（分析化学专业论文）重力驱动微流控芯片流动注射分析系统的研究.pdf

摘要 摘要 本论文建立了一种基于微流控芯片的无泵无阀的重力驱动门式进样流动注 射分析系统。系统采用重力( 液位差) 提供试样注射、试样与试剂混合、传输 和反应的驱动力，只需要控制一个液池的移动就能实现芯片上简单有效的门式 进样，系统的整体结构和操作得以大大简化。该芯片上还集成加工了液芯波导 长光程光度检测系统，以提高系统的检测灵敏度。该系统被应用于亚硝酸盐的 吸收光度检测。在优化的实验条件下，采用1 秒的进样时间，可获得1 5 71 1 l 的 进样体积。系统对亚硝酸盐测定的重现性为0 3 ( r s d ，n = 1 7 ) ，线性范围是 o 1 2 0m g l ，检测限为0 1 9m g l ，最高分析通量达1 1 3 样小时。该系统具有结 构简单、易于操作、集成化程度高、加工成本低、利于普及等优点。 微流控分析系统发展的重要瓶颈之一是宏观体系与芯片微通道的接口问 题，开发自动化的试样更换方法，对于微流控分析系统的实用化至关重要。以 上工作基础上，本文通过在玻璃芯片上加工出两个一体化取样探针，耦合缺口 管自动连续试样引入技术，实现了高效快速的试样注入和试样更换，可用于同 时或分别更换试样和试剂。采用色素为模型样品对系统的性能进行了初步考察。 系统进样重现性为2 5 ( r s d ) 。该系统的加工方法较为简单，试样试剂消耗 少，系统集成度较高，易于实现微型化，有望应用于多试样多指标的分析检测。 关键词：微流控芯片，流动注射分析，门式进样，重力驱动，试样引入，一体 化探针 a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h i sw o r k ，as i m p l ea n de f f i c i e n tc h i p - b a s e df i as y s t e mw i t h o u tt h en e e do f m e c h a n i c a lp u m pa n dv a l v ew a sd e v e l o p e d t h ep r e s e n ts y s t e ms u p p l i e das i m p l e o p e r a t i o na p p r o a c hf o rs a m p l ei n j e c t i o ni nm i c r o c h i pu n d e rg a t e di n j e c t i o nm o d eb y c h a n g i n gt h ev e r t i c a lp o s i t i o no ft h ew a s t er e s e r v o i r al i q u i d c o r ew a v e g u i d e a b s o r b a n c ed e t e c t i o ns y s t e mw a s i n t e g r a t e dt ot h em i c r o c h i p t oa c h i e v eh i g hs e n s i t i v e d e t e c t i o n t h ep e r f o r m a n c eo ft h es y s t e mw a st e s t e di nt h ed e t e r m i n a t i o no fs o d i u m n i t r i t eb a s e do ns a l t z m a nr e a c t i o nu n d e ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s ap r e c i s i o no f0 3 ( r s d ，n = 17 ) w a sa c h i e v e du s i n g10m g l n 0 2 】厶s o l u t i o n t h es a m p l ei n j e c t i o n v o l u m ef o re a c hc y c l ew a s1 57n lw i t has a m p l i n gt i m eo f1s t h ea n a l y s i s t h r o u g h p u tw a sl13 h al i n e a rr a n g eo fo 1 2 0m g lf o rd e t e c t i o no f n 0 2 】2 w a s o b t a i n e dw i t hal i m i to fd e t e c t i o no f0 19m g l ( 3 a ) t h ep r e s e n ts y s t e mh a st h e a d v a n t a g e so fs i m p l es t r u c t u r e ，e a s eo fo p e r a t i o na n da p p l i c a t i o n ，h i g hi n t e g r a t i o na n d l o wc o s t w o r l d - t o - c h i pi n t e r f a c i n gi sc o n s i d e r e da sam a j o rc h a l l e n g e ，p a r t i c u l a r l yi n h i g h t h r o u g h p u ta p p l i c a t i o n sr e q u i r i n gf r e q u e n ts a m p l ec h a n g e b a s e do nt h e p r e v i o u sw o r k ，w ed e v e l o p e dac h i pb a s e dp f i as y s t e mw i t ht w oo n c h i pp r o b e s c o u p l e dw i t h s l o t t e d v i a l a r r a ys y s t e m s i no r d e rt o p e r f o r m s i m u l t a n e o u s s a m p l e r e a g e n tc h a n g e c a r m i n ew a su s e da sam o d e ls a m p l et ot e s tt h ep e r f o r m a n c e o ft h es y s t e m ar e p r o d u c i b i l i t yo f2 5 ( r s d ，n - 9 ) w a so b t a i n e d t h ep r e l i m i n a r y r e s u l t sp r o v e dt h ef e a s i b i l i t yo ft h es y s t e mi n c h a n g i n gt h es a m p l ea n dr e a g e n t s i m u l t a n e o u s l y , w h i c hi m p l i e dt h ep o s s i b i l i t yo ft h es y s t e mt ob ea p p l i e di nc l i n i c a l a s s a yw i t hm u l t i p l es a m p l e sa n dm u l t i p l ea n a l y t e s k e y w o r d s ：m i c r o f l u i d i cc h i p ；f l o wi n j e c t i o na n a l y s i s ；g a t e di n j e c t i o n ；g r a v i t yd r i v e n f l o w ；s a m p l ei n t r o d u c t i o n ；o n c h i ps a m p l i n gp r o b e i l 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩l ，内学1 妒论文，是本人在导师指导 下完成的成果，该成果属于浙江大学理学院化学系，受同家知识产 权法保护。在学期间与毕j i k 后以任何形式公丌发表论文或中请专利， 均需f h 导师作为通讯联系人，末经导师的书面许可，奉人彳得以任 何方式，以任f u j 其它单位作全部和局部署名公布学位论文成果。本 人完全意识到奉声明的法律责任山奉人承担。 学位论文作者签名节艳良 h 期：2 。艿年秒月2 dh 独创性声明 本人卢明所早交的学化论文是本人在导! j | | j 指导下进i j ：的研究t 作及墩得的 研究成果。掘我所知，除了义l - 特别加以标注和敛谢的地力外，论义i i ，不包含其 他人l 二经发表或撰。弓过的研究成果，也彳 包含为扶得澎江盘堂或他教育机 构的学化或证书而使用过的材料。与我同t 作的同志刈本研究所做的仟何贞献 均己在论文t l ，作了明确的说明并表示谢意。 学位论义作前签名：巷聿色良 签宁同期： 弘6 艿 印i 。月) d 同 学位论文版权使用授权书 本学位论义作卉充全了解逝姿盘堂有火保留、使厂仃学位论文的规定， 有权保留并向围家有关部门或机构送交沦文的复印件删磁盘，允许论文被查阅和 借i 蒯。本人授权澎姿盘堂可以将学f 讧论文的令部或部分内容编入仃火数据库 进 j ：榆索，可以采用影印、缩| = l j 或手i 捕等复制于段保仃、汇编学位论义。 ( 保密的学化论文和解密后适用奉授权书) 学位论义作栉签名：童毒已良 导师签名： 签字i 1 期：2 0 0 等年口月2 0i i 签字ii 期： 学位论义作肯 i 匕、i k 后玄向： 上作中位： 通讯地址： _ 砀事 i iu 话： 邮编： 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 引言 第一章与流动注射分析相关的 微流控芯片进样与驱动技术 2 0 世纪9 0 年代初，瑞士c i b a g e i g y 公司的m a n z 和w i d m e r 提出了以微机 电加工技术( m i c r oe l e c t r o m e c h a n i c a ls y s t e m s ，简称m e m s ) 为基础的“微型全 分析系统”( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，简称“t a s ) 概念，目的是通 过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度地把分析实验室的功能转移到便 携的分析设备中，甚至集成到方寸大小的芯片上，由于这种特征，也被称为“芯 片实验室”( l a b o nac h i p ) 【2 l 。在短短的十余年中，l x t a s 已成为分析化学中的 一个独立领域，并己成为当前世界上最前沿的研究领域之一，成为新的具有巨 大潜力的化学和生命科学研究手段，而微流控芯片( m i c r o f l u i d i cc h i p s ) 分析则 是u t a s 研究的最主要内容，它是主要在分析化学领域发展起来的前沿领域，它 以分析化学为基础，以m e m s 技术为依托，以微管道网络为特征，以生命科学 为目前主要应用对象，是分析科学及分析仪器当前发展的热点领域1 2 j 。而要真正 实现芯片实验室，就要针对化验室的功能单元，包括采样、稀释、加试剂、反 应、分离、检测等各个功能单元的微型化开展工作。 微流控芯片的尺度微小，通常涉及对皮升至纳升级液体操作，而与其联系 的外部宏观体系( 分析对象和样品储存系统) 则通常采用微升、毫升，甚至升 级的液体操作。如何从外界宏观体系引入样品，如何操控芯片各个微网络通道 内的流体，都是需要解决的重要问题。流动注射分析( f l o wi n j e c t i o na n a l y s i s ， f i a ) 作为一项可以将试样区带精确定量注入到分析流路的技术，在试样控制上 有独到的优势，是实现分析操作自动化的一项重要技术。将流动注射技术引入 到微流控分析系统将大大提高其自动化程度。流动注射分析的概念提出于上世 纪7 0 年代【3 】，其应用早已经渗透到分析化学各个领域，对分析的自动化产生很 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 大的影响。早期也有很多工作者曾设法将其微型化，但是由于受当时微加工技 术的限制，进展比较缓慢。随着m e m s 技术在分析化学中的引入，g t a s 的蓬 勃发展，f i a 的微型化工作也得到了快速发展【2 】。 一个典型的常规流动注射分析系统( 如图1 1 ) ，通常包括蠕动泵、进样阀、 反应盘管、流通池和检测器等部分。蠕动泵用于提供液流的驱动力，进样阀用 于向流动的载液中注入一定体积的试样区带，控制进样量，反应盘管作为试样 和试剂的流动、混合、反应通路，流通池内则实现样品检测。流动注射分析的 工作原理是，将一定体积的试样区带注入到非间隔连续流动的载液中，精确控 制管道内液体流动时间和距离，依靠试样和试剂区带分散的高度重现性，在非 热力学平衡条件下进行试样的分析。 c a r r i e rq 笆黜l ：l_ fit,-r ，- ，i 图1 1 流动注射分析原理示意图 下面，将首先介绍微型化流动注射分析系统( g - f i a ) 的研究进展，重点介 绍基于微流控芯片的流动注射分析系统。根据目前微型化流动注射分析系统的 发展情况，按系统采用的驱动和进样方式不同，分为以下四类进行详细介绍。 l 。采用电渗驱动控制方法的流动注射分析系统； 2 采用芯片上集成加工微泵微阀的流动注射分析系统； 3 采用移动进样方法的流动注射分析系统； 4 采用常规外置泵阀的流动注射分析系统。 要提高微流控系统的分析性能和实用性，选择合适的进样方法至关重要。 2 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 目前，在芯片上采用的进样控制方法包括，连续进样法、切换进样法( 包括夹 流进样、双t 进样和门式进样) 掣4 1 。其中门式进样法( g a t e di n j e c t i o n ) 是比 较常用的一种基于时间控制的进样方法，具有在试样溶液连续流动的情况下完 成进样和后续分离分析操作的能力。在本工作中，将门式进样方法应用于重力 驱动的芯片流动注射分析系统中。因此，在本章的第二部分，对有关微流控芯 片门式进样方法的研究进展进行了介绍。 1 1 微型化流动注射分析系统( t - f i a ) 1 1 1 电渗驱动控制i r t - f i a 系统 电渗驱动是微流控芯片上通道内流体常用的驱动方法，也是目前芯片毛细 管电泳中应用最广泛的驱动方式【5 】。利用电渗驱动液体可以实现纳升至微升级的 进样，采用高电压源的驱动和切换，不需阀就能实现复杂的流体操控，大大简 化了系统的组成和结构。 h a s w e l l 研究组2 】报道了一系列基于芯片的利用电渗驱动来控制流体的微 流动注射分析系统( “f i a ) 工作，并成功应用于磷酸盐类【6 ，8 1 、硝酸盐【9 】和亚硝 酸卦1 1 2 】的检测。典型的系统结构如图1 2 所示，两个高压电源( h v p sl 和2 ) 提供电渗驱动力，通道两侧插入光纤，一端连接l e d 光源，一端连接检测器， 以水平通道为检测通道进行吸收光度检测。该系统对磷酸盐的检测限为0 1 m e d m l ，重现性小于5 ( r s d ) ，单次测定试样消耗量为o 1u l ，分析通量达 到6 0 样d , 时【8 1 。对5 0m m o l l 亚硝酸盐检测的重现性达到2 6 ( r s d ) 【9 】，对 5m m o l l 的硝酸盐则为8 3 【l 引。他们还将电渗驱动流动注射方法用于芯片上高 通量的有机物合成【l o 】。如图1 3 ，在一个t 型结构的芯片反应器中，先在a 、b 液池加入不同的反应物溶液( p h e n y l b o r o n i ca c i d ，4 - b r o m o b e n z o n i t r i l e 的t h f 溶 液) ，c 液池加入溶剂t h f ，a ，b 液池加正电，c 液池接地。加好反应液后在 芯片表面覆盖封口膜。在a 、b 上加电压，在电渗流的作用下，液池内的溶液流 3 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 向c ，两个液池流出的溶液在固定有钯催化剂的通道内混合、反应，产物在c 液池收集，反应完毕的产物取出用质谱仪( g c m s 、i c p m s ) 进行分析。控制 a 、b 液池的加电时间和电压高低就能控制反应的混合比例和流速。该实验采用 了一个改良的s u z u k i 芳基卤和有机硼偶联反应，在同样反应条件下，该微反应 器的产率比常规反应器有显著提高。g r e e n w a y 掣1 3 l 用类似的系统，利用鲁米诺 化学发光反应体系检测了钴。 障 司 _ j 1 口 a旷ci ff fd i o d ea 脚 p c & d lb 、t i l m i c z o s p e c t r o m e t e r p t i n t e r s l l h v p s2 i m a n i f o l do n - c h i p ( 2 0 0 t a mi d ，5 0 t md e e p ) 图1 2 以电渗驱动的典型流动注射分析系统。 a b 、b c 、d e 长3m m ；c d 长4 m m ；b d 长7m m ；r b 、s c 、w d 长6m m 。a 混合试剂， b 样品，c 、d 废液池，h v p sl 、h v p s2 为高压电源，光源为插入通道的l e d ，使用二极 管阵列检测器【9 】 4 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 图1 3t 型结构s u z u k i 偶联反应器。 a 、b 液池加正电，c 液池接地，主通道上固定化催化剂 2 0 0 6 年，w a n g 等【1 4 l 利用简单的十字结构芯片，使用电渗驱动通道内的流体， 实现了流动注射快速分析痕量t n t 炸药。如图1 。4 ，a 、c 液池放置缓冲液，b 液 池放置t n t 溶液，d 端放置电化学检测器的各个电极。通过各液池之间高电压 的切换来实现流动注射分析操作，先在b 、d 之间3 h + 1 9 0v c m 的电场3s ，将样 品区带注入主通道，然后在a 和d 之间施加高压来完成流动分析操作。优化各项 参数后分析速度达到1 5 0 样d , 时，对t n t 的检出限为7 灶l ，线性范围为2 0 1 0 0 g g l ，重现性为2 0 ( r s d ，n = 3 0 ) 。 2 0 0 7 年，n i e 等【1 5 】在通道表面修饰了阴离子表面活性剂，利用电渗实现样 品驱动的同时，又实现了分析物的预浓集。通过控制电压和进样时间，采用两 个一体化电渗泵实现了n l 级样品的流动注射进样。 5 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 2 0m m - - - 啼 l g 图1 4 电驱动流动注射分析芯片。a 、c 缓冲液池；b 样品液池；d 出口端；e 阴极p t 电极； f a g a g c i 指示电极；g p t 对电极：h 检测电极 1 1 2 集成微泵微阀的“一f ia 系统 采用微机电加工技术，在芯片上集成加工微泵和微阀等元件，模拟常规系 统下各种分析部件的功能，实现流动注射分析操作，可以大大提高系统的微型 化和集成化水平。 2 0 0 3 年，l e a c h 掣1 6 】建立了一种利用聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 材料制作微 泵微阀的流动注射芯片分析系统。芯片集成了一个f i a 系统的主要部件：蠕动 泵、采样阀、混合反应通道和试样选择器，以及一个可供荧光检测的透明检测 池，结构如图1 5 所示。由三个气动微阀构成一个微蠕动泵，用调节阀通道气压 的方法实现微通道内液流的控制，泵速可达2 1n l m i n 。系统可实现2 个试样的 连续分析。该系统的局限性是，由于微泵为蠕动泵操作模式，所以液流存在脉 动，而且受阀膜材质所限，化学耐受性也较差，集成度虽然较高，但是需要复 杂且体积较大的外置气路控制系统来控制微泵的工作状态。 6 d ：=二=_ e 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技米 0 ，00 鬯0og 】o 图1 5 集成化徽泵微阀多层p d m s 流动注射分析芯片系统。 灰色线为微流体通道，控制通道( 即泵、阎) 为黑色。流体控制单元包括；c a ) 蠕动泵， ( b ) 注射阀，( c ) 混台，反应之器，( d ) 样品选择器。六个液池分别为( 1 ，2 ) 样品，( 3 ) 载流，( 4 ) 试剂，( 5 ) 样品废液，( 6 ) 柱后废渡 2 0 0 6 年，k u w a t a 等l ”1 报道了一种基于滑动通道阀的芯片流动注射分析系统， 该系统可进行纳升级定量溶液的切换和流动注射操作。芯片结构如图1 6 所示， 在芯片中部，垂直通道方向切割得到一个长方形滑块( 宽3r a t a ) ，滑块中部带 有一排固定体积的通道，控制滑块的滑动距离和停留位置，可实现滑块内部通 道与两侧芯片通道之间的切换。该装置的作用类似于六通阀，可以实现试样的 定量注入和多个试样的顺序进样。芯片表面经过氟硅烷化处理防止滑块部分渗 漏，使其具有良好的耐腐蚀性能。系统进样体积为1 0 n l ( 取决于滑动块内的通 道体积，无法任意改变) ，在1 0i i l m l n 的流速下，一次样品切换仅需要几秒种， 完成整个分析操作过程需1 3 5s 。报道称滑块的通道在切割前与其他部分是一体 的，所以滑块与芯片接触部分的死体积很小，残留少，其交叉污染产生的影响 可忽略。 第一章与流动注射分析相关的微流拉芯片进样与驱动技术 巴卫丑型 图16 滑动通道块的放丈实物囤及工作原理示意图。 虽然这类基于微加工技术的集成微泵、微阀的u f i a 系统使芯片的集成化 程度提高，但微机械元件加工难度太，成本高，对于不具备高精度微加工技术 的常规实验室而言，不易普及。 11 3 采用移动进样方法的u f i a 系统 另有一类u f i a 系统，采用了一些比较简单的驱动方式，如毛细力和重力 等。试样的注射采用移动进样方法。所得到的系统无需使用复杂的微加工技术， 成本低，而且体积也较小。 杜文斌等眦”嚏出了一种简单的基于取样探针和缺口管阵列的微流控试样 引入新方法，建立了一个微流控芯片流动注射分析系统。采用重力( 液位差) 提供试样注射、试样与试剂混台、传输和反应的驱动力，由外置的缺口管阵列 8 第一章与“【动注射分析相关的微流控芯片迸样与驱动技术 试样引入系统，结合芯片上集成的毛细管取样探针实现流动注射区带进样操作， 芯片上耦合了液芯波导管进行光度检测，如图l7 。探针取样的顺序为载液一试 样一载液，即在试样区带前后均引入载渡，使试样区带在载液携带下，以恒定 的流速进入取样探针和芯片微通道内，在汇流通道与试剂混合反应并检测。缺 口管平移台采用计算机操控的步进电机来控制，以进样时间的长短控制进样体 积，该系统可精确控制纳升级范围( 01 1 0 0n l ) 的进样量。该分析系统的最高 通量达到1 0 0 0 样品，j 、时。 圈l7 芯片上重力驱动流动注射分析系统 关艳霞等 2 0 l 利用了毛细管蒸发效应的力量制作了一种毛细蒸发微泵，可在 较长时间内提供稳定的每分钟止级液体流速，通过改变蒸发孔的面积或使用风 扇调节微泵的流速，流速精度小于3 ( r s d ) 。2 0 0 6 年，作者进一步将该毛细 蒸发微泵结合缺口管阵列进样系统，在芯片上实现了流动注射进样和化学发光 检测从而进一步缩小和简化了流动注射分析系统p 1 2 2 1 。系统结构如图l8 所示， 第一章与流动注射分析相关的微流控苍片进样与驱动技术 采用鲁米诺一f c 扣h 2 0 2 化学发光体系检测系统的分析性能，分析重现性为1 4 ( r s d ，n = 1 1 ) 。在该工作基础上，对该系统再进一步优化，将毛细一蒸发作用力 微泵在原位集成，即在微泵与芯片的连接位置制作了一个柱状的毛细蒸发作用 微泵，不增加芯片的横向尺寸，进一步减小流动注射分析系统的体积，提高集 成化程度。当滤纸柱的直径为75m m ，高度为3 0m m 时，其流速为21 4 l m i n ， 在9 0r a i n 内，流速的精度可达1 6 ( r s d ) 。系统采用n a o h 与嗅百里酚蓝变 色反应进行光度检测，重现性为3 4 ( r s d ，n - 5 ) 口。x u 等1 利用这种利用 毛细- 蒸发作用的柱状原位泵和进样方式，使用更简单的y 型汇流通道，采用激 光诱导荧光检测进行了d n a 分析，分析精度也达1 6 r s d ( 1 00n g ，“l ，n = 1 5 ) ，通量为7 6 样孙时，每次样品消耗仅9 5i l l 。 z 蓉蛰。香矽 耻8 一一二= = = tl 州：”y 竺尹 蕉觋 等弯 图】8 毛细蒸发微泵驱动的化学发光流动分析芯片工作原理图 2 0 0 8 年，w a n g 等也采用杜文斌等1 9 】报道的g - f i a 系统进样方式研究 聚碳酸酯( p c ) 塑料芯片上电极的安培检测性能。芯片耦合毛细管形成单通道 流路，毛细管伸出在芯片两端，一端连接废液池利用液位差驱动液流，另一端 与缺口管系统结台进行换样。系统在芯片上集成的金微电极上自组装了巯基试 剂，在对检测电压，毛细管内径，试样流动速率，进样量等进行条件优化后， 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 对检测抗坏血酸( a a ) 干扰下的多巴胺( d a ) 类化合物结果较好，对1 0 0m o l l 多巴胺连续进样1 9 次的重现性达0 9 ，对7 4n m o l l 的d a 分析速度可达1 8 0 样d , 时，而试样消耗仅在n l 级。 上述流动注射分析系统结构简单，易加工，价廉，易于普及。但是采用毛 细力和重力驱动的系统，不易进行复杂的微流控操作，目前基于此类驱动方法 的“f i a 研究还不多。 1 。1 4 采用常规外置泵阀的灶一f ia 系统 化学分析仪器的微型化，需要各个组成部件的微型化，但受限于微加工的 条件，有较多报道是采取常规的f i a 仪器和微流控芯片平台联用的办法，来实 现微流控芯片上的流动注射分析操作。驱动试样和试剂液流流动、定量控制样 品，都利用常规的泵、阀来实现，而芯片是主要作为反应器【2 5 】和流通检测池【2 6 1 。 这类组合系统所完成的芯片进样体积常在微升级，整体也不够微型化，但其系 统容易搭建，是目前f i a 技术和芯片技术相结合的一种重要方式。 1 9 9 3 年，m u r a k a m i 等 2 5 j 将常规f i a 系统和微加工芯片联用。如图1 9 ，在 玻璃与硅片复合芯片上j i l t - 的微通道宽1 0 0g m ，深7 0p m ，通道弯折6 6 次，总 长9 6 2m i t t 。通过1 lm m 2 大小的小孔连接外部液体，在微通道上固定了葡萄糖 氧化酶作为固定化酶反应器，还在硅片上加工了薄膜电极作为电化学检测器。 用于系统进样的注射泵最小流速达到o 1g l m i n ，采样坏的体积则小至0 2 到 0 5 “l 。系统检测了酶催化反应产生的葡萄糖，在液流流速为1 0g l m i n 时，对 葡萄糖的检测在1 2 5m m o l 浓度范围内线性良好( r 2 = 0 9 9 3 0 ) 。 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 图l9 结合了固定化酶反应器和电化学流通池的微流控芯片【“i a v 型沟槽；b 入口；c 玻璃板；d 微加t 硅芯片；e 出口：f 电投阵列 2 0 0 1 年。k a m i d a t e 等口”采用两种具有不同微通道混合结构的芯片考察了 在流动注射分析模式下，系统对肾上腺素( e p ) 和光泽精( l u e ) 进行化学发光 检测的效柴。芯片为硅和p r e y 玻璃复合结构，出入口液池内径1 5m m ，使用 i i p l c 泵驱动样品液流( 晶低流速5p l m i n ) 采用0 8 m m 内径的t e f l o n 管连接 泵与芯片，采样环体积5 此，进样流速为1 0 【t l m i n ，由于两种构型具有不同的 混台效率对e p 的检测眼分别是5 1 0 m o l l 和8 1 0 4 m o f l 。 2 0 0 3 年，s u 等【2 ”用常规微量注射泵直接耦台芯片上的混台反应池，利用化 学发光反应检测了一些环境污染物，如腐殖酸、2 - 萘酚、苯并噻唑、二价锰等， 反应物流速为每分钟m l 级。 m a r t i n 课题组2 ”2 1 在研究芯片上集成的微电极的安培检测性能时，常使用微 量注射泵进行试样引入。由于系统需要泵、阀的联合控制，引入的死体积通常 达数微升，影响了系统的分析速度和灵敏度1 3 0 , 3 2 】。 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 2 0 0 5 到2 0 0 7 年，国内章竹君课题组【3 3 彤】也报道了一系列芯片上利用化学发 光的微型化f i a 系统，并应用于多种实际样品检测。常用的芯片基质为p m m a ， 用二氧化碳激光烧蚀加工微通道，热压法实现芯片键合。采用自行设计的具有 精确时间控制的注射泵用于控制进样体积，时间控制精度为0 0 1s ，取样量为纳 升至微升级。以过氧化氢的测定为例，按图1 1 0 所示流路系统，3 个注射器预 先装入试剂和样品后，再接好各路管道，开启恒流注射泵a 、b ，以6 0 “l m i n 的速度分别注入鲁米诺和钻离子溶液，待化学发光背景信号稳定后，泵c 以1 0 0 g l m i n 的速度注入样品，用时间计电器控制进样时间2s ，注入样品体积为3 3 u l 。对0 6g m o l l 过氧化氢检测的重现性是4 6 ( r s d ，n _ 9 ) ，线性范围为 0 0 5 2g m o l l ，检出限为0 0 2g m o l l ( 3 0 ) 。系统还应用于雨水中微量过氧化氢 的测定1 3 郇。该化学发光系统也成功的用于人体血浆和尿液中尿酸的测定f 3 3 】以及 食品中亚硫酸盐的测定【3 7 】。尿酸的浓度在o 8 3 0m g l 范围内有良好的线性关系， 检出限是0 ，5m g l ( 3 0 ) ，对5m g l 尿酸分析的重现性是4 4 ( r s d ，n = 8 ) 1 3 引。 对食品中的亚硫酸钠检测的线性范围为1 o 一6 0g g m l ，检出限是o 5g g m l l 3 。 而对于亚硝酸盐的测定，芯片只需要两个注射泵，仍然采用精确时间控制方法 来控制所有试剂的进样体积，利用化学发光反应铁氰化钾一鲁米诺过氧化氢体系 测定食品中的亚硝酸盐，线性范围为8 1 0 0 l ，检出限是4 l ( 3 0 ) ，对5 0 g g l 亚硝酸盐分析的重现性是4 1 ( r s d ，n = 9 ) 1 3 5 。 2 0 0 4 年，t y r r e l l 掣3 8 】也利用类似的结构在芯片上使用化学发光反应检测铜， 对c u ( h ) 的检测限达2 0 “g l 。 1 3 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 ( a ) ( b ) 样品 s a m p e j 凝媛 r 蛾 图1 1 0 ( a ) 微流动注射芯片( a ) 和微反应通道( b ) 示意图； ( b ) 化学发光微流动注射芯片流路图。 p 1 、p 2 、p 3 注射泵；a 鲁米诺；b 钴离子：c 样品；p m t 光电倍增管。 2 0 0 6 年，贾宏新等【3 9 】采用缺口管阵列的进样方式，在芯片上实现了纳升级 进样，并用于气体扩散分离光度检测流动注射分析系统，系统的驱动仍然使用 一个微量注射泵。微流控芯片为三层结构，玻璃片上加工微反应通道，用p d m s d n - r 气体渗透膜和具有接收气体微通道的底片，如图1 1 0 ( a ) 、( b ) ，实现了化 学反应生成气体、气液分离和检测在一个芯片上的集成化。将微量注射泵连接 在气体反应通道出口端和产物接收通道的出口端驱动液流。系统进样时，先将 取样探针停留在载液管中，用注射泵拉动载液和试剂同时进入微芯片通道，在 1 4 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 微反应通道中混合。采样阶段，将试样管阵列平移，使取样探针进入装有样品 溶液的试样管内，则样品和试剂同时进入芯片通道。采样结束后将阵列再次平 移一位，探针进入下一载液管中引入载液溶液，完成一次流动注射进样过程， 重复上述操作可实现换样。在采样期间，取样探针引入的试样( n h 4 c 1 ) 和试剂 ( n a o h ) 在芯片上的y 形通道交叉点处汇流发生混合反应，生成的氨气扩散透 过p d m s 气体渗透膜进入接收通道，被接收液吸收，如图1 1 0 ( c ) ，采用吸收 光度法测定。系统对n h 4 + 的检出限为1 4 0g m o l l ，峰高精度为3 7 ( r s d ， n = 9 ) 。 a c c e p t o ri n l e t a e e e p t o ro u t l e t r e a c t i o n a c c e p t o rc h a n n e l b l a c kb o x p m t 图1 1 0 ( a ) 芯片通道设计图；( b ) 通道结构侧视图；( c ) 进样系统示意图 1 5 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 2 0 0 7 年，a m a m t o n g c h a i 等h 0 1 报道了采用流动注射模式进行化学发光法抗氧 化剂容量测定的微流控芯片系统。芯片采用三层夹心结构，中间层为p d m s ，上 下两层是玻璃，加工了两种芯片通道构型，如图i1 2 所示。系统采用外接高精 度微量注射泵驱动。三入口构型的芯片，过氧化氢、混合试剂( 包含过氧化物 酶，染料和催化剂) 和抗氧化剂三路溶液，经由接口，直接连续流入芯片微通 道实现快速混合。而取入口构型的芯片，采用外部一个切换阀，将5 0 血抗氧化 剂定量引入反应流路。采用带有光电倍增管的倒置荧光显微镜检测，双入口构 型的芯片对b 胡萝h 素、n - 维生素e 、栎精进样分析重现性均小于2 ( r s d ， n - 3 ) ， 嘣11 2 ( a ) 流动注射耦台化学发光芯片系统 ( b ) 三入口构型分析系统；( c ) 取入 口型分析系统。 2 0 0 7 年f o n s e c a 等“1 1 采用类似结构，利用了一些显色反应检测水中的氯( 硫 氰酸汞法) ，废水中的六价铬和金属合金中的总铬( 二苯碳酰二肼法) 。在氯的 检测中，采用的流速达5 0g l m i n ，通量则为4 5 样川、时。 】6 = 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 2 0 0 8 年，n i s h i h a m a 等【4 2 j 报道了一个能够定量测定人体尿样中蛋白质的 “f i a 系统，使用了( a ) 和( b ) 两种构型的芯片。系统采用常规微量注射泵驱动 液体，用p t f e 管和多位阀连接p m m a 芯片，在芯片通道的末端部分耦合光纤， 于5 9 5n n l 波长下进行光度检测，如图1 1 3 。采用不具备分离功能的( a ) 构型芯 片时，微注射泵直接将试样注入到试剂流路中，进样量为2u l ，对0 - 5 0 0l - t g m l 浓度的牛血清白蛋白( b s a ) 检测的线性方程为y = 5 8 0 x 1 0 x + 3 5 8 x 1 0 - 3 ( r 2 = 0 9 8 2o 而在( b ) 结构芯片中，在通道上加工了长81 1 1 l i l ，深、宽均2m m 的 微柱，用一定量的陶瓷羟磷灰石( c e r a m i ch y d r o x y a p a t i t e ) 和玻璃珠混合物填充。 在分析时，使用微注射泵将样品溶液、缓冲液、洗脱液依次以2 0f t l m i n 的流速 通过入口1 引入芯片微通道，而试剂以3 0l t l m i n 流速度通过入口2 进入到芯片 进行混合反应，经过微柱上的吸附洗脱过程，系统能对多组分的混合物进行纯 化、分离和检测。它的前期工作于2 0 0 6 年报道【4 3 1 ，也对比了有、无分离单元的 芯片性能，分离柱填充了活化的氧化铝，利用酶反应检测人尿中的葡萄糖含量， 试剂消耗为3 3 3u l 样，样品分析速度为2 0 样小时。 a ) w i t h o u ts e p a r a t i o np a r t( b ) w i t hs e p a r a t i o np a r t 6 6 8 一一j l t t , - 2 5 1 5 5 s 4 图1 1 3 两种尿蛋白分析u - f i a 芯片结构图。 ( a ) 不带分离功能的芯片；( b ) 带有分离通道的芯片。 1 7 ；i：t；-，卜：磐；| 寸 第一章与流动注射分析相差的微流控芯片进样与驱动技术 2 0 0 6 年，b a e z a 等州】用一种间隔流的流动分析模式在芯片上实现了水中亚 硝酸盐的光度法检测。芯片结构如图1 1 4 ，芯片为硅片与p y r e x 玻璃复合结构。 芯片出口端连接注射泵。通道内的样品和试剂的流动通过外接三通阔来切换和 控制。实验通过控制电磁阁的丌舍，问隔引入试剂和样品液流来实现其在微通 道内的混合。 竺竺! 芝罢竺型 豁羞融 图11 4 ( a ) 流路控制示意图。a 苍片结构示意图。v i 、v 2 为三通电磁阎：c h a n n e l l ： 试剂通道1 ；c h a n n e l2 ：试样通道2 ；b 试样混合模式示意图；c 试样混合信号记录图- 试样试剂流动时问比为4 0 0 2 0 0m s ；( b ) 仪器外观实物圈。 k j l a m o r l 等h 5 i 在i a - t a s 2 0 0 6 会议上报道了种流动注射苗片，如图1 1 5 所 示。使用外置的两个微量注射泵驱动流体，控制试样和试剂区带同时到达通道 汇合点，从而在y 型通道内以层流形式实现横向混合( 如图11 5 ( b ) ) 。系统采 用热透镜系统进行在线检测。 一 第一章与流动注射分析相关的徽漉控芯片进样与驱动技术 匿“，二! 一墨_ 垂 巫 d l t 忡呻 圈11 5 ( a ) 仪器装置图。c a ) 分析流路示意图( b ) 仪器外观实物( c ) 芯片位置放 大圜：( b ) 问隔层流检涮原理不意图。 2 0 0 3 年，h a u s e r 等【“采用一系列的外簧开关阀来实现芯片上的流动注射进 样。系统结构如图11 6 所示，微通道采用双t 结构。利用电磁泵m p 首先驱动 样品进入芯片此时v 2 、v 3 电磁阀开启，其它阀关闭，b c 段通道相当于采样 环的作用；进样完毕后，v 2 、v 3 阀关闭，其它阀开启，开启s p i 和s p 2 两个注 射泵用于驱动载流和试剂的流动，样品在通道内实现混合，用l e d 做为光源进 行吸收光度检测。实验同时与电驱动进样方法进行了对比，十月比之下，采用泵 阀驱动的系统适应性更广，而电驱动则是最佳驱动条件和光度反应的最佳条件 1 9 ii 蚤一 咿髫 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 不易达到一致。 ( a )( b ) o2 04 08 0 t t m e ，3 图1 1 6 ( a ) 微型流动注射分析系统结构示意图；( b ) 重复6 次的压力进样信号记录图 上述多数工作均采用外置的泵阀驱动试样和试剂，完成试样的注入、混合、 反应和检测。通常进样量大多都在微升级，与微流控系统的纳升至皮升的操纵 范围相差较大。有关上述系统在降低试样试剂消耗方面的研究，仍有待进一步 加强。 1 2 门式进样法在微流控芯片分析系统中的应用 目前，在芯片上使用的进样方法包括：连续进样法、切换进样法( 包括夹 流进样、双t 进样和门式进样) 等1 4 1 。其中门式进样法( g a t e di n j e c t i o n ) 是常 用的一种基于时间控制的进样方法，它可在试样溶液连续流动的情况下完成进 样和分离操作，其优点是进样速度快，进样量比较容易改变，可在不间断分析 和分离操作的条件下实现连续进样。 门式进样法最早在1 9 9 4 年由r a m s e y 研究组【4 6 】提出，最初使用电渗驱动的 2 0 侣 住 8 4 o 暑、誊譬jomqv 第一章与流动注射分析相关的微流控芯片进样与驱动技术 方法完成门式进样操作，具体原理如图1 1 7 a 所示，分三步完成进样。第一步， 进样前，缓冲液池( b ) 的电压v b 大于样品池( s ) 的电压v s ，样品废液池( s w ) 和缓冲液废液池( b w ) 的电压为零。此时，缓冲液以较大的流量从b 出发，流 经十字交叉口时，大部分向下流入b w ，小部分向右流入s w ；样品溶液从s 出 发，流经十字交叉口时，由于电场的导向及缓冲液流的挤压作用向右流入s w ， 从而确保在此阶段无样品溶液泄漏到分离通道。第二步，如图1 1 7 b 所示，进样 时，在b 端不施加电压，样品溶液在电场作用下，经十字交叉口一部分仍流向 s w ，另一部分向下流入分离通道，完成试样注入。第三步，如图1 1 7 c 所示， 进样结束后，各储液池所施加电压恢复到进样前的状况，样品塞在电场的驱动 下进入分离通道，完成分离操作。门式进样法的进样量并不由十字叉口处的通 道体积控制，而是通过调控进样阶段的时间长短来控制。1 9 9