毕业设计（论文）-转基因药用苜蓿理化指标测定.doc

石河子大学师范学院毕业设计（论文）转基因药用苜蓿理化指标测定摘要在离子束介导转基因药用苜蓿定性研究的基础上，本论文通过对 5号苜蓿和620 号苜蓿茎和根的多糖含量的测定，来分析转基因苜蓿多糖的含量相比于转基因之前多糖含量是否发生变化。实验结果表明，620 号苜蓿根的多糖含量相比于5 号苜蓿根的多糖含量有所减少，由原来的4.862% 减少到4.812% ，茎中多糖含量相对增加，由原来的0.886% 增加到1.105%。并且用x射线衍射仪对 5号和620 号苜蓿根和茎进行扫描，得出衍射图谱，转基因后苜蓿根和茎的x射线衍射峰值变化与普通苜蓿相比非常明显，说明转基因后的苜蓿结构发生了一定的变化。关 键 词：转基因，苜蓿，多糖，蒽酮-浓硫酸The index determination of Physiochemical on the Transgenic Medicinal AlfalfaABSTRACTIn the ion beam mediated gene transfer medicinal alfalfa qualitative study, based on the paper by 5 alfalfa and 620 alfalfa stems and roots of the polysaccharide content, to analyze transgenic alfalfa polysaccharide compared to GM before the polysaccharide content Does hair change. The results showed that 620 of the polysaccharide content of alfalfa roots compared to 5, the polysaccharide content of alfalfa roots decrease from about 4.862% to 4.812%, the relative increase of polysaccharide content in stems, increased from the original 0.886% to 1.105 %. And using x-ray diffraction 5 and 620 to scan the roots and stems of alfalfa, obtained diffraction patterns, transgenic alfalfa roots and stems after the x-diffraction peak changes and obvious than ordinary alfalfa, indicating genetically modified alfalfa after the structure some changes. KEY WORDS：transgenic, alfalfa, polysaccharide, anthraquinone-sulfuric acid 目录前言1第1章 本课题所涉及相关名词解释和国内外发展趋势21.1 转基因技术21.1.1 转基因技术简介21.1.2 几种常用的植物转基因方法21.1.3 几种常用的动物转基因方法31.1.4 转基因技术与传统技术的关系41.2 紫花苜蓿简介51.3 甘草51.4 多糖61.4.1 多糖简介61.4.2 多糖的功能及应用71.4.3 多糖的研究及前景71.5 光密度与吸光度81.5.1 光密度（optical density）（od值）81.5.2 吸光度（absorbance）（A值）91.6 本课题所涉及的问题在国内(外)研究现状及分析101.6.1 本课题在国内外研究现状及分析101.6.2 本课题所遇到的问题121.7 转基因苜蓿的应用前景及所遇到的问题121.7.1 转基因苜蓿的应用前景121.7.2 转基因苜蓿所遇到的问题13第2章 课题研究的目的和意义142.1 课题目的142.2 课题意义14第3章 实验设计153.1 实验材料、仪器与设备153.2 试验方法163.2.1 用x射线衍射仪分别扫描5号和620号苜蓿的茎和根163.2.2 样品处理与多糖的提取163.2.3 多糖的测定163.2.4 多糖提取液的测定183.3 实验结果与分析18第4章 结论与讨论214.1 结论214.1.1 多糖含量的分析214.1.2 对x射线的衍射图谱进行分析214.2 讨论224.3 展望23参考文献24致谢26IV前言转基因是运用科学手段从某种生物中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使其与另一种生物的基因进行重组，从而产生特定的具有优良遗传性状的物质。利用转基因技术可以改变动植物性状，培育新品种。也可以利用其它生物体培育出人类所需要的生物制品，用于医药、食品等方面。苜蓿是世界上最重要的豆科牧草，在我国已有2000年以上的栽培历史，全国各地都有种植，但主要分布在西北和华北地区。由于苜蓿中蛋白含量约占总干物质量的1720，与其它豆科牧草相比，其营养价值丰富，是一种极好的饲料作物。此外，苜蓿在环境改良、防止水土流失、提高土壤养分中也起着重要作用。苜蓿转基因研制进行得较早、较广泛，也较为成功。各种转化方法如农杆菌法、电击法、微注射法、基因枪法均有成功报道。转化内容也极为广泛，包括抗除草剂、抗病毒、抗虫害、抗寒性及品质改良等内容。多糖是生物大分子物质，广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中。到目前为止，已有几百种多糖从自然界中被分离出来。自20世纪 60 年代起，大量的研究均已证明，部分多糖具有多方面的生物活性和保健功能，可作为各种药物和保健品的有效成分，对于预防和治疗包括癌症在内的多种疾病都具有巨大的潜力。研究表明苜蓿多糖(Clover Polysaccharides ，CP)是具有生物活性的多糖之一，具有体外增强PHA，ConA，LPS和PWM诱导的淋巴细胞增殖反应，其作为苜蓿的重要营养及药用成分，目前的研究尚处于初级阶段。基于苜蓿多糖的药用价值，苜蓿多糖的提取逐渐被人们关注，所以本实验对苜蓿多糖的水提取法和多糖的测定进行了研究，并初步确立了苜蓿多糖的提取工艺，但由于苜蓿多糖提取时需要大量的水、电、乙醇，不仅浪费水、电资源，乙醇还会污染环境。所以本人在前人研究的基础上，对苜蓿多糖提取时间、温度、固液比以及次数作进一步的研究，确定苜蓿多糖提取的最佳优选组合，为生产实践提供理论依据。25第1章 本课题所涉及相关名词解释和国内外发展趋势1.1 转基因技术1.1.1 转基因技术简介转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的。常用的方法包括显微注射、基因枪、电破法、脂质体等。转基因最初用于研究基因的功能，即把外源基因导入受体生物体基因组内（一般为模式生物，如拟南芥或斑马鱼等），观察生物体表现出的性状，达到揭示基因功能的目的。人们常说的“遗传工程”、“基因工程”、“遗传转化”均为转基因的同义词。经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为“遗传修饰过的生物体”（Genetically modified organism，简称GMO）。 1974年，波兰遗传学家斯吉巴尔斯基（Waclaw Szybalski）称基因重组技术为合成生物学概念，1978年，诺贝尔医学奖颁给发现DNA 限制酶的纳森斯（Daniel Nathans）、亚伯（Werner Arber）与史密斯（Hamilton Smith）时，斯吉巴尔斯基在基因期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。转基因技术，包括外源基因的克隆、表达载体、受体细胞，以及转基因途径等，外源基因的人工合成技术、基因调控网络的人工设计发展，导致了21世纪的转基因技术将走向转基因系统生物技术。2000年国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程与转基因技术。1.1.2 几种常用的植物转基因方法遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可分成两大类，第一类需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，目前比较成熟的主要有花粉管通道法，花粉管通道法是我国科学家提出的。农杆菌介导转化法: 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。花粉管通道法: 在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。离子束介导法：离子束介导转基因的原理主要包括了3个方面，即通道作用、吸引作用和整合作用。首先，一定能量和剂量的离子束对植物细胞壁的溅射作用破坏细胞壁和细胞膜的结构，结果在局部产生刻蚀和穿孔，为外源遗传物质进入细胞提供微通道，这就是离子束对生物体的通道作用。其次，用于注入的荷电正离子降低了细胞表面的负电性(沉积作用)，从而减弱了对带负电的外源DNA 的静电斥力，从而促进了外源DNA的吸附和进入，即产生吸引作用。再者，离子束的直接和间接作用打断细胞内的染色体DNA结构，有利于外源遗传物质整合到受体基因组中，即整合作用。1.1.3 几种常用的动物转基因方法核显微注射法：核显微注射法是动物转基因技术中最常用的方法。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，注射的外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA片段。这种方法的缺点是效率低、位置效应（外源基因插入位点随机性）造成的表达结果的不确定性、动物利用率低等，在反刍动物中还存在着繁殖周期长，有较强的时间限制、需要大量的供体和受体动物等特点。详细步骤：在显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1-2微米）直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。用这种方法生产的动物约有十分之一是整合外源基因的转基因动物。精子介导的基因转移：精子介导的基因转移是把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力。然后，用携带有外源基因的精子给发情母畜授精。在母畜所生的后代中，就有一定比例的动物是整合外源基因的转基因动物。同显微注射法相比，精子介导的基因转移有两个优点：首先是它的成本很低，只有显微注射法成本的十分之一。其次，由于它不涉及对动物进行处理，因此，可以用生产牛群或羊群进行实验，以保证每次实验都能够获得成功。核移植转基因法：体细胞核移植是近年来新出现的一种转基因技术。该方法是先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞细胞核移植到受体细胞去核卵母细胞，构成重建胚，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到转基因的克隆动物。体细胞核移植法：先在体外培养的体细胞中进行基因导入，筛选获得带转基因的细胞。然后，将带转基因体细胞核移植到去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎。重构胚胎经移植到母体中，产生的仔畜百分之百是转基因动物。1.1.4 转基因技术与传统技术的关系 自从人类耕种作物以来，我们的祖先就从未停止过作物的遗传改良。过去的几千年里农作物改良的方式主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然的方式来积累优良基因。遗传学创立后近百年的动植物育种则是采用人工杂交的方法，进行优良基因的重组和外源基因的导入而实现遗传改良。因此，转基因技术与传统技术是一脉相承的，其本质都是通过获得优良基因进行遗传改良。但在基因转移的范围和效率上，转基因技术与传统育种技术有两点重要区别。第一，传统技术一般只能在生物种内个体间实现基因转移，而转基因技术所转移的基因则不受生物体间亲缘关系的限制。第二，传统的杂交和选择技术一般是在生物个体水平上进行，操作对象是整个基因组，所转移的是大量的基因，不可能准确地对某个基因进行操作和选择，对后代的表现预见性较差。而转基因技术所操作和转移的一般是经过明确定义的基因，功能清楚，后代表现可准确预期。因此，转基因技术是对传统技术的发展和补充。将两者紧密结合，可相得益彰，大大地提高动植物品种改良的效率。1.2 紫花苜蓿简介紫花苜蓿（Medicago sativa L）系多年生密集栽培型异花授粉豆科牧草，在我国种植的历史悠久，野生和栽培的地区十分广泛，在全世界苜蓿种植面积上，我国位居第五位。由于我国地区辽阔，气候复杂多变，产生了许多地方品系。紫花苜蓿以其产量高、品质好、营养丰富、适口性好而著称，有“牧草之王”的美称，并且具有抗寒、耐寒、耐盐碱、抗逆性强，加之根系发达、再生性强、生长旺盛、叶面覆盖面积大等生物学特点，有利于对不同类型的土地的开发、利用和整治。除了生态和经济方面的重要性之外，紫花苜蓿的倍性水平可随意操作，组织培养系统较为完善，易于营养繁殖，再生分化植株能力较强，这就为外植体的的诱导、体细胞的杂交、原生质融合、基因转移等的研究提供了便利。紫花苜蓿染色体基数为，倍性水平为四倍体，核基因型为“1A型”，核基因组大小为1106kbp，其中36%的碱基对位单一序列。目前在苜蓿中表达并稳定遗传的外援基因有：抗除草剂基因、ALMYCP基因、含硫氨基酸基因、人类干扰素基因、大麦顺反血红素基因、白杨木caffeoy1COA30甲级转氨酶基因、防止分支杆菌和结核菌感染的esat6和mpt64基因等。我国已经启动的“林草转基因重大研究”项目中，已将苜蓿作为重要的试验材料之一。1.3 甘草甘草，系豆科多年生草本植物。深秋，荚果裂开，籽粒随风散布在大地上，天然繁殖。茎挺拔直立；根如圆柱，直径三四厘米，大的五六厘米，长一米多，最长者达三四米。甘草多生长在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠边缘和黄土丘陵地带，在引黄灌区的田野和河滩地里也易于繁殖。它适应性强，抗逆性强，不愧是植物界抗干旱的能手，斗风沙的先锋。甘草广泛应用于食品工业，精制糖果、蜜饯和口香糖。甘草浸膏是制造巧克力的乳化剂，还能增加啤酒的酒味及香味，提高黑啤酒的稠度和色泽，制作某些软性饮料和甜酒；香烟矫味。在化工、印染工业中，甘草也广有用途。近期报道，对甘草中的甘草甜素进行研究，其可以抑制爱滋病毒斑的形成和感染细胞的变化，从而抑制爱滋病毒的繁殖，其抑制率达98%，原苏联土库曼尼亚爱滋病防治中心等单位，从甘草中分离并配制成一种有效抑制HIV繁衍的药物尼格利津，专家认为其结构与美国研制的叠氮脱氧胸苷相似，但它并无副作用，且临床证明是一种极有效的治疗爱滋病的药物。连云港天晴制药厂生产的克艾可系中药甘草等提取物制成的口服片剂，用于60例爱滋病患者的治疗，取得了改善症状，体症及提高患者免疫功能的作用，同时该制剂的作用得到药理实验的证明。甘草的毒副作用较小，但若较长时间大量服用，可引起水肿，血压升高及血钾减少等症状并有脘腹胀满，纳呆等消化障碍，如能适当掌握用药剂量，上述情况是完全可以避免的。综上所述，甘草的作用相当广泛，从古至今，在临床应用中表现出各种不同的防治作用，随着现代科学的发展，运用生物学、化学、药理学等学科技术，深入研究甘草的药用价值和作用机理，这样更有利于甘草的开发和临床上的广泛应用。1.4 多糖1.4.1 多糖简介多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质。其通式为（）x。多糖（polysaccharide）凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均称为多糖。有由一种类型的单糖组成的葡萄糖、甘露聚糖、半乳聚糖等（通常在英语的单糖词干上加上an这个词尾），由二种以上的单糖组成的杂多糖（hetero polysaccharide），含有氨基糖的葡糖胺葡聚糖等，在化学结构上实属多种多样。就分子量而论，有从0.5万个分子组成的到超过106个的多糖。由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖才称为多糖。比10个少的短链的称为寡糖。不过，就糖链而论即使是寡糖，在寡糖上结合了蛋白质和脂类的，就整个分子而论，如果是属于高分子，则从广义上来看也属于多糖，因此特称为复合多糖（conjugated polysaccharide，complex poly-saccharide）或复合糖质（glycoc-onjugate）（糖蛋白、糖脂类、蛋白多糖）。多糖的生物学功能，通常具有贮藏生物能如：淀粉、糖原、菊粉（inulin）和支持结构如：纤维素、几丁质（chitin）、粘多糖的作用。但是，细胞膜和细胞壁的多糖成分不仅是支持物质，而且还直接参与细胞的分裂过程，在许多情况下成为细胞和细胞，细胞和病毒，细胞和抗体等相互识别结构的活性部位。生物合成通常是由结合在细胞膜质（高尔基体、原生质膜、粗面内质网等）上的转糖基酶进行。利用各种糖苷作为前体。在细菌细胞壁和聚多糖的生物合成中，多萜醇衍生物（特别是称为细菌萜醇的）作为中间体参与反应，关于动、植物某些多糖的合成也有类似的中间体的报道。另一方面，在分解过程中，有对糖链的糖排列次序和键的性质有特异性的多种糖苷酶参与。概述多糖广泛存在于植物、微生物（细菌和真菌）和海藻中，来源很广。其中研究得较早且最多的，是从细菌中得到的各种荚膜多糖，它在医药上主要用于疫苗。1984年，苏联人在荷兰召开的第十二次国际碳水化合物讨论会上报道了用全合成特定结构的荚膜多糖作疫苗，受到与会者的极大兴趣。尔后，有关真菌多糖的研究既深又广，如酵母菌多糖、食用菌多糖，特别是食用菌多糖的研究，报道的频率是相当的高，其中以香菇多糖研究得较清楚。另外，植物多糖的开发也倍受人们的青睐，由于我国是中药的起源之地，而糖类是中药材中普遍存在的成分，在对各种中药材的化学成分研究的过程中，人们都少不了对其中多糖的关注。1.4.2 多糖的功能及应用近几十年来，人们发现从植物中提取的多糖具有非常重要与特殊的生理活性。许多多糖参与了生命活动中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能，如参与生物体的免疫调节功能，降血糖、降血脂、抗炎、抗疲劳、抗衰老等，人们已成功地从近百种植物中提取出了多糖并广泛地用于医药和保健食品的研究和开发中。植物多糖研究得比较深入的是稻草多糖、麦秸多糖、竹多糖、黄芪多糖、刺五加多糖。1.4.3 多糖的研究及前景多糖是一类重要的生物活性物质，参与了细胞的各种生命现象的调节，可作为免疫促进剂，能控制细胞的分裂和分化，调节细胞的生长和衰老。对肿瘤细胞起抑制作用，同时对正常细胞无毒害作用。因此，多糖被视为理想的免疫调节剂，将成为新型的抗癌，抗艾滋病用药，作为生物医药产品具有广阔的市场前景。我国对于多糖的研究始于70年代，近年来发展很快，形成了空前迅速的发展趋势。研究的对象包括植物、动物、真菌、细菌、地衣、藻类、花粉多糖等，研究的方法涉及各种化学方法及仪器分析方法，研究的范围涉及多糖的提取纯化和分级、理化性质、结构分析、化学变性、免疫学、药理学以及治疗应用等方面。总之，植物多糖具有许多生理活性和保健功能。植物来源的多糖类化合物由于它们的独特功能和很低的毒性，随着植物多糖研究的不断深入，其在临床应用和保健食品开发上将有很广阔的前景。1.5 光密度与吸光度1.5.1 光密度（optical density）（od值）光密度定义：光密度（OD）optical density定义为材料遮光能力的表征。它用透光镜测量，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里出现的专有名词。光密度没有量纲单位，是一个对数值，光密度是入射光与透射光比值的对数或者说是光线透过率倒数的对数。科技编辑大辞典对光密度的定义是：入射光强度与透射光强度之比值的常用对数值。专业书籍则这样解释“吸光度”：入射光和透射光的透过率之比值的常用对数值，也称光密度。分析可见，两个概念其实是一致的，“光密度”就是“吸光度”，且用“光密度”符合国家标准，更规范。GB310261993中对所谓“吸光度”的标准量名称是“光密度”，量符号是D（lamda）-节选“光密度”标准名称、量符号及其使用规范探讨。OD是optical density（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里出现的专有名词，一般人理解较困难。具体检测涉及到很多物理方面的知识；只须知道是光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量。特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。检测单位用OD值表示，OD是optical density（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，（11），其中trans为检测物的透光值。光密度的表示及作用：投射到影像上光强度（ID）与透过影像光强度（I）的比值的常用对数，即透光率（T）倒数的常用对数，光密度用D表示。实质上就是吸光度。1971年IUPAC（国际纯化学和应用化学联合会）提议取消这个名词，在发射光谱分析中用黑度，在光吸收分析中用吸光度来表示。在生物学上，常用来做免疫组化检查。通常病灶处染色深，光密度大。1.5.2 吸光度（absorbance）（A值）吸光度定义：吸光度，absorbance，是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等。吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。吸光度用A表示。（12），其中a为吸光系数，单位L/（gcm），b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ，c为溶液浓度，单位g/L，影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量。此外，温度通过影响c，而影响A。吸光度的表示及作用：吸光度用A表示，其定量关系可用郎伯一比耳定律，（13），式中I为透射光强度；I0为发射光强度；T为透射比；L为光通过长度，C是被测样品浓度；所以在一定条件下，测定了吸光度就可以检测出待测溶液的浓度。测定吸光度的仪器主要有各种分光光度计（可见光的、红外的、紫外的、荧光的）。利用郎伯一比耳定律来测定溶液浓度和进行元素分析的仪器还有光谱仪（红外线、微波、紫外线、x射线），其中原子类的光谱仪又分为原子发射光谱仪和原子吸收光谱仪，原子发射光谱仪根据激发机理不同，原子发射光谱有3个种类，1.原子的核外光学电子在受热能和电能激发而发射的光谱，通常所称的原子发射光谱法是指以电弧、电火花和电火焰（如ICP等）为激发光源来得到原子光谱的分析方法。以化学火焰为激发光源来得到原子发射光谱的，专称为火焰光度法。2.原子核外光学电子受到光能激发而发射的光谱，称为原子荧光（见原子荧光光谱分析）。3.原子受到x射线光子或其他微观粒子激发使内层电子电离而出现空穴，较外层的电子跃迁到空穴，同时产生次级x射线即x射线荧光（见x射线荧光光谱分析）。火焰原子吸收分光光度法测定大多数金属元素的相对灵敏度为g/ml，非火焰原子吸收分光光度法的绝对灵敏度为g。这是由于原子吸收分光光度法测定的是占原子总数99以上的基态原子，而原子发射光谱测定的是占原子总数不到1的激发态原子，所以前者的灵敏度和准确度比后者高的多。1.6 本课题所涉及的问题在国内(外)研究现状及分析1.6.1 本课题在国内外研究现状及分析目前，随着生物技术的不断进步，国外对多糖的提取多采用超滤膜分离技术，并可以应用于工业生产。超滤法：采用截留分子量为1万道尔顿的内压式聚偏氟乙烯（PVDF）中空纤维超滤膜提取多糖，有效地使蛋白质和多糖杂质含量分别下降85.5%和89.6%。膜分离是指以选择性透过膜为分离介质。当膜两侧存在某种推动力（如压差、浓度差、电位差等）时，原料侧组分可选择透过膜，从而达到分离提纯的过程。20 世纪 60 年代研制成功了高渗透性的膜后，超滤技术迅速发展起来。膜分离技术被公认为现代分离技术领域中最先进的技术之一，已广泛应用于化工、电子、环保、医药等领域。超滤（Ultrafiltration，UF）是膜分离科学的重要分支，其原理是以选择性透过膜为分离介质，在外界压力作用下，原料组分选择性地透过膜，以达到分离、提纯的目的。将超滤膜用于多糖这种生物活性物质的分离，不损害活性、分离效率高、能耗低、设备简单、可连续生产、无污染等。所以20 世纪 80年代中后期至 90 年代初，超滤法被用于多糖的分离，为多糖的应用带来新的发展前景。国内外对苜蓿多糖的提取工艺研究比较深入，通常用水提取乙醇沉淀的方法，得到粗多糖。苜蓿水溶性多糖提取工艺流程：苜蓿草按样品要求固液比调配蒸馏水沸水浴浸提抽滤滤液醇析离心得到粗多糖沉淀复溶于蒸馏水脱蛋白纯化醇析得到多糖。杨丽娥等1采用水提取乙醇沉淀的方法对苜蓿多糖提取、纯化条件进行优化研究，初步确立了较为合理的提取工艺。其研究结果显示，提取苜蓿多糖的最佳条件为100 oC，水浴浸提2h，固液比为1 ：20，醇析浓度为80%，粗多糖脱蛋白时，V 氯仿与V 正丁醇之比为4 ：1 ，经脱蛋白处理后多糖浸出率可达7.84%。张东杰等2采用水提取乙醇沉淀的方法对苜蓿多糖提取，纯化条件进行优化研究，初步确立了较为合理的提取工艺。其研究结果显示，提取苜蓿多糖的最佳条件为100 oC，水浴浸提1h，固液比为1 ：40，醇析浓度为95%，粗多糖脱蛋白时，V氯仿与V正丁醇之比5 ：1，经脱蛋白处理后多糖浸出率可达6.8%。苏兰利等3测得提取苜蓿多糖的最佳条件为浸提温度95 oC，浸提次数2次，固液比例1 ：30，浸提时间2h，其多糖得率为1.77%。杨丽娥，胡雪华等4测得提取苜蓿多糖最佳条件醇析浓度为80%乙醇，料水比为1 ：30，煮沸浸提2h。但从简化操作，提高经济效益出发，生产上可选用A，BZC，即醇析浓度为80%乙醇，料水比为1 ：20，煮沸浸提时间1h。庞凌云等5测得苜蓿多糖最佳提取条件为浸提时间1h、温度100、固液比1 ：50、浸提3次，多糖提取率为6.56。水煮法目前已经用于工业生产，醇提法：例如苜蓿草粉30g加200ml回收乙醇搅拌，1h后抽滤，在滤渣中加入50%乙醇300ml搅拌浸提1h后再抽滤，在滤液中加入0.5L以上的无水乙醇并置于5冰箱中过夜来醇析滤液中的多糖。减压抽滤，分别用100ml的无水乙醚和丙酮洗涤滤渣，得到黄白色的多糖粗品，置干燥皿中恒重保存。用醇提法和用超滤法提取苜蓿多糖，尽管醇提法多糖百分含量14.9%与超滤法样品中多糖百分含量15.0%无明显差异。从粗多糖的最终得率来看，超滤法的多糖平均最终得率0.36g要明显高于醇提法的平均最终得率0.21g。但是超滤法的粗多糖得率波动范围较大，而醇提法粗多糖得率较为稳定。水煮法优于醇提法，但是水煮法的粗多糖得率波动范围较大，极差：8.6%-6.97%：1.63%，其RSD（%）：6.93%，而醇提法粗多糖得率较为稳定，其极差：4.88%-4.65%：0.23%，RSD（%）：1.46%。分析其原因可能有二，一是实验中采用200目尼龙网布八层人工加压取汁液，此操作必然会造成一定偶然误差；二是水煮过程中水分散失，用间断补加水来维持定容，这不仅在体积，而且在温度上也造成波动，因而也导致误差。通过苜蓿水溶性多糖浸提单因素条件的研究，利用多糖溶于水或酸、碱溶液而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特点提取多糖，但由于多糖在酸碱中易降解。所以利用热水法提取水溶性多糖。总的来说，如果工业化生产，从经济成本的角度，应该采用水煮法。这是因为相对于水煮法，醇提法要多消耗乙醇溶剂。另外，从生产的安全性出发，考虑到过多的有机溶剂不仅对操作工人的身体有害，而且还由于有机溶剂的易燃性，都应该尽量减少有机溶剂的使用。多糖所用的测定方法主要分为滴定法与比色法，植物多糖的测定方法主要有比色法、滴定法和液相色谱法，其中比色法是目前最常用的方法，包括蒽酮一硫酸法和苯酚一硫酸法。滴定法的测定结果偏低，与其特异性不高有关，而葸酮一硫酸法的测定结果偏高，苯酚一硫酸法目前被普遍认为是准确性较好、灵敏度较高、适用面较广的理想方法。但苯酚一硫酸法也有缺陷，因其显色物质为橙黄色，而如果样品液也为橙黄色，则比色极易受到干扰使实测值偏高，同时苯酚容易氧化，见光或遇氧即逐渐氧化成淡红色，因此，在测定中应该避光或操作迅速，只有在稳定和熟练的操作情况下才能获得理想的重现性。1.6.2 本课题所遇到的问题苜蓿芽多糖提取液呈黄色，由于苯酚一硫酸法与多糖显色反应后液体也呈黄色，因此提取液本身的颜色在相应波长有一定的吸光度，易导致测定结果高于实际值，这可能是苯酚一硫酸法测定结果高于蒽酮一硫酸法的原因。因此，采用蒽酮一硫酸法测定的苜蓿多糖含量可能更接近于实际值。要提高苯酚一硫酸法测定苜蓿芽多糖含量的准确度，建议在显色反应前进行脱色，但这又使多糖的提取方法复杂化。而且脱色对多糖的获得也会有影响，使多糖的得取有所损失。 蒽酮一硫酸法测定苜蓿芽多糖含量准确性较高，但该测定方法条件要求高，尤其是蒽酮溶液要现配现用，如果放置时间超过2h，可能导致测定结果偏高。经测定苜蓿芽粗蛋白含量达32%，采用上述2种方法测定苜蓿芽多糖含量必须除蛋白，因为蛋白在相应波长范围内有一定的吸光度，尤其对蒽酮一硫酸法影响更大。本研究采用Sevag法多次萃取除蛋白，取得了较好的效果，因此在具有高蛋白含量样品的多糖测定中，应增加萃取次数。 有关多糖结构的研究很少。1.7 转基因苜蓿的应用前景及所遇到的问题1.7.1 转基因苜蓿的应用前景苜蓿具有产量高、品质好、各种家畜喜食等优点，可以利用苜蓿作为转基因受体来研究草食牲畜的植物食用疫苗，推而广之，苜蓿被认为是“最有可能生产重组分子的植物体系”，因此除了为动物提供健康饲料外，转基因苜蓿还将成为大量生产目的化合物的生物反应平台。由于牧草育种可以间接减轻发展畜牧业对天然草地的压力，所以发展转基因苜蓿也有一定的生态效益。对于苜蓿育种工作本身，可以导入特定的基因产生雄性不育性，通过与不同的遗传背景回交可以获得很好的雄不育植株。综观目前全球转基因植物的发展趋势，转基因作物的种植规模将进一步扩大。研究主要是针对多基因控制的、非生物性的胁迫性状，如抗旱、耐盐和耐铝。转多基因的研究也会加快，以聚集通过传统手段无法聚集的优良性状。与“投入性状”（input trait）相比，提高食品与饲料品质和营养价值的“产出性状”（output trait）将变得更加重要。1.7.2 转基因苜蓿所遇到的问题转基因苜蓿具有潜在风险，对生态环境的威胁。转基因生物对生态环境的威胁主要表现在可能使生物多样性降低，破坏生态平衡。对牲畜健康的影响。转基因操作中不可避免地要采用抗生素标记基因，经食用后可能使牲畜对很多抗生素产生抗性。此外转基因苜蓿作为饲料进入牲畜体内可能产生毒性或过敏反应。转基因植物是我国生物安全管理的重点之一。作为转基因生物体释放到自然环境中发展最快的一个方面，急需对其本身的遗传稳定性，所转基因及其产物对非目标生物的影响，目标生物对所转基因及其产物耐受性的变异情况等，做出客观评价，做到及时预测、持续跟踪、严格监测，并采取必要的隔离措施。其产品作为饲料或食品应用前，需进行严格的安全性试验。第2章 课题研究的目的和意义2.1 课题目的本实验的目的是提取和测定转基因药用苜蓿和普通苜蓿中的多糖，分析多糖含量的变化。利用x射线衍射仪初步探究转基因后苜蓿结构是否发生了变化。2.2 课题意义多糖是由单糖连接而成的多聚物，人们对多糖的研究已经有很长时间的历史，对多糖的初始研究可追溯到1936年Shear对多糖抗肿瘤活性的发现，至20世纪50年代，陆续发现一些真菌多糖和高等植物多糖具有明显的抑瘤活性。最近又发现许多中药多糖还具有降血糖作用。70年代以来，科学家们发现多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，广泛存在于动物、植物、和微生物细胞壁中，是生物体内除核酸和蛋白质以外的又一类重要的生物分子。科学研究已经确认糖类物质具有许多生物活性，包括抗肿瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，而且对机体几乎无毒副作用。中药多糖因具有增强机体免疫功能及抗肿瘤降血糖等药理作用，而且几乎没有毒性与副作用，因此引起国内外药理学家、生物学家和化学家们的关注。本文通过研究紫花苜蓿和转基因苜蓿中的多糖含量，分析甘草基因组在苜蓿中的遗传转化。转基因后苜蓿中成分的变化能够反映出转基因后苜蓿基因组的前后变化。通过x射线衍射仪的扫描来分析转基因前后苜蓿的结构是否发生变化。第3章 实验设计3.1 实验材料、仪器与设备材料：5号苜蓿茎和根，620号苜蓿茎和根。5号苜蓿为加拿大阿尔岗金紫花苜蓿1代，620号为氩离子注入介导甘草总DNA到加拿大阿尔岗金紫花苜蓿1代茎和根的转基因苜蓿，材料要求干燥并均用钵体研磨。其单株中生物碱类，黄酮类，皂苷类物质定性检测结果如下：表1. 苜蓿单株中生物碱类，黄酮类，皂苷类物质定性检测结果记录表编号磷钼酸反应碘化铋钾反应铜铬盐反应浓盐酸反应盐酸镁粉反应四氢硼钠反应醋酸浓硫酸反应颜色沉淀颜色沉淀醚层水层5号茎浅绿浅绿（黄）绿5号根淡蓝+淡黄+-蓝紫620号茎黄绿（褐）浅黄黄绿+620号根淡黄+淡黄+深蓝仪器设备：电子天平，UV751GD紫外/可见分光光度计紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；1014A型电热鼔风干燥箱，上海梅香仪器有限公司；80-2离心机，上海技术器械厂；恒温水浴锅。试剂：葡萄糖标准品（A. R.），无水乙醇（A. R.），蒽酮（A. R.），浓硫酸（A. R.），氯仿（A. R.），正丁醇（A. R.），实验用水为蒸馏水。3.2 试验方法3.2.1 用x射线衍射仪分别扫描5号和620号苜蓿的茎和根扫描范围，步长，电压36KV，管电流I=20mA。3.2.2 样品处理与多糖的提取1. 实验所需试剂的配置(1) 萃取液的配置，将氯仿与正丁醇按4 ：1的比率混合。 (2) 蒽酮浓硫酸溶液的配置，取0.2g置于100ml容量瓶中，加浓硫酸溶解，定容配用。2. 提取方法 (1) 用电子天平分别称取5号茎2.5 g，根2.5 g，620号茎2.174 g，根1.348 g分别置于100ml试管中，加入40倍于样品质量的蒸馏水，将试管置于100水浴锅中水浴3h。 (2) 在空气中自然冷却，过滤，滤液待用，残渣重新转移到试管中加入适量的水，再次水浴1h，过滤，滤液和前次合并，残渣弃去。 (3) 将滤液加热浓缩至10ml，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀12h。 (4) 将醇析液置于4000r/min离心机中离心10min，得沉淀并用无水乙醇洗涤3次，得粗多糖，沉淀加热水溶解得样品提取液。 (5) 用Sevag法脱蛋白，将氯仿与正丁醇 混合液与样品提取液按1 ：1用分液漏斗萃取30min，反复3次。 (6) 将滤液转移至100ml容量瓶中定容，得多糖提取液。3.2.3 多糖的测定标准曲线的制备 (1) 准确称取100mg葡萄糖干燥至恒重，在100ml容量瓶中定容，葡萄糖的标准浓度为1mg/ml。(2) 取六个50ml容量瓶标号16号，吸取葡萄糖标准溶液按表2配置系列标准溶液。分别吸取5ml到16号具塞试管中。表2.葡萄糖系列标准溶液的配制试管编号123456浓度(mg/ml)0.004.008.0012.0016.0020.00葡萄糖标准溶液（ml）0.001.002.003.004.005.00加水量（ml）50.0049.0048.0047.0046.0045.00合计（ml）50.0050.0050.0050.0050.0050.00(3) 将16号试管在冰水浴中加入蒽酮浓硫酸溶液4.00ml，混匀，迅速放入冰水浴中冷却5min，沸水浴10min，自来水冷却并放冷至室温。(4) 用紫外分光光度计在620nm处比色，测得吸光度A值。测量结果如表3：表3.不同浓度下葡萄糖对照品的浓度与吸光度试管编号浓度（mg/ml）A1A2A3A平均10.000.1010.0660.0710.07924.000.1630.1430.1330.14638.000.2280.2130.2090.217412.000.2710.2720.2740.272516.000.3610.3470.3760.361620.000.4470.4200.4350.434根据表3做出曲线图，如图1：葡萄糖溶液浓度-吸光度曲线y = 0.0185x + 0.0627R2=0.9947R=0.9973-0.1000.0000.1000.2000.3000.4000.500-5.005.0010.0015.0020.0025.00葡萄糖溶液浓度（mg/ml)吸光度图1 葡萄糖溶液浓度吸光度曲线3.2.4 多糖提取液的测定分别取多糖提取液2ml、蒸馏水8ml于试管中，在冰水浴加入4ml蒽酮浓硫酸溶液，混匀，沸水浴10min，冷却后用分光光度计测定620nm波长处的吸光度。3.3 实验结果与分析表4.实验用苜蓿的吸光度吸光度5号根5号茎620号根620号茎A11.0510.2660.9860.294A21.0510.2530.9900.285A31.0510.2520.9910.297A平均1.0510.2570.9890.292由图1曲线方程和表4的数据可得出多糖溶液的浓度，根据公式：（31），其中C样标准曲线上得出的样品浓度；V样品溶液的体积；B稀释倍数；W样样品重量；0.91苜蓿多糖的校正系数。得到结果为表5：表5.多糖的含量苜蓿样品5号根5号茎620号根620号茎含量4.862 %0.886 %4.812 %1.105 %不确定度0.0060.0230.0150.004相对误差005.732 %16.74 %多糖回收率的测定：将已知浓度的多糖提取液加入2、4、6mg的标准品。测定吸光度，计算回收率。结果为表6：表6.葡萄糖回收率浓度(mg/mL)A1A2A3A葡萄糖得量回收率平均回收率20.1050.1100.1140.10961.96099.04 %99.43%40.1510.1460.1430.1463.87599.45 %60.1870.1820.1790.1835.94399.82 %5号苜蓿和620号苜蓿x射线衍射图谱对比图2. 苜蓿5号根和620号根的x射线衍射图谱对比图3. 苜蓿5号茎和620号茎的x射线衍射图谱对比第4章 结论与讨论4.1 结论4.1.1 多糖含量的分析表7. 苜蓿样品中多糖的含量苜蓿样品5号根5号茎620号根620号茎含量4.862 %0.886 %4.812 %1.105 %通过表7的数据表明，转基因后的620号苜蓿根部的多糖含量比5 号的苜蓿根部多糖含量要稍微低一点，但是茎中多糖含量提高了一些。4.1.2 对X射线的衍射图谱进行分析结果如下表：表8. 5号苜蓿和620号苜蓿根的x射线衍射图谱峰值对比5号根28.7438.93422.22922.65122.884I，cps675.0625600667.0631.0()10.10539.88973.99593.92233.8830.620号根28.8410.1517.2822.1626.76I，cps6294109061052750()9.99498.70485.12664.00793.3289|0.11041.18491.13070.08560.5541相对误差1.09%11.9%28.2%2.18%14.3%表9. 5号苜蓿和620号苜蓿茎的x射线衍射图谱峰值对比5号