（植物病理学专业论文）稻瘟病菌成熟附着胞cDNA文库的构建及转几丁质酶基因毛壳菌的抗病原真菌作用的研究.pdf

稻瘟病菌成熟附着胞c d n a 文库的构建及转几丁质酶基因毛 壳菌的抗病原真菌作用的研究 摘要 稻瘟病菌 m a g n a p o r t h eg r i s e a 附着胞是稻瘟病菌在侵入水稻组织前形成的 一种侵染结构，是稻瘟病菌侵染过程中的一个关键环节。了解稻瘟病菌附着胞阶 段基因表达的状况对于弄清附着胞形成、发育和侵入机制具有重要的意义。本论 文第一部分研究了形成2 4 小时的稻瘟病菌附着胞基因表达及与菌丝、孢子基因 表达的差异，为寻找参与稻瘟病菌附着胞形成、发育过程或穿透过程的关键基因 打下了基础。球毛壳菌 c h a e t o m i u m 咖6 d s “m 】和绿色木霉 t r i c h o d e r m av i r i d e 都 是重要的生防真菌，几丁质酶和葡聚糖酶等分泌性酶类被认为在木霉等真菌的生 防过程起重要作用，而关于毛壳菌生防过程中细胞壁降解酶的作用还缺少研究。 本论文第二部分试图利用从绿色木霉基因组d n a 中克隆到的内切几丁质酶基 因( c h b i ) ，转入球毛壳菌c g l 2 菌株中，研究其表达状况，探讨几丁质酶在提 高毛壳菌生防中的可能作用。 主要研究结果如下： 1 、本论文借助s m a r t 技术和长距离p c r 技术构建了水稻稻瘟病菌成熟附着胞 ( 发育2 4 小时) 的e d n a 九噬菌体文库。e d n a 文库的滴度为2 3 7 1 0 6 ，插 入片段平均大小为6 6 0 b p 。随机挑选的1 2 个克隆经测序，获得9 条平均长度 为4 7 0 b p 的e s t 序列，c o n t i g 组装为8 条非冗余e s t 序列。这8 条e s t 在 n c b i 上用b l a s t n 进行相似性联配，发现有2 条e s t 序列在g e n b a n k 中没有 登记过。本e d n a 文库基本反映了2 4 小时阶段稻瘟病菌附着胞的基因表达 状态，适合用于研究稻瘟病菌附着胞阶段基因的功能分析。 2 、本论文利用s s h 技术构建了稻瘟病菌发育2 4 小时附着胞与稻瘟病菌菌丝孢 子c d n a 之间的差减文库( 附着胞c d n a 差减文库) 。重组质粒经测序获得 2 5 0 条e s t 序列。这些e s t 经e o n t i g 组装后，得到1 5 5 条非冗余e s t 序列。 1 5 5 条非冗余e s t 序列在m a g n a p o r t h eg r i s e ad a t a b a s e 用b l a s t 进行相似性联 配，著逐个比较分析e s t 序列对应的基因组d n a 序列，确定这1 5 5 条e s t 序列对应着1 4 2 个基因。r t - p c r 验证结果表明共有7 1 个基因( 5 0 o ) 在 稻瘟病菌附着胞中特异表达。在n c b i 上的e s t 序列相似性联配( b l a s t n ) 结 果表明：5 8 的e s t 序列( 8 2 条) 具有同源序列，其余4 2 e s t 序列( 6 0 条) 没有找到同源的e s t 序列。上述结果表明本e d n a 差减文库在筛选稻瘟 菌附着胞特异表达基因中取得了很好的结果。 3 、本论文利用含有克隆自绿色木霉基因组d n a 的4 2 k d a 内切几丁质酶基因 ( c h b i ) 的真菌表达载体p e c h b i ，通过原生质体转化将该基因导入球毛壳菌 c g l 2 菌株，获得3 0 个几丁质酶基因转化予。内切几丁质酶活性的测定结果 表明i 5 的c g l 2 转化子的内切几丁质酶活性得到了明显提高：在p d a 平板 上测定了c g l 2 转化子对9 种病原真菌的拮抗能力，发现4 株c g l 2 转化子的 拮抗能力得到提高，但丁质酶活性和转化子对病原真菌的生长抑制率之间没 有明显的对应关系。 关键词：稻瘟病菌，毛壳菌，附着胞，e d n a 文库，e d n a 差减文库，s h h ，几丁 质酶，生防作用 t h ec o n s t r u c t i o no fc d n al i b r a r ya tm a t u r e a p p r e s s o r i u ms t a g eo fm a g n a p o r t h eg r i s e aa n da n t i f u n g a l a c t i v i t yo fc h a e t o m i u mg l o b o s u mt r a n s f o r m e dw i t ha n e n d o c h i t i n a s eg e n e a b s t r a c t t h ea p p r e s s o r i u mi sas p e c i a l i z e dc e l l u l a rs t r u c t u r ef o r m e db ym a g n a p o r t h e g r i s e ab e f o r ep e n e t r a t i n gp l a n tt i s s u e s t h ea p p r e s s o r i u ms t a g ei sak e yp e r i o df o r t h e r i c eb l a s tf u n g u st oi n f e c tr i c e i ti ss i g n i f i c a n tt of i n do u tt h es t a t eo fg e n ee x p r e s s i o n o fa p p r e s s o r i u mf o ru st ou n d e r s t a n dt h ep r o c e s so fa p p r e s s o r i u mf o r m a t i o n ， d e v e l o p m e n ta n dp e n e t r a t i o ni nt h er i c eb l a s tf u n g u s ，i nt h ef i r s tp a r to ft h i sa r t i c l e ， w er e p o r t e dt h ec o n s t r u c t i o no fae d n al i b r a r yd u d n gl a t ea p p r e g s o r i u ms t a g ea n d d i s c o v e r yo ft r a n s c r i p t su n i q u e l ye x p r e s s e dd u r i n gl a t ea p p r e s s o r i u ms t a g ei nm g r i s e ab yas u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o nm e t h o d ，a n dt r i e dt of i n dt h ek e y g e n e sr e l f i t e dt oa p p r e s s o r i u mf o r m a t i o n ，d e v e l o p m e n ta n dp e n e t r a t i o n c h a e t o m i u m g l o b o s u ma n dt r i c h o d e r m av i r i d ea r ei m p o r t a n tf u n g iw i t hr o l e si nt h eb i o l o g i c a l c o n t r 0 1 c e l lw a l ld e g r a d i n ge n z y m e s ( c w d e s ) ，s u c ha se n d o c h i t i n a s ea n dg l u c a n a s e ， h a v ei m p o r t a n ta f f e c t si nt h eb i o c o n t r o lp r o c e s so ft r i c h o d e r m a b u tt h er o l e so f c w d e si nc h a e t o m i u m sb i o c o n t r o lp r o c e s sh a v en o tb e e nk n o w nu n t i ln o w i nt h e s e c o n dp a r to ft h i sa r t i c l e ，w er e p o r t e dt h er e s u l t so ft h ev a r i a n c e si ne n d o c h i t i n a s e e x p r e s s i o na n db i o c o n t r o le f f e c t i v e n e s so fcg l o b o s u mc g l 2 i n t r o d u c e dw i t ha n e n d o c h i f i n a s eg e n e ( c h b i ) c l o n e df r o mrv i r i d e ，a n dt r i e dt of i n do u tt h ep o s s i b l e r o l e so fe n d o c h i t i n a s ei nt h eb i o c o n t r o lp r o c e s so ft r i c h o d e r m a t h er e s u l t so b t a i n e da r ea sf o l l o w i n g ： am a t u r ea p p r e s s o r i u me d n al i b r a r yo fr i c eb l a s tf u n g u s ，mg r i s e a ，w a s c o n s t r u c t e di nak t r i p l e x 2v e c t o rb ys m a r ts k i l la n dl o n gd i s t a n c ep c rs k i l l t h e c d n al i b r a r yc o n t a i n e d2 3 7 10 6i n d e p e n d e n tc l o n e sn e a r l ya b o u t10 0 o fw h i c h h a r b o r e df o r e i g nc d n ai n s e r t sw i t ha v e r a g es i z eo f6 6 0b p o f12r a n d o m l ys e l e c t e d v c l o n e st os e q u e n c e ，n i n ee s t sh a v i n ga r ta v e r a g el e n g t hw i t h4 7 0 b pw e r eo b t a i n e d a f t e rc o n t i ga s s e m b l y , e i g h tn o m e d u n d a n te s ts e q u e n c e sw e r eg e n e r a t e d a 1 l8 u n i q u ee s ts e q u e n c e sw e r es u b j e c t e dt os i m i l a r i t ys e a r c h e sa g a i n s tg e n b a n k ，a n d t w os e q u e n c e sw e r ef o u n dt ob en oh o m o l o g o u se s ts e q u e n c e si ng e n b a n k o nt h e w h o l e ，t h ea p p r e s s o r i u me d n al i b r a r yc o u l ds t a n df o rt h es t a t eo fg e n ee x p r e s s i o ni n l a t ea p p r e s s o r i o ms t a g ea n di ss u i t a b l ef o rg e n ee x p r e s s i o na n a l y s i sa n df u n c t i o n a n a l y s i so ft h el a t es t a g e so fa p p r e s s o r i u mf o r m a t i o na n dt h ee a r l ys t a g e s o f p e n e t r a t i o no f m g r i s e a as u b t r a c t i v es u p p r e s s i v el i b r a r yo fm a t u r ea p p r e s s o f i u me d n as u b t r a c t e db y c o n i d i u ma n dm y c e l i u mc d n aw e r ec o n s t r u c t e db ys s h ( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n ) 2 5 0e s ts e q u e n c e sw e r eo b t a i n e da f t e rt h es e q u e n c i n go f r e c o m b i n a n t e d n ac l o n e s a f t e rc o n f i ga s s e m b l y , 15 5n o n r e d u n d a n te s t sw e r eg e n e r a t e d p r o c e s s s e q u e n c e sw e r es u b j e c t e dt os i m i l a r i t ys e a r c h e sa g a i s tm a g n a p o r t h eg r i s e ad a t a b a s c ( b r o a di n s t i t u t e ) a f t e re v e r ym a t c h i n gr e c o r do fa l lh o m o l o g ys e a r c h e sw e r ec h e c k e d a n dc o u n t e d ，1 4 2g e n e sw e r ei d e n t i f i e d a m o n g1 4 2g e n e se x a m i n e dw i t hr t - p c r ， 7 1g e n e sw e r ee x p r e s s e do n l yi na p p r e s s o r i ai n c u b a t i n gf o r2 3 5 2 4 5 ha t2 5 。c t h e h o m o l o g ys e a r c h e so f e s t si ng e n b a n ku s i n gb l a s t nr e v e a l e dt h a tf i f t y - e i g h tp e rc e n t o ft h e1 4 2e s t sh a dh o m o l o g o u se s ts e q u e n c e sa tt h et i m eo fs u b m i s s i o n ，a n dt h e r e s te s t sh a dn o th o m o l o g o u se s ts e q u e n c e sw i t he x p e c tv a l u el e s st h a ne 一3 t h e a b o v er e s u l t ss h o wt h ec o n s t r u c t i o no fs h hc d n al i b r a r yw a ss u c c e s s f u li nt h e i d e n t i f i c a t i o no f t h eg e n e ss p e c i f i c a l l ye x p r e s s e di na p p r e s s o r i a a f t e rt h ee n d o c h i t i n a s eg e n e ( c h b oc l o n e df r o mt h eg e n o m ed n ao ffv i r i d e w a si n t r o d u c e di n t ocg l o b o s u mc g l 2 ，t h i r t yt r a n s f o r r n a n t sw e r eo b t a i n e d i tw a s i n d i c a t e dt 1 1 a tl h ee n d o c h i t i n a s ea c t i v i t i e so fo n e f i f t ht r a n s f o r m a n t sw e r ee n h a n c e d s i g n i f i c a n t l y a n di tw a sf o u n dt h ea n t i f u n g u a la b i l i t i e so ff o u rcg t o b o s u mc g l 2 t r a n s f o r m a n t sa g a i n s ts e v e r a lp a t h o g e nf u n g iw e r ep r o m o t e do i lp d ap l a t ea sw e l l b u tt h e r ea r en or e l a t i o n sb e t w e e ne n d o c h i t i n a s ea c t i v i t ya n da n t i f u n g u a la b i l i t i e s k e y w o r d s ：m a g n a p o r t h eg r i s e a ，c h a e t o m i u mg l o b o s u m ，a p p r e s s o r i u m ，c d n a l i b r a r y ，s s h ( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v ch y b r i d i z a t i o n ) ，e n d o e h i t i n a s e ，b i o c o n t r o l v 单何代码：! q 3 堑 研究生学号：! q q ! q 3 2 稻瘟病菌成熟附着胞e d n a 文库的构建及转几丁质酶 基因毛壳菌的抗病原真菌作用的研究 论文评阅人： 潘庆华 研究员、博导华南农业大学 答辩委员会委员： 主席： 徐同 教授、博导浙江大学 委员： 论文答辩日期 本研究受国家自然科学基金项目3 0 2 7 0 0 4 9 、科技部 “8 6 3 颂目2 0 0 2 a a 2 4 5 0 4 1 、浙江省自然科学基金项目3 0 2 3 2 6 的资助 致谢 本论文是在导师李德葆教授的悉心指导下完成的。导师严谨的治学态度，为 人师表的师德风范、呕心沥血献身事业的精神、把握学科前沿的敏锐的洞察力以 及丰富的知识面是我终生受益，并将在今后的工作中鞭策我前进。谨此向导师倾 注的五年培养心血和教诲表示衷心的感谢 在五年的学习和工作期间，得到了浙江大学生物技术研究所林福呈教授的具 体指导。尤其是在稻瘟病菌附着胞c d n a 文库构建方面给予的具体指导、支持和 信任，谨此表示衷心的感谢。生物技术研究所王洪凯博士。陈卫良博士，王政逸 博士、胡东维博士、郭泽建博士在实验过程中给予了大力帮助和关心，在此一并 致以诚挚的谢意。 感谢本实验室的刘同宝、于晓云、刘小红、王教瑜、冯晓晓、刘朋娟、董波、 张春红等同学的热情帮助。尤其对于刘同宝同学在稻瘟菌附着胞诱导、r n a 提取 和c d n a 文库建设中、于晓云同学在毛壳菌转几丁质酶基因研究中为本论文作出 的巨大贡献表示由衷的感谢。 感谢浙江大学生命科学学院姜乃澄先生、蔡如星教授、刘季科教授等前辈和 同事在博士期间给予的帮助、鼓励和关心。 特别感谢家人在生活和精神上的理解、关心和支持。 感谢所有关心和帮助过我的老师、同学和朋友们 卢建平 20 0 5 年1 月7 日 浙江大学华家池校区 第一章文献综述 1 稻瘟病菌 稻瘟病是水稻上的一种毁灭性病害，其病原真菌为稻瘟病菌 m a g n a p o r t h e g r i s e a ( h e b e r t ) b a r r 。世界上每年由稻瘟病造成的水稻产量损失在1 0 - 3 0 之间 ( b a k e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。除了水稻外，稻瘟病菌也对其它禾本科植物，如小米 ( e l e u s i n ec o r a c a n a ) 、大麦( h o r d e u mv u l g a r e ) 、小麦( t r i t i c u ma e s t i v u m ) 造成 危害( i g a r a s h ie ta l ，1 9 8 6 ；e k w a m u ，1 9 9 1 ) 。稻瘟病在整个水稻生育期都会发生， 根据受害的时期和部位不同，可以分为苗瘟、叶瘟、叶枕瘟、节瘟、穗颈瘟、枝 梗瘟和谷粒瘟等，其中穗颈瘟对产量影响最大，而叶瘟则是稻瘟病的显著的标志 之一。除了从叶、茎等地表部位侵入水稻外，稻瘟病菌还能从根部侵入水稻植株， 引发同样的症状( s e s m a & o s b o u r n ，2 0 0 4 ) 。 2 稻瘟病菌病侵染循环 稻瘟病菌的侵染过程从分生孢子降落到水稻叶片表面后开始。在适宜的水分 条件下，孢子释放出顶端分隔内的粘胶，紧紧粘附在水稻叶片表面( h a m e r , 1 9 8 8 ) 。粘胶由蛋白质、糖类和脂肪组成( h o w a r de t a l ，1 9 9 6 ) 。水稻叶片表面具 有一层疏水性的蜡质角质膜，而粘胶使孢子粘附在这一疏水性表面。 粘附后2 小时内，孢子萌发产生芽管。芽管通常从孢子的一个顶端细胞伸出 并生长。同时芽管顶端也分泌一种粘胶物质，使芽管紧紧粘附在植物叶片表面， 防止被水滴冲走( k o g ae la l ，2 0 0 4 ) 。4 小时内，芽管生长停止，顶端钩状体形 成并膨大形成附着胞( h o w a r de ta l ，1 9 9 6 ；b o u r e t te ta 1 ，1 9 9 0 ) 。在附着胞成熟 过程中，除与植物表厩接触的附着胞孔外，附着胞细胞壁出现黑色素沉积，最终 形成黑色素层( h o w a r de ta l ，1 9 9 6 ) 。黑色素层允许水分子自由通过，而使溶于 水的物质难以自由通过，导致附着胞建立和维持很大的细胞内膨压( h o w a r de ta 1 1 9 9 6 ；m o n e y e la l ，1 9 9 6 ) 。附着胞的黑色素化过程完成后，产生侵染栓，在细胞 内膨压作用下，穿过附着胞孔和植物表面，进入植物体内( h o w a r de ta l ，1 9 9 6 ； m o n e y ，e ta l ，1 9 9 6 ；h o w a r d ，e ta l ，1 9 9 1 ) 。 侵入后，侵染栓分化成侵染菌丝，迅速在水稻叶片内生长并侵染其它邻近细 胞。在接种7 2 小时后，病原菌生物量已经达到感染h 1 - 片的1 0 ( t a l b o te ta l ， 1 9 9 6 ) 。5 - 7 天后，分生孢子梗上分化出大量新的分生孢子，并从新病斑释放出 来。每晚可以产生2 0 0 0 - - 6 0 0 0 个孢子并持续约2 周时问。这些新形成的孢子被潮 湿的空气带到附近的水稻植株，开始新的侵染过程( t a l b o t ，1 9 9 5 ) 。 3 稻瘟病菌附着胞形成过程 目前国内外已经对稻瘟病菌附着胞形成过程作过大量的研究。稻瘟病菌附着 胞形成是一种在适宜的诱导条件下产生的包括一系列形态学及生理学变化的细 胞分化过程。由于附着胞形成过程可以在体外的人工或植物表面进行，已有许多 研究详细描述了附着胞形成过程中发生的形态学变化( h o w a r de t a l ，1 9 9 6 ；h c a l h e la 1 ，1 9 9 2 ) 。因而，可以比较容易分析由于基因缺失而引起的附着胞结构和功 能的变化( h a m e re t a l ，1 9 9 8 ) 。 真菌孢子粘附到植物表面是附着胞发育的一个很重要的因素( h a r n e re ta l ， 1 9 8 8 ；x i a oe ta 1 ，1 9 9 4 ) 。孢子萌发仅仅需要有丰富的自由水，不需要外界营养。 一般一根芽管从3 个细胞组成的顶端细胞或基部细胞萌发( b o u r e t te t a l ，1 9 9 0 ) 。 萌发以后，芽管的继续发育( 生长和分化) 依赖于芽管生长所依附的表面特性。 基质的硬度是芽管分化的一个重要因子，如稻瘟病菌分生孢子仅在硬的固体表面 形成附着胞，而不能在液体表面或软基质表面形成附着胞( x i a oe ta l ，1 9 9 4 ) 。 一般认为疏水表面激发附着胞形成过程( h a m e re t a l ，1 9 8 8 ，l e ee ta l ，1 9 9 4 ； b e c k e r m a ne ta 1 ，1 9 9 6 ；g i l b e r te ta 1 ，1 9 9 6 ) 。l e e 和d e a n 发现附着胞形成的频率 与附着表面的疏水度相关( l e ee t a l ，1 9 9 3 ) 。亲水基质，如玻璃表面，不是附着 胞形成的诱导基质( h a m e re ta l ，1 9 8 8 ，l e ee ta l ，1 9 9 4 ) 。然而己发现附着胞也 可以在非诱导表面形成，因而基质的疏水性与附着胞形成之间没有绝对的相关性 ( x i a oe t a l ，1 9 9 4 ；j e l i t t oe t a l ，1 9 9 4 ) 。这种实验结果的差异可以通过试验条件的 差异，如菌株不同、玻璃表面种类不同等给予解释。尽管存在这些现象，还是认 为疏水聚合物( t e f l o n ，p o l y s t e r e n e ) 通过类似于水稻叶片表面的蜡质的作用激发 附着胞的形成( h a m e re l a l ，1 9 8 8 ；l e ee t a l ，1 9 9 4 ；g i l b e r te t a l ，1 9 9 6 ) ，而孢子附 着表面局部形态学结构特点对于附着胞的形成不起作用( d e a n ，1 9 9 7 ) 。 水稻叶片的表面物质也可以激活附着胞形成。玻璃载玻片表面覆盖水稻叶片 蜡质抽提物后可以诱导萌发的孢子在上面形成附着胞( u c h i y a m ae ta 1 ，1 9 9 0 ) 。 因此，水稻叶片角质层，同角质层单体一样，可能在附着胞发生中起诱导作用 ( g i l b e r te t a l ，1 9 9 6 ) 。研究发现稻瘟病菌孢子内存在自我抑制物质，这些物质抑 制孢子萌发和附着胞形成，而水稻叶片蜡质或其他植物蜡质、人工合成的n - c 2 2 脂肪酸、脂肪醇或烷烃等物质可以释放孢子内的抑制物质，从而诱导附着胞形成 ( h e g d e k o l a t t u k u d y , 1 9 9 7 ) 。 如果附着胞在非诱导表面萌发或在6 - 9 小时内没有被诱导形成附着胞，芽管 将不再分化形成附着胞( b e c k e r m a ne t a l ，1 9 9 6 ) 。因而，附着胞的形成是孢子萌 发早期一系列的发育途径调控的结果。附着胞形成的最初征兆是芽管生长停滞、 芽管顶点膨大和钩状体形成( h o w a r de ta 1 ，1 9 9 6 ) 。这些过程发生在孢子萌发后 4 6 小时内。然后，附着胞继续膨大，孢子和芽管的细胞质内容物转移到初始的 附着胞内。这些细胞质内容物包括储存在正在发育的附着胞中央大液泡的脂滴 ( t h i n e se ta l2 0 0 0 ；w e b e re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。然后，在附着胞和芽管之问形成隔膜。 随着附着胞成熟，除了与基质接触的部分以外，黑色素层沉积在附着胞周围的细 胞壁上。黑色素沉积结束后，没有黑色素沉积的部分没有任何细胞壁，称为附着 胞小孔( h o w a r de ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 在孢子萌发后不久，产生芽管的细胞进行一次有丝分裂。一个细胞核通过芽 管移动并进入到形成中的附着胞，并通过隔膜与芽管分离。而另一个细胞核目在 孢子内。在体外培养条件中，附着胞在孢子萌发4 - 8 小时内完成膨大过程。 附着胞的黑色素化是稻瘟病菌穿透水稻叶片表面必须的。使用抑制黑色素化 的化学物质，如三环唑( t r i c y e l a z o l e ) ，可以产生没有黑色素化的附着胞，而这 些附着胞没有相关功能，不能穿透水稻叶片表面( h o w a r de la l ，1 9 9 6 ) 。黑色素 基因缺失突变子还可以继续形成附着胞，但附着胞不能穿透水稻叶片。如果采用 注射接种，黑色素基因缺失突变子仍具有完全的致病性( c h u m l e ye ta 1 ，1 9 9 0 ) 。 在炭疽菌c o l l e t o t r i c h u ms p p 等真菌中，黑色素化也是附着胞具有完全致病性所 必需的( d e a n ，1 9 9 7 ；h e n s o n e ta l ，1 9 9 9 ) 。 侵染栓对水稻叶片的穿透由于附着胞产生巨大的膨压而得以完成。附着胞膨 压在孢子萌发后2 4 0 8 小时之间产生( h o w a r de ta 1 ，1 9 9 1 ) 。膨压只要稍微降低 就会阻止附着胞在人工表面或水稻叶片表面穿透( d e j o n ge t 以，1 9 9 7 ) 。测量结 果表明附着胞膨压达到8 0 m p a ，相当于4 0 倍汽车轮胎的压力( h o w a r de ta l ， 1 9 9 6 ) 。附着胞黑色素层的作用在于限制了细胞壁的渗透性，有利于细胞内渗透 物质的积累和膨压的产生( m o n e ye t a l ，1 9 9 6 ) 。甘油是一种可溶性物质，产生的 渗透势足以使附着胞产生巨大的膨压。在膨压产生过程中，甘油在细胞内累积浓 度超过3 m ( d e j o n g e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。黑色素基因缺失的突变子不能在细胞内积累甘 油，而用黑色素合成抑制剂三环唑处理的附着胞，细胞内也同样不能积累甘油 ( d e j o n g e ta 1 ，1 9 9 7 ) a 然后，附着胞产生的特殊的侵染菌丝( 侵染栓) 侵入植物并生长。在这一过 程中，关于稻瘟病菌胞外酶在稻瘟病菌侵染过程中的作用还有很多争议。研究发 现角质酶和木聚糖酶基因缺失突变子同野生型一样，还具有致病性( d e a n ，1 9 9 7 ； s w e i g a r de t a l ，1 9 9 2 ) 。但在这2 种突变子中检测到了残留的酶活性，因而认为突 变子内还存在同工酶，而同工酶在穿透过程中被激活和表达，并发挥其作用。 4 参与稻瘟病菌附着胞形成过程的基因 稻瘟病菌附着胞的形成包括二个可以明显区分的发育阶段。第一个阶段为孢 子的萌发阶段：孢子萌发产生一根短的芽管，再由芽管检测外界环境的诱导信号， 根据信号决定芽管继续发育为菌丝还是形成附着胞，因此也是附着胞形成的信号 识别阶段( b o u r e t t h o w a r d ，1 9 9 0 ；h o w a r d & v a l e n t ，1 9 9 6 ) 。第二个阶段为附着 胞的形成阶段：包括附着胞的形成、细胞壁分化、黑色素层的沉积、膨压产生。 目前已经从各种稻瘟病菌菌株中分离了许多参与稻瘟病菌感染过程、调节稻瘟病 菌发育途径的基因。其中有些基因影响附着胞的形成，另些基因影响附着胞的 功能，如穿透。 4 1 黑色素基因 黑色素层对于附着胞功能的重要性已经从遗传学上得到了证明。目前已经分 离了3 个参与稻瘟病菌黑色素合成的基因：a l b l ，r 乩j 和b u 丌( c h u m l e ye t a l ， 1 9 9 0 ) 。这些基因中任一个基因发生突变的突变予都不能合成黑色素，都产生没 有功能的附着胞，都没有致病性。但当直接注射接科r 到叶片组织中，都具有完全 的致病性( c h u m l e ye ta l ，1 9 9 0 ) 。a l b l 基因编码一个多聚乙酰合成酶，参与黑 色索合成的第一步反应。接着由r s 和b 理吖基因分别调节部分脱水和还原过程 ( h o w a r de ta l ，1 9 9 6 ) 。r s y l 基因编码s c y t a l o n e 脱水酶，对该酶已经作了大量研 究，确定了其三维结构( w a w r z a k ，e t a l ，1 9 9 9 ；j o r d a n ，e l a l ，1 9 9 9 ) 。b u f l 编码一 乖 n a d p h 依赖性的三羟基荼( t r i h y d r o x y n a p h t h a l e n e ) 还原酶。b 胚1 突变子没有 非致病性，但突变子还能够产t 2 1 5 _ s c y t a l o n e 。四羟基萘( t e t r a h y d r o x y n a p h t h a l e n e ) 还原酶是克隆到的第二种萘酚还原酶，b u f l 突变子通过四羟基萘还原酶( 4 h n r ) 途径合成s c y t a l o n e 。4 h n r 和b u w 双基因突变子不能产生s c y t a l o n e 。研究还发现 四羟基萘还原酶是杀真菌剂三环唑的主要作用靶蛋自( t h o m p s o n e l a l ，2 0 0 0 ) 。 4 2 孢子形成基因 通过筛选致病性减弱或消失的突变子，发现并鉴定了许多孢子形成基因。在 某些方面，影响孢子形成或孢子形态的基因也会影响附着胞形成和功能。 4 2 1s m 0 1 基因位点 对影响孢子形态的突变子的分析确定了个基因座位，s m 0 1 ( s p o r e m o r p h o l o g y ) ( h a m e re ta l ，1 9 8 9 ) 。s m o 一突变子形成异常结构的孢子、附着胞和 子囊。s m o 突变子可以在非诱导表面形成附着胞。突变子的致病性减弱，病斑的 数量和大小也减少或减小( h a m e re ta 1 ，1 9 9 0 ) 。由于发生与基因座位密切相关的 基因重排，通过位置克隆或互补的方法没有克隆到该基因。 4 2 2c o n 基因位点 通过化学或插入突变方法鉴定了6 个控制产孢途径各个步骤的基因：c o n i ， c o n 2 ，c o n 4 ，c o n 5 ，c o n 6 和c 0 7 ( s h i & l e u n g ，1 9 9 5 ) 。每一个基因的突 变子在产孢过程中或孢子形态发生中都具有异常特点的独特过程或结构。c o n 5 一 突变子不形成分生孢子梗，c o n 6 突变子产生大量的分生孢子梗但不产生孢子。 c o n l 、c o n 2 ，c 仞v 4 和c 0 7 基因座位的突变子产生具有特殊细胞形态的孢子。 c o n 2 一和c o n 4 突变子孢子的附着胞形成率比野生型的低，对水稻的致病性也弱。 c o n 。矛l c o n 7 - 突变子孢子具有异常的形态学结构，不能形成附着胞。因而，这些 突变子( 包括通过伤口接种感染) 没有致病性( s h i & l e u n g ，1 9 9 5 ；s h ie t a l ， 1 9 9 8 ) 。 4 2 3a p p 基因位点 通过对紫外突变子的鉴定，确定了影响附着胞形成的基因座位，a p p l ， a p p 2 ，爿p p 3 ( z h ue la l ，1 9 9 6 ) 。a p p l 。年l a p p 2 一在疏水表面上的附着胞形成能力减 弱。c a m p 或角质单体的添加可以陕复a p p 2 一孢子的产孢能力，但不能恢复a p p l 一 孢子的产孢能力。等位性试验( a l l e l i s mt e s t s ) 表明这些基因是分离的基因座位 其中a p p l 和a 肿3 紧密联结在一起。通过r f l p 分析，a p p l 定位在2 号染色体中央 ( z h ue t a l ，1 9 9 6 ) 。 附着胞形成缺失的自发突变子的研究发现了a p p j 基因( z h ue la l ，1 9 9 6 ) 。 与a p p l 和a p p 3 突变子的杂交显示爿p 尸5 是一个新的遗传座位( z h ue ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 a p p 5 突变子在疏水表面或水稻叶片上不形成附着胞，添加c a m p 或角质单体也 没有效果。不论喷雾接种或注射接种，a p p 5 突变子都没有致病性。 4 2 4a e 雕基因位点 二个稻瘟病菌菌株的杂交结果产生一株无致病性的突变子。对这一菌株的研 究发现了4 p f ，基因，这一基因对于孢子的形态和附着胞产生能力具有多种影响 ( s i l u ee ta l ，1 9 9 8 ) 。a p f l 基因缺失孢予在附着胞诱导表面不能产生附着胞，添 加c a m p 也不能恢复附着胞形成能力。因而，a p f 7 基因可能在c a m p 信号途径 下游起作用，或在一个附着胞分化的非c a m p 依赖性途径中起作用。而且，a p f l 缺失突变子不能通过注射到水稻叶鞘方式感染水稻，说明这一基因也是稻瘟病菌 侵入后生长需要的( s i l u ee t 以，1 9 9 8 ) 。 4 3 参与植物表面识别和信号传导过程的基因 稻瘟病菌通过与硬的、疏水的表面接触启动附着胞形成过程( l e ee t a l ，1 9 9 4 ； g i l b e r te ta l ，1 9 9 6 ) 。在非诱导表面，萌发的孢子除了末端膨大及形成钩状体( 早 期识别阶段) 外不能继续发育形成附着胞，芽管继续发育成为典型的营养菌丝体。 添加角质单体和蜡质1 1 6 一h e x a d e c a n e d i o l ，可以在非诱导型表面诱导附着胞 形成( g i l b e r te ta 1 ，1 9 9 6 ) 。添加c a m p 也可以在非诱导表面上激发萌发的孢子 形成附着胞( l e ee l a l ，1 9 9 3 ) 。因而，稻瘟病菌萌发孢子能够对环境因素作出反 应，先区别不同的表面，再进而形成附着胞( b e c k e r m a ne ta l ，1 9 9 6 ；l e ee ta 1 ， 1 9 9 3 ) 。疏水表面的识别引起一系列调节附着胞分化和功能特化的信号过程的发 生。目前已经克隆了一些在这一信号传递过程中起作用的基因，并对这些基因的 功能进行了遗传学和生化途径的分析。 4 3 1 识别表面的基因 p 掰i j ：通过基因插入突变( r e m i ) 法获得了致病性减弱的突变子，从中 筛选到了致病性缺陷的p t h l l 一突变子。p t h l l 一突变子在疏水表面上不能有效形成附 着胞，致病性也相应减弱。突变子的附着胞形成过程类似野生型孢子在疏水性表 面的生长过程，但仅仅表现为末端膨大及形成钩状体。添加角质单体，p t h l l 一突 变子不能在疏水表面形成附着胞，说明突变子不能识别附着胞诱导信号，而加入 外源c a m p 可以弥补其表型缺陷，说明p 掰 基因在c a m p 途径的上游起作 用( d e z w a a ne ta 1 1 9 9 9 ) 。 p 砰“基因编码一个具有多个跨膜区域的跨膜蛋白。该蛋白不仅位于细胞膜 上，还与细胞器，尤其是液泡相联系( d e z w a a ne ta l ，1 9 9 9 ) 。虽然没有直接的 证据，p t h l l p 感受的表面信号最有可能通过g t p 连接蛋白信号机制传至细胞内。 m p g l ：脚g j 是另一个参与疏水表面识别过程的基因。m p g l 在附着胞形 成早期或侵染过程的晚期表达量很高。通过基因替换获得的m p g l 突变子附着胞 形成能力和致病性减弱( t a l b o te ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 m p g l 基因编码一种真菌疏水蛋白，属于i 型真菌疏水蛋白，参与菌丝和 水稻叶表的互作( t a l b o t ，1 9 9 9 ) 。m p 9 1 。突变子的表面疏水性减弱，变得“容易潮 湿的”( t a l b o te ta l ，1 9 9 3 ) 。 护g 基因的缺失突变子形成附着胞的频率降低 8 0 以上，发病能力大大降低，但并非完全不致病，而是类似于不能有效形成附 着胞的稻瘟病菌株在水稻叶表接种的结果( t a l b o te ta 1 ，1 9 9 3 ) 。电子显微镜观 察发现突变子的孢子表面缺少野生型孢子普遍具有的小棒层( 两性薄膜层) 。小 棒层使真菌表面