为有机体提供能量的主要来源。糖尿病是一种代谢紊乱性或内分泌疾病，可以诱发心血管、肾、视网膜和神经系统产生多种并发症，死亡率仅次于心血管病和癌症，被列为世界三大危害疾病之一。随着人们生活水平的提高和生活习惯的改变，糖尿病及其并发症的发病率呈快速上升趋势。利用定量的葡萄糖氧化酶( 简称g o d ) 在某种条件下可以检测葡萄糖的浓度。而长期以来酶反应都是在水溶液中进行，属于均相反应。均相酶山东大学硕十学位论文反应系统简便，但也有许多缺点，例如溶液中的游离酶随排出的产物一起流失，不近造成酶的损失，而且会增加产品的分离难度和费用，影响产品质量；反应后的酶难以分离，无法重复使用；溶液酶很不稳定，容易变性和失活。酶固定化后，既不会流失，也不会污染产品，可以长期重复使用，而且酶的稳定性也得到提甜1 1 。为了能够及时快速的检测人体血糖浓度，减少糖尿病的发病率，设计出一种稳定、方便、耐用的葡萄糖生物传感器具有重大的现实意义。此外，基于葡萄糖氧化酶的生物传感器在食品工业、生物医学、生化工业上均有重要的用途。在葡萄糖氧化酶生物芯片的研制过程中，需要考虑的主要因素是基底材料的稳定性、生物兼容性、导电性以及固定分子的生物活性保持性。特别是蛋白质的活性如何能长期稳定，蛋白质的固定如何能够牢靠。相对于d n a 分子固定技术来说，蛋白质的固定相对更困难。本文提出以金刚石作为生物传感器的基片材料，研究金刚石表面的化学修饰及酶的固定，以制备生物传感器的电极。这种方法制备的电极比传统包埋法制备的酶膜电极具有灵敏度高、准确性好等优点。1 2 国内外研究现状1 2 1 金刚石薄膜表面修饰研究金刚石被认为是自然界最硬的物质，具有一些独特的物理和化学性质，比如很高的热传导性、很宽的波段的透过性、化学稳定性等。因此，人们在很多不同的领域研究金刚石的工业应用，金刚石的表面也因此被广泛地研究。金刚石薄膜表面的修饰大致可以分为物理修饰和化学修饰两种方法。金刚石薄膜表面的物理修饰主要是对表面进行抛光处理，降低表面粗糙度。p t o s i n 等人【2 】用激光对金刚石薄膜表面进行抛光，并分析激光的入射角及金刚石晶体颗粒对抛光效果的影响。顾长志等人【3 】采用激光修饰表面与机械研磨抛光相结合的方法，进一步改进了激光法，提出用激光使金刚石膜表面完全石墨化，随后用机械研磨的方法进行抛光，使抛光效率比单纯的机械研磨提高了1 0 多倍，并且光洁度也得到很大的提高。s u ny u j i n g 等人1 4 j 提出了用熔融的稀有金属铈对金刚石表面进行抛光处理的方法，这种方法可以达到很高的抛光速度，每小时可达几百微米，抛光后的表面轮廓的算术平均偏差可降到1 0 8 4 5 0 6 5 5 3 1 a m 。2第1 章绪论化学修饰研究的焦点集中在金刚石表面与官能团之间的相互作用上来。例如氟化合物、氨基官能团、硫基官能团、羧基官能团等。金刚石表面的化学修饰方法很多，目前采用的修饰方法主要包括：自由基引发、光化学引发以及电化学、热化学反应等。a n d o 等人f 5 】用程序控温脱附( t e m p e r a 臼i r e p r o g r a m m e dd e s o r p t i o n ，t p d ) 和x p s 方法对氯在金刚石表面的修饰进行了研究，并且用傅里叶扩散反射红外光谱( d i f f u s er e f l e c t a n c ei rf o u r i e r - t r a n s f 0 1 i l ls p e c t r o s c o p y ，d r i f t ) 对金刚石薄膜表面的氢去除和氯的化学修饰过程进行了表征。s m e n t k o w s k i 等1 6 】利用x 射线辐射金刚石薄膜表面与全氟烷基碘反应，该化合物的自由基离子可以化学的方式键合到金刚石薄膜的表面，再通过加热分解可制备得到在高温下非常稳定的c f终端的金刚石薄膜。m i l l e r 研究小组r 7 】发现可以通过过氧苯甲酸生成自由基，夺掉金刚石薄膜表面的氢原子使其表面活化，并进一步与乙腈、苯乙腈等反应可生成含有c - n 键的表面。f u j i s h i m a 研究小组【8 1 0 】通过电化学氧化法，使金刚石表面形成c - - - o 键，并发现经过这样的修饰，金刚石薄膜电极对一些化合物的检测精度及选择性检测等多有大幅度提高。另外，t s u b o t a 等人【1 4 】成功地以过氧化苯甲酰( b p o ) 为引发剂与羧酸反应，把羧基直接修饰到金剐石薄膜表面。1 2 2 金刚石薄膜表面生物分子固定技术研究金刚石薄膜表面的d n a 及蛋白质的固定技术主要是采用化学键和的方法，实行共价固定。r o b e r tj h a m e r s 等人【l6 】将微波等离子化学气相沉积( m p c v d ) 法制备的金刚石薄膜表面进行氢等离子化处理，以增大薄膜表面的c h 键浓度，然后用光化学的方法将三氟乙酸( t f a a d ) 保护的氨基基团修饰到氢终端金刚石表面上，最后解除保护使表面形成氨基基团，与硫磺基硫酰亚胺4 - ( n 马来酰亚胺甲基)环已胺1 羧基( 简称s s m c c ) 异双功能基团修饰的d n a 分子进行共价结合，将d n a 分子固定到金刚石的表面。并且验证了金刚石表面固定的d n a 分子杂交的选择性和特异性。m a n u e lf u e n t e s 等人【l7 l 为了增加特异性杂交，减少非特异性杂交，在氨基化的金刚石表面上固定了乙醛天冬氨酸右旋糖苷作为空间手臂分子，固定d n a 分子。这种长链的空间手臂会大大减少d n a 分子的非特异性吸附，试验证明，该方法固定的d n a 分子具有良好的稳定性和选择性。p c l u i s t i a e n s 等人【1 8 1 将氢终端的金刚石薄膜表面光化学的方法固定了十一烯酸，然山东大学硕士学何论文后用1 ( 3 。二甲氨基丙基) 3 乙基碳二亚胺( 简称e d c ) 活化表面的羧基，使其与荧光素异硫氰酸盐( f i t c ) 标记的d n a 分子的氨基端进行化合，从而将d n a分子固定在金刚石的表面。k o i c h iu s h i z a w a 等人【1 9 1 将金刚石粉末放在硫酸和硝酸的混合酸里进行氧化处理，用氢氧化钠和盐酸进行水解处理，以形成羧基，然后用亚硫酰氯处理，将羧基官能团上的o h 基卤化，然后用胸腺嘧啶固定到金刚石粉末表面，作为连接d n a 分子的锚，从而将d n a 分子固定。w e n s h ay a n g 和r o b e r tj h a m e r s l 2 0 1 将t f a a d 保护的氨基基团修饰到氢终端的金刚石薄膜表面上，随后去除保护，将戊二醛连接到金刚石的氨基端，以戊二醛为链接手臂，将人类免疫球蛋白固定在金刚石薄膜上。1 2 3 生物传感器研究1 9 7 2 年，由y e l l o ws p r i n g s 仪器公司制造出第一个商业化的生物传感器，之后又由l e e d s ，n o r t h r u p 和b e c k m a n 仪器公司相继推出并加以发展，该系列传感器主要是用于人体内糖类检测。2 0 世纪8 0 年代，出现了易燃气体传感器、血电介质传感器、有毒气体传感器，其大部分都是电化学传感器。2 0 世纪9 0 年代，传感器向小型化、数字化和高可靠性发展。根据生物传感器中基片上的生物分子的种类可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、d n a 传感器及组织传感器等【2 l l 。生物传感器的应用非常广泛。g e b b e r t 等【2 2 】将免疫球蛋白抗体固定到硅烷化的钽电极上，在流通体系中检测免疫球蛋白，在生物医学研究方面已有较广泛的应用。在环境检测中，有人研究出测定氨气的微生物传感器【2 8 】，所用的微生物包括硝化单胞菌和硝化杆菌，将它们吸附在多孔醋酸纤维素膜上，然后把此微生物膜紧贴在氧电极端部，并在其上覆盖一层透气膜即制成测定氨气的微生物传感器。农业方面，b a i g e n t 等1 2 3 】用鳗鲡乙酰胆碱脂酶( a c h e ) 作为生物传感元件，对有机磷和氨基甲酸抗胆碱酯酶进行了检测，可以检测到1 0 n 玎儿水平的对氧磷，下限则更高，其主要优点是快速、准确、而敌敌畏和焦磷酸四乙酯等农药的检测可重复使用。目前的生物传感器广泛采用的基底材料是铂、金等金属材料和硅、玻碳等非金属材料以及有机聚合物如醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚乙烯醇、聚亚安酯和n a t i o n 等等。有机聚合物材料具有一定的生物兼容性，然而内质阻力较大，响应速度慢，且不具有导电功能。金属材料化学稳定性不强，而且在检测中，容易与4第1 章绪论血液中的其他电活性化学物质如维生素c 和醋氨酚等产生干涉t 2 4 ；硅等非金属材料导热性不强，电磁性质和机械性能都不能满足要求。最近的研究集中在金刚石薄膜材料上。金刚石作为一种功能性材料，具有极其优异的物理性质、良好的化学稳定性、高热传导性以及优良的机械、摩擦和耐高温等性能，更重要的是金刚石是由碳元素组成，可与生物体有良好的兼容性。葡萄糖生物传感器的发展经历了三个阶段，分别是第一代、第二代和第三代葡萄糖生物传感器。2 0 世纪6 0 年代初，c a r k 和l y o n s 2 6 】提出了葡萄糖生物传感器的概念和原理。利用葡萄糖在酶的催化作用下与空气中的氧反应生成葡萄糖酸的原理可以将葡萄糖氧化酶覆盖在电极上并加以封闭，通过测量电极上氧的含量可以间接地测定葡萄糖的浓度。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 2 7 】运用这种原理，首次制作成功了第一台葡萄糖生物传感器，这标志着第一代葡萄糖生物传感器的诞生。第一代生物传感器的主要原理是：通过检测葡萄糖氧化过程中的氧气的含量的减少或者过氧化氢含量的增多，来间接地测定葡萄糖的浓度。这种传感器的测量受到很多外部因素的影响和制约，其灵敏度和精确度不够理想。酶的分子量一般在1 0 0 0 0 以上，其催化活性并不是与整个分子的各个部分有关，而是集中在某一区域。这样的结构使得酶与基底的电子交换变得很不顺畅，从而影响传感器的灵敏度。引入电子传递介体可以解决这一难题。电子传递介体的作用就是作为人工的氧化还原介质，直接从酶与电极表面获得电化学活性，把葡萄糖氧化酶氧化，使之再生后循环使用，电子传递介体本身又被还原，然后在电极上被氧化。这样在电极上产生氧化电流，从而避免了其他活性物质的干扰。这就是第二代生物传感器。常见的传递介体主要有：二茂铁及其衍生物、钌及其化合物、铁氰酸盐、有机染料、有机介体、有机导电盐等。上海复旦大学的刘海鹰、邓家棋【2 8 】将葡萄糖氧化酶溶解在n a t i o n 水溶液中，然后把它固定在修饰有二茂铁的玻碳电极表面，最后再修饰一层n a t i o n 膜，成功制备二茂铁- n a t i o n 修饰的葡萄糖氧化酶传感器。如果采用某种方法，将酶的活性中心直接与基底接触或接近，从而省掉媒介体，这样电子传递就更为容易。这就是第三代生物传感器。但是目前为止，只发现少数物质能在电极上直接电催化，从而限制了第三代生物传感器的广泛应用，。但是从理论上讲，这是生物传感器的发展方向。山东大学硕士学何论文1 3 主要研究内容纵观国内外的研究现状，我们了解到对于金刚石表面的化学修饰、酶的固定以及生物传感器的研究还存在许多不足。主要表现在：对于金刚石的化学修饰研究仅仅停留在定性阶段，即采用何种方法能够固定有机官能团，没有设计科学的试验方法以探讨试验各因素对反应结果的影响；对于酶的固定方法，传统的包埋法存在许多缺陷，如酶的稳定性不够、作为电极使用时电流的传输内质阻力较大等等；传统生物传感器的电极同样存在着灵敏度不高，准确性不足的缺陷。本文提出了一种新的功能材料金刚石应用于生物传感器，并对基片的处理包括化学修饰、酶的固定以及用在电极上的结构等进行了系统的研究。具体研究内容主要包括以下几个部分：( 1 ) 对热丝法化学气相沉积( h f c v d ) 的金刚石薄膜表面进行扫描电镜( s e m ) 、拉曼光谱和x 射线衍射( m ) 观察和表征，研究金刚石的表面外观形貌和内部晶体结构。( 2 ) 对金刚石薄膜进行化学修饰，研究通过强酸氧化和水解的方法在氢终端的金刚石表面固定羧基官能团的工艺，并对修饰结果进行检测表征，最后根据l a m b e r t b e e r 定律，以f t i r 的吸光度作为试验指标，研究各种反应因素和水平对官能团固定效果的影响。( 3 ) 研究葡萄糖氧化酶固定在羧基化的金刚石薄膜上的方法。以金刚石表面羧基的o h 为连接器，通过e d c 作为催化剂，将葡萄糖氧化酶共价固定在金刚石表面。( 4 ) 探讨金刚石薄膜作为电极应用在葡萄糖生物传感器中的方法。在传统的酶膜电极的基础上，设计金刚石薄膜的电极结构，用以检测葡萄糖的浓度。6第2 章金刚石薄膜的特性及表征曼曼曼曼曼曼皇皇曼曼曼曼曼量曼鼍m i n _m 曼曼曼皇曼量! 曼曼! 曼曼! 曼曼曼曼曼曼詈曼量曼曼曼曼曼曼曼曼曼量曼曼曼第2 章金刚石薄膜的特性及表征2 1 引言金刚石是一种集多种优良性能于一体的功能性材料，在许多领域有着及其广泛的应用前景【2 9 3 0 1 。金刚石的化学性质非常稳定【3 5 1 。在氢氟酸、盐酸、硫酸，甚至在酸的浓度很大和温度极高的情况下都没有任何反应。它只能在熔融状态下的硝酸盐及某些金属液态环境下产生氧化和燃烧。高温下，在某些气体介质中金刚石也被蚀刻，如o 、c o 、c 0 2 、h 、水蒸气和c 1 2 等。金刚石具有高度的色散，即折射率强烈地随入射光的波长而改变【3 2 】。在入射光波长九= 5 8 9 3 x 1 0 叫o m 下，它的折射率为行= 2 4 1 7 ，而石英晶体只有1 5 左右，因此金刚石对光的反射比较好。金刚石晶体作为等轴晶系的物质，在光学上应该是各向同性的，但是金刚石总是显示出双折射，这是由于晶体内部构造的不同、晶体的位错、塑性变形、机械冲击等各种类型的缺陷引起的。在所有薄膜材料中，金刚石的透射光谱带最宽，除大约在3 , - - 5 9 m 位置存在微小吸收峰之外，从紫外到红外整个波段金刚石都具有高的透过率。金刚石具有很高的导热率【3 3 】。在2 0 。c 条件下，金刚石的导热率相当于导热性能较好的金属如铜和银的2 5 倍。金属导热的原因是由于内部自由电子的运动引起的，而金刚石的导热性好原因在于它的晶格振动。金刚石的热膨胀系数非常小，远小于金属的热膨胀系数，只相当于一般宝石的一半左右。这种导热率高而膨胀系数小的性质使金刚石可以用在要求精度较高的传热元件上。金刚石为目前地球上最硬的物质。它的晶体结构和几个重要的位面如图2 1所示。金刚石的硬度在晶面上具有各向异性，根据试验数据，( 1 1 1 ) 面的硬度( 1 1 0 ) 面的硬度 ( 1 0 0 ) 面的硬度。金刚石的体积压缩模量为5 6 6 3 x 1 0 1 1 p a ，它的压缩系数在所有物质中为最小。金刚石的杨氏模量为10 5 0 g p a ，压缩强度为8 6 9 g p a ，抗张强度为3 , - - 4 g p a 。压缩强度和抗张强度都比其他材料高出几倍。金刚石具有极大的弹性模量，是自然界最高的磨削材料，摩擦系数小，有极高的抗磨能力。7山东大学硕士学位论文e( a ) 金刚石晶体结构中几个重要的位面( b ) 金刚石晶体结构中的( 1 0 0 ) 位面( c ) 金刚石晶体结构中的( 1 1 0 ) 位面( d ) 金刚石晶体结构中的( 1 1 1 ) 位面图2 1 金刚石晶体的位面理论上的纯净金刚石是绝缘体，电阻率很高，但由于杂质的存在，使得金刚石的电阻率会在一定范围内发生变化。天然的金刚石晶体在3 0 0 k 温度下的电阻率为1 0 1 0 、1 0 1 6 d c m 。掺硼的金刚石表现出半导体的性质，因此，可用在电子器件及生物传感器上。金刚石具有很宽的带隙，约为5 5 e v 。具有高的击穿电压，约为1 0 6 1 0 7 v c m ，比s i 和g a a s 高两个数量级。金刚石的介电常数为5 7 ，比s i ( 1 1 9 ) 小一倍。天然金刚石没有磁性，人造金刚石具有磁性，依触媒类型不同而异。对于用n i c r f e 、n i f e m n 和n i m n c r 三种触媒合成出来的金刚石在同样热力学条件下磁性依次减弱。具有完好结构的理想金刚石晶体没有顺磁共振现象，但在天然金刚石中由于杂质的存在，引起了顺磁吸收。金刚石的成分是碳，具有良好的生物兼容性，可以与有机物进行良好的结合。对于含大量碳的人体没有任何排异反应，加上它的化学稳定性，与人体血液和组织液不起任何反应，因此它是理想的医学生物体植入材料。掺硼的金刚石的8第2 章金刚石薄膜的特性及表征半导体性质，是生物芯片的极佳材料。2 2 金刚石薄膜制备技术金刚石在热、电、光、机及生物材料方面所显示出来的优越性能已为大家所认知。然而，天然金刚石的含量极为稀少，且非常昂贵，不可能把金刚石大规模地应用于工业，于是人们便把兴趣转移到金刚石的人工合成上来。2 0 世纪5 0 年代中期，人们用高压( 5 0 0 0 1 0 0 0 0 m p a ) 高温( 1 5 0 0 2 0 0 0) 技术( h p h t ) ，首次人工合成了金刚石，并实现了商业应用。但是h p h t 法制备的金刚石呈离散的单晶状态，限制了它的使用，只能应用于制造切削工具和首饰。在h p h t 法制备金刚石的同时，前苏联和美国的科学家已先后在低压下利用热解c b r 4 或c h 4 的方法沉积了金刚石多晶薄膜。虽然这种沉积方法金刚石的生长速度很慢，但也给了大家很多启示，使人们看到了在低压下合成金刚石的可能性。2 0 世纪8 0 年代，化学气相沉积( c h e m i c mv a p o rd e p o s i t i o n ，c v d ) 法合成金刚石薄膜技术取得突破性进展，使人们大规模利用金刚石的愿望得以实现。同时，通过c v d 法制备的掺杂硼的p 型金刚石薄膜( b d d ) ，使金刚石薄膜在具有金刚石本身的特殊物理化学特性的同时，还具有导电性，作为新型碳素功能电极材料，具有许多目前使用的电极材料所不可比拟的优越性。通常作为电极使用的金刚石薄膜大部分是通过热丝法( h f c v d ) 或微波等离子法( m p c v d ) 沉积复合多晶金刚石薄膜到硅或钛的基板上，然后连接导线制备而成【3 4 1 。热丝法是利用高温金属丝激发等离子体，装置简单，使用起来比较方便，并可大面积制备。金刚石薄膜的表面粗糙度与晶粒度和表面形状有着密切的关系。纳米金刚石的晶粒度小、表面平滑，因此，其耐摩擦磨损特性优于微米金刚石，而且有望作为一种光学材料出现，更重要的是纳米金刚石的晶粒之间的尺寸过度比较平滑，应力集中现象比较少，因此表面强度以及与基底的附着力较微米金刚石薄膜好。微米金刚石薄膜和纳米金刚石薄膜的扫描电镜图像如图2 2 所示。9山东大学硕士学位论文微米金刚石纳米金刚石图2 - 2 金刚石潭膜的扫描电镜图像b a r r o s 等人【3 6 】利用m p c v d 工艺，首先用c h 4 h 2 混合气体，以高甲烷浓度在钛合金上沉积出s p 2 碳层。在6 0 0 1 2 基底温度下，用c 0 2 c i - h 混合气体在其上沉积出纳米金刚石。a m a r a l 等人【3 7 】则应用h f c v d 工艺，以a r - c i - h h 2 混合气体在s i 3 n 4 基底上沉积出纳米金刚石。该h f c v d 工艺的最佳沉积条件：热丝温度为2 2 0 0 。c 、基底温度为6 5 0 c 、反应气体为a r h 2 = i 2 和c h 棚2 = 0 0 4 。据s h a r d a等人1 3 8 】报道，应用m p c v d 工艺，以c h 4 h 2 混合气体在硅基底温度6 0 0 。c 、2 6 0 v 的d c 偏压下沉积出纳米金刚石。y o s h i k a w a 等人【3 9 】利用c h 4 h 2 混合气体，在甲烷浓度1 0 m 0 1 ( 摩尔百分数) 、改变等离子体与基底的距离在硅基底上沉积出纳米金刚石。论文使用的芯片是以c h 4 h 2 混合气体为原料气体，用h f c v d 法以较高甲烷浓度在单晶硅基底上沉积纳米金刚石。另外，还利用扫描电镜装置( s e m ) 、x射线衍射仪( x r d ) 、拉曼光谱仪对纳米金刚石薄膜的形状、晶面、表面粗糙度和成分进行详细的表征。2 3 金刚石薄膜的性质表征金刚石薄膜试样用热丝法沉积。热丝法沉积金刚石设备基本示意图如2 3 图所示。把衬底上的钨丝通入电流加热到2 0 0 0 ，将衬底的温度控制在7 0 0 。1 0 0 0，以氢气和甲烷的混合气体作为气体源，其中甲烷为碳源，氢气为环境气体。甲烷浓度为2 m 0 1 以上，混合气体的总流量为1 0 0 c m s m i n ，在试样室内压力保持在8 0 k p a ，沉积时间6 h ，可以沉积出厚度约为8 0 1 m a 的金刚石薄膜。1 0第2 章金刚石薄膜的特性及表征皇曼皇曼曼曼曼! 皇曼曼曼量曼曼! 曼曼鼍曼曼曼曼鼍曼皇曼鼍鼍曼mi _ i m m i 一一一一_一i_囡2 3 i 金刚石薄膜的扫描电镜表征为了观察金刚石薄膜的微观结构，用j s m 3 5 c 扫描电镜( s e m ) 对试样表面进行扫描观察。利用二次电子对样品表面形态变化敏感，这一物理信号为调制信号而成像的二次电子像，其分辨率高，可清晰地反映薄膜微区形态。其工作原理：电子枪发出的电子被加速成电子束，打在样品表面，样品原子的外层电子受激发后逃逸而形成二次电子，将二次电子收集得到的信号转化成光信号，再转化成电压信号显像。扫描金刚石薄膜试样得到的图像如图2 4 所示。金刚石薄膜出现的晶粒度约为8 0 n t o ，而且金刚石呈微小粒子聚集的簇状，硅基底表面完全被这种簇状薄膜所覆盖，呈现出较为光滑的平面。晶体粒度小，排列较为紧密，没有出现剥离或开裂的现象。事实上，在沉积温度较高的情况下金刚石的与基底之间存在着热膨胀系数差【加l ( 分别是c ：。1 5 x 1 0 6 c 和s i ：4 x 1 0 - 6 c ) ，容易出现剥离或开裂的现象，而在高温下沉积的金刚石c 原子与基底s i 原子发生反应，生成了热膨胀系山东大学硕士学位论文数介于s i 和金刚石之间的s i c ( 3 x 1 0 - 6 c ) ，而甲烷浓度较高的时候，生成的s i c层越厚。在这种情况下，热膨胀系数从金刚石到硅基底是逐步变化的，因此，纳米金刚石并未发生剥离。图2 - 4 纳米金刚石薄膜的s e m 微观表征2 3 2 金刚石薄膜的拉曼光谱为了详细地了解金刚石的结构和质量信息，用拉曼光谱法对金刚石薄膜表面进行表征。用拉曼光谱研究金刚石( 膜) ，当激发光光子作用在金刚石表面时，会产生非弹性散射，形成拉曼散射光，并引起金刚石中分子振动。特定的分子振动频率对应着金刚石中特定的价键结构，其数值等于发生非弹性散射后的散射光和入射光之间的频率差。这些特定频率反映在拉曼谱图中的位置就是金刚石的特征拉曼( 散射) 峰位。拉曼谱图的横坐标为拉曼位移，以波数( e m 。1 ) 表示，纵坐标为拉曼光强。图2 5 是甲烷浓度在2 m 0 1 沉积6 h 的金刚石薄膜的拉曼光谱。从图中可以看出试样分别在1 1 4 0 c m 、1 3 5 0 c m - 1 、1 4 8 0 c m 0 和1 5 6 0 c m 1 处出现了波峰。其中，在1 3 5 0 c m 。和1 5 6 0 c m 。1 处出现的两个最强的锐峰代表的类似于金刚石和石墨的振动特点，分别为d 谱带和g 谱带，与石墨岛的相有关【4 1 - - 4 4 。h i r a m i t s u 等人m 】称，1 1 4 0 c m d 处的宽峰与金刚石相的计算声子的浓度有关，是由纳米金刚石的尺寸效应所致，代表的是金刚石的纳米相。拉曼峰1 4 8 0 c m j 的金刚石晶体呈偏斜s 矿结构或反式聚乙炔结构。拉曼光谱的1 4 8 0 c m 以和1 5 6 0 c m 。1 与存在于晶界的杂1 2第2 章金刚石薄膜的特性及表征质( s p 2 碳) 有关系。4 9 9 c m 1 处的波峰与掺杂的硼元素有关，表明试样是掺硼的p 型导电金刚石薄膜。本试样的拉曼光谱结果与s h a r d a 和h i r a m i t s u 等人报道的拉曼峰基本一致，有一定区别，说明在甲烷浓度为2 m 0 1 时，用h f c v d 法沉积的金刚石薄膜中形成了纳米金刚石相，不过从波峰强度来看，石墨相的成分较多些。乏4 0 0 0苦们c虫3 0 0 0c1 0 0 05 叩1 0 0 01 5 0 02 0 0 0w a v e n u m b e r ( c m 1 )图2 - 5h f c v d 法沉积的纳米金刚石薄膜的激光拉曼光谱2 3 3 金刚石薄膜的x 射线衍射图谱为了迸一步对金刚石薄膜的晶体结构进行表征，用x 射线衍射法) 对试样进行分析。x r _ d 检测的原理是：晶体是由一系列平行的原子层所组成的，当入射x 射线投射到晶体上时，各原子层对其发生相干散射，类似于反射镜，只有在符合反射定律的方向散射的x 射线强度最大，能发生干涉现象。只有当光程差为波长的整数倍时，光波才能相互叠加，使光的强度增强，即发生衍射。利用这种方法可以研究金刚石的内部晶体结构。山东大学硕士学位论文3 0 0以vv2 0 0捌慧1 0 003 04 05 06 07 08 02 0 ( o )图2 - 6h f c v d 法沉积金刚石的x r d 花样图2 6 显示的是金刚石薄膜的