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文档简介

PCR产物的回收,1,一、实验目的及背景,在生物技术实验中，反应获得的目的片段，酶切后所得特定的序列，分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它分开，这就需要有一套方法将目的从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等。,2,从凝胶中分离回收的方法,现在常用的技术有：电洗脱法低熔点琼脂糖凝胶法玻璃奶法快速纯化凝胶回收试剂盒,3,低熔点琼脂糖凝胶法,65oC琼脂糖凝胶熔点低熔点琼脂糖凝胶37oC液体,4,电洗脱法基本原理,将电泳分离后含目的片段的琼脂糖切割下来，装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的会从凝胶中电泳出进入透析袋中，由于分子量大，不能透过透析袋，从而保留于透析袋中。取出透析袋中含的溶液，进一步用酚、氯仿抽提纯化。,5,二、实验试剂及仪器,DNA回收试剂盒琼脂糖电泳仪、电泳槽紫外检测仪手术刀,6,三、实验步骤,切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入干净的离心管中称重，如凝胶重为100mg，可视为100l（100mg100l），以此类推。加入3倍体积溶液GSB，于55水浴融胶6-10min，间断（2-3min）混合，确保胶块完全融化，当胶完全融化后，观察溶液的颜色，如颜色为紫色，加入适量3M醋酸钠（pH5.2），调整颜色和GSB颜色相同（黄色）。（为增加DNA回收量，可加入1倍体积异丙醇于已融化的凝胶溶液中，如凝胶重为100mg，加入100l异丙醇）。待融化的凝胶溶液降至室温（高温时吸附柱结合DNA能力弱），加入吸附柱中静置1分钟，10,000g离心1分钟，弃流出液。,7,4.加入650l溶液WB，10,000g离心1分钟，弃流出液。5.10,000g离心1-2分钟，去除残留的WB。6.将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50lEB或去离子水（pH7.0）（EB或去离子水在60-70水浴预热，使用效果更好），室温静置1分钟。7.10,000g离心1分钟，洗脱D
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