（光学工程专业论文）悬浮式生物芯片并行检测图像采集系统的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 y 8 7 7 7 8 2 摘要 生物芯片技术是一项新兴的技术，它融合了微电子学、生物学、光学、化学、计算 机科学等许多学科的先进技术，能对可遗传信息进行高效快速的检测和分析。目前，生 物芯片技术在基因测序、突变检测、基因多态性分折、医学诊断等领域都得到了广大科 研工作者的密切关注。常见的生物芯片有两种：固态生物芯片和悬浮式生物芯片。其中 悬浮式生物芯片由于成本低廉、检测方便而有着广阔的应用前景。 在悬浮式生物芯片检测系统中，图像的采集和处理是其中的重要组成部分。针对悬 浮式生物芯片的并行检测，本论文研究了一种采用c c d 和c p l d 的图像采集系统。论文 在对图像采集系统的原理方案进行了详细地分析论证之后，确定了各个主要器件的型 号，设计了图像采集系统的电路原理图，制作了p c b 板，完成了硬件电路的调试和相应 的软件编程。同时，搭建了实验平台，进行了荧光图像采集实验，最终的实验结果表明： 利用本系统可以实现悬浮式生物芯片并行检测中荧光图像采集的功能。 论文的第一、二章，介绍了生物芯片技术的发展和现状；论述了本课题的研究背景 和意义；对现有的悬浮式生物芯片的并行检测方案进行了详细分析。第三章提出了悬浮 式生物芯片图像采集系统的原理设计方案。第四章简要介绍了系统的软硬件开发环境。 第五章和第六章主要论述了系统具体的软、硬件设计。第七、八章分析了实验结果，并 对整个系统的性能做出了总结。 关键词：悬浮式生物芯片图像采集电荷耦合器件可编程逻辑器件 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t b i o c h j pi sa ne m e r g i n gl l i g ht e c l l l l o l o g yi nb i o m e t r i c st l l a tc o m b i n e sk n o w l e d g e i nm a n y6 e l d s ，s u c ha sm i c r o e l e c t m n i c s ，b i o l o g y ，p h y s i c s ，c h e m i s t r y ，g e n e t i c sa n d c o m p u t e rs c i e n c e i ti sc o n v e n i e n tt od e t e c ta n d 鲫a l y z eg e n ei n f b m a t i o nf a s t a j l d a c c u m t e l yw i t ht h i s m e t h o d n o wb i o c h i ph a sb e e nw i d e l ya p p l i e di n g e n e i n s p e c t i o n ，a b e r r a n c e ，d i a g n o s e s ，d i s e a s ea n ds oo n ( k n e r a l l y ，t h e r ea r et w ok i n d so f b i o c h i p ：s 0 1 i d - b i o c l l i p a 1 1 d s u s p e n s i o n - b i o c h i p _s u s p e n s i o nb i o c h i ph a sm a i l y a d v a n t a g e so v e rt r a d i t i o n a l s o l i db i o c h i p ，a 1 1 dh a sb e e nb e c o m i n gt l l ef o c u so f r e s e a r c hi nm a n yc o l l l l t r i e sa tp r e s e m i m a g ea c q u i r i n gs y s t c mp l a y sa i li m p o n a i l t r o l ei nd e t e c t i n gs u s p e n s i o nb i o c h i p u s i n gn u o r e s c e n c em e 廿1 0 d i nt h j sp 印e r ，an o v e l i m a g ea c q u i r i i 培s y s t e mw i t hc c d a i l dc p l di sp r e s e n t c d a 舭rd i s c u s s i n g 血ew h o l ed e s i 髓，w es e l e c tt 1 1 em a i nd e v i c e s i nt h i sp r o j e c t ，d e s i g nt h cp c b 、v i t hp m t e l 9 9a n dm a k ei tw o r k 、v e l l a tl a s t ，w et e s t t h ew h o l es y s t e m ，t h er e s u l t si 1 1 u s 仃a t et h a ti ti sp o s s i b l et od 鼬e c tn u o r e s c e n c ei n s u s p e n s j o nb i o c h i pb yt h j si m a g ea c q u i r i f l gs y s t e m ab r i e fd e s c r i p t i o na b o u tt h ec u r r e n ts i t u a t i o no fs u s p e n s i o nb i o c h i pi sg i v e ni n t h en r s tt w oc h a p t e r s c o m p a r e d 、v i t i lt t l ee x i s t i i l gd e t e c t i o np r o c e s si ns u s p e n s i o n b i o c h i ps y s t e m ，t h en o v c ld e s i g ni sp r e s e m e di nt h em i r d 趾dt 1 1 ef o u n hc h a p t e li nt h e f o l l o w i n gt w oc h a p t e r s ，h a r d w a r ed e s i g na i l ds o f h v a r ep r o 伊a m m i n ga r ed i s c u s s e di n d e t a i l a tl a s t ，t h ep e r f b r i i l a n c eo f 椭si m a g ea c q u i r i n gs y s t e mi sa 1 1 a l y z e di nt h e s e v e n t hc h a p t e r ，h e r ew ea l s os u m m 嘶z em ew h 0 1 es y s t e m k e y w o r d ： s u s p e n s i o nb i o c h i p ，i m a g ea c q u i r i n g ，c c d ，c p l d i i 浙江大学硕士学位论文 1 1 生物芯片技术 1 1 1 生物芯片综述 第一章绪论 生物芯片技术是一种新型的生物检测技术，是继2 0 世纪5 0 年代半导体芯片 后微芯片技术的又一重大发展，也是2 0 世纪9 0 年代中期以来影响最深远的重大 科技进展之一。将用于探测生物反应信息的探测分子悬浮于溶液中或者通过微加 工工艺固定在硅片、玻璃、薄膜等基片上就制得了生物芯片【l j 。长期以来，研究 生物体内的化学反应过程都有着重大的意义，然而，在这些领域一直缺乏有效的 研究手段。利用生物芯片技术，可以综合分析生命科学和医学中的各种生物化学 反应过程，进而实现对基因、抗体、抗原等生物活性物质的快速高效的测试和分 析。生物芯片技术融合了微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学等多个 学科的先进技术，具有重大的研究价值和广阔的应用前景。 正是由于生物芯片技术自身的优势，使其在基础科学领域的诸多方面都有着 广泛而重要的应用。在基因结构和功能研究方面，生物芯片的应用主要包括序列 分析、基因诊断、基因表达研究口】【6 1 、基因突变检测及基因多态性的分析叶【8 l ； 在药物研究方面f 9 】_ ，生物芯片主要用于新药物的研制开发、查找药物的毒性 和副作用以及检验药物在临床上的应用；在疾病诊断方面，生物芯片技术可以对 包括遗传性疾病、肿瘤基因、传染病、感染性疾病进行快速准确的诊断。另外， 生物芯片技术也可以用于农牧种群改良、环境保护、军事医学等领域。 生物芯片技术由于采用了微电子学中的并行处理和高度集成的技术，因此具 有检测效率高、速度快、信息量大等突出优点。与传统的膜杂交技术相比，样品 需求量小，操作简单，自动化程度高，探测分子种类多，检测效率高。 图11 是一个常见的生物芯片微阵列图。 浙江大学硕士学位论文 图1 一l 红绿彩色生物芯片阵列 以分子微阵列为基础的生物芯片主要包括d n a 芯片和蛋白质芯片。d n a 芯片由 固定核苷酸、c d n a 和基因片段等形成的微阵列构成，主要用于研究基因结构及其 表达，故又称基因芯片。蛋白质芯片( p r o t e i n c h i p ) 又称蛋白质微阵列，是通过 将大量的蛋白质、蛋白质检测试剂或检测分子以预先设计的方式固定在玻片、硅 片或纤维膜等固定基体上组成密集的阵列，能够高通量地测定蛋白质的生物活 性。另外，现在还有一种广泛研究的生物芯片被称作片上实验室( l a bo nac h i p ， l o c ) ，它是利用集成电路制造中的光化学蚀刻技术，在硅或玻璃基片上构建各 种显微结构，如微电极、微陷阱、微通道和微反应池等，一次性完成芯片制备、 样品处理、探测分子和待测分子的杂交亲和，以及信号的检测、分析。采用片上 实验室技术( l o c ) 可以极大地缩短生物分子间的反应时间和对结果的检测分析 时间。 图卜2 所示是一种i ，o c 的结构图。 2 浙江大学硕士学位论文 酗卜2 片上实验室( l a bo nac h i p ) 结构示意图 生物芯片的制备方法主要有机械点样法( p o s t s y n t h e t i ca t t a c h m e n t ) 和原 位合成法( i ns i t us y n t h e s i s ) 两大类1 1 4 j 。机械点样法包括接触式打印法和非 接触式喷印法。接触式打印是指点样器件与基片间有接触的微阵列制备技术。接 触式点样器件包括微点样针、镊子、毛细管等。在接触式点样技术中，运动控制 系统上装有一根或者多根微点样针，微点样针的头部有一个能够存放一定体积样 品的通道，通道吸收一定量样品液后逐点在基片上打点就可以制得生物芯片微阵 列。采用非接触式点样法制备微阵列时不需要点样器件和基片直接接触，而是采 用热喷印、压电晶体喷印或者注射泵推进喷印等方法把样品“喷”到基体表面。 通过连续喷样，喷头可以在1 分钟内制备含有数千个样品点的微阵列。另外，喷 头还可以实现一种或几种样品的快速喷射，适合制备样品种类不多的微阵列芯 片。“喷印”的优点在于其点样速度相对较快、可以精确设计喷印液滴的体积。 另外，由于喷印技术不需要点样器件和基片表面接触，因而对表面无损伤。其中 常用的压电喷印技术是使用压电晶体来喷出喷头小孔中的液滴，液滴的大小一般 为5 0 5 0 0 p l ，形成的微阵列密度可达2 5 0 0 点c m 2 。原位合成法是采用光导化学合 成和照相平板印刷技术在载体表面合成寡核苷酸探针的方法。它借鉴了半导体芯 浙扛大学硕士学位论文 片加工制作中的光刻方法，利用较少的步骤就可以合成大量产物并且具有并行性 和高效性的特点。目前，原位合成法发展非常迅速，已经在生物芯片的制备中得 到了广泛的应用。 生物芯片的探测分子都是固定于某种基片上才能行使相应的功能，这种用于 连接或吸附探测分子的基片就是生物芯片的载体。一般而言，生物芯片的载体材 料要求满足如下条件： ( 1 ) 载体表面必须具有可以进行化学反应的活性基团，以便与探测分子进行 耦联。 ( 2 ) 载体应当具有一定的惰性和稳定性。这样在生物分子反应过程中，载体 才不会干扰生物活性分子的性能并且在可能的酸、碱条件下不发生变化。 目前，用于制作生物芯片的载体基本上有4 大类：无机材料、天然有机聚合 物、人工合成的有机高分子聚合物和各种高分子聚合物构成的膜。其中玻璃由于 来源广泛、价格便宜、适用于当前广泛采用的荧光检测而备受各国研究者的重视。 荧光检测是生物芯片微阵列检测中最为常见的方法。在光致发光中，如果某 种物质在激励光的照射下能在极短的时间内发出比激励光波长更长的光，这种物 质就是荧光物质，它发出的光叫做荧光。图1 3 是c y 5 的荧光发射曲线，其中纵 坐标是激发光和发射荧光的相对强度。荧光物质的吸收峰值波长和发射峰值波长 之差称为斯托克斯位移( s t o k e ss h i f t ) ，斯托克斯位移越大，越容易消除激发光 带来的影响，从而提高扫描仪的灵敏度。 w b v 商* 蚶t ni 叫 图1 - 3c y 5 的荧光发射曲线图 2#8xl 重鲞#o o#lik 浙江大学硕士学位论文 1 1 2 悬浮式生物芯片 悬浮式生物芯片技术是与固态生物芯片对应的另外一种生物芯片技术，它是 利用微球( m i c m s p h e r e ) 作为载体，流式细胞仪( n o wc y t o m e t e r ) 作为检测平 台，对蛋白质、d n a 等进行检测的一种技术。微球、探测分子、待测分子和报 告分子是悬浮式生物芯片的主要构成部分。其结构原理图如图1 4 所示： 探测分子 微球 图1 4 悬浮式生物芯片结构原理图 在图卜4 中将探测分子固定在微球载体上，然后把携带有分类信息的微球悬 浮于液相环境中，就构成了一个悬浮式生物芯片系统。微球上的探测分子可以与 待测液中特定的待测分子发生杂交反应。充分反应后，在外界激发光源的作用下， 通过检测微球和报告分子发出的荧光来实现大规模、高速度的检测f l 酬。如果在 不同的微球上固定不同的探针分子，就可以对同一个待测试液中的多个不同分子 同时进行检测。 在悬浮式生物芯片检测系统中，为了区分不同的探针分子，常常采用荧光编 码技术对探针分子进行编码1 7 】。荧光编码的原理是：在微球载体上掺入两种不 同强度的分类荧光，根据这两种分类荧光掺入的比例不同，就可以把不同的微球 区别开来。例如，两种荧光分别有n l 、n 2 个等级的浓度，就可以把微球分为n l x n 2 种。即当这n lx n 2 种微球分别固定在n 1 n 2 种不同的探针分子上时，就 可以同时对一个待测溶液中的n l n 2 种不同的待测分子进行检测。 图卜5 为微球荧光编码的原理示意图。 ，| l丁| | | 浙江大学硕士学位论文 图卜5 微球荧光编码原理示意图 与悬浮式生物芯片相比，虽然固态生物芯片技术具有高通量、可并行检测等 优点，但是它也存在一些固有的缺点，例如制作工艺复杂、成本昂贵，并且不能 根据检测对象的不同随时制作不同的生物芯片、平面点阵加工的均匀性难以控 制、固态条件下杂交反应不充分等。这些不足大大限制了固态生物芯片在实际中 的应用。采用悬浮式生物芯片技术可根据每个检测对象的不同随时进行特定的配 置。另外，悬浮式生物芯片也不存在冲洗问题，易于信号检测，而且液相环境下 也更有利于探针分子和待测分子之间的杂交反应。 1 2 生物芯片检测技术 1 2 1 生物芯片荧光信号的检测 生物芯片与标记有荧光染料的目标抗原或抗体进行杂交反应之后，为了判断 反应的结果，需要用扫描读写装置将芯片的检测内容转变成可供分析处理的数字 图像，这个过程就是生物芯片的荧光信号检测。生物芯片荧光信号的检测原理为： 使用激发光照射含有荧光标记的生物分子并使其发射荧光，然后利用光电接收器 件接收这些荧光，最后把荧光图像储存在计算机中并加以分析。待测分子与探测 分子严格配对的杂交分子的热力学稳定性较高，产生的荧光强度也最强：不完全 杂交的分子的热力学稳定性低，所产生的荧光信号也比较弱；没有发生杂交反应 浙江大学硕士学位论文 的分子，则只能检测到原有的标记荧光信号。 荧光信号的检测方法有许多种，如荧光显微镜、倏逝波传感器、光散射、表 面共振、电化传感器、化学发光、荧光各向异性等。依据不同的分类标准，生物 芯片的荧光检测也有不同的分类方法。根据生物芯片荧光信号检测中所采用的光 电探测器类型的不同，可以分为光电倍增管型和c c d 型；根据检测系统中激发光 源的不同，可以将其分为激光型和非激光型【1 8 】。 1 2 2 两种常见固态生物芯片检测技术 1 激光共聚焦型生物芯片扫描仪 在激光共聚焦型生物芯片扫描仪中，采用激光作为激发光源，因而可以得到 较大强度的荧光信号，也正是由于这一原因，使得激光共聚焦型生物芯片扫描仪 具有较高的灵敏度。当前此类商用生物芯片扫描仪多采用2 种或2 种以上不同波长 的激光器作为激发光源，以激发标记有不同荧光物质的待测分子。在激光共聚焦 型生物芯片扫描仪中常用的激光器有氩离予激光器、氩氪离子激光器、氦氖激光 器等。影响激光共聚焦型生物芯片扫描仪扫描精度的主要因素是移动扫描平台的 机械精度，当移动平台具有较高机械精度时，扫描精度也较高，重复性也更好。 图卜6 激光共聚焦生物芯片扫描仪结构示意图 激光共聚焦生物芯片扫描仪结构如图1 6 所示。其原理如下：由激光器发出 浙江大学硕士学位论文 的激光首先被分色镜反射，再经聚焦物镜聚焦在生物芯片表面，聚焦后的光斑大 小一般为几个到几十个微米。聚焦的激光激发生物芯片上标记有荧光染料的报告 分子发出荧光，该荧光通过聚焦物镜后变成平行光，然后通过分色镜、滤光片、 光阑后被光电倍增管接收。最后，把光电倍增管接收的信号用a d 器件转换为数 字信号送入计算机中分析处理。 在图卜6 中，分色镜的主要作用是反射激发光而允许生物芯片上激发的荧光 透射。光阑上的通光孔很小，这样做的目的是使刚好聚焦在芯片表面所产生的荧 光能够通过光阑被检测，而大部分焦平面以外的荧光信号将不能通过光阑，从而 避免了其对探测结果的影响，有利于得到高分辨率和高对比度的图像。滤光片用 来滤除发射荧光中心波长以外的杂散光。激光共焦生物芯片扫描仪通过二维移动 装置对生物芯片进行扫描。完成一次扫描大概需要5 分钟左右的时间，同时把结 果以图像文件的方式存储在计算机中。由于系统中激发光源、生物芯片和光电倍 增管处在彼此对应的共轭焦点位置，故把这种荧光检测方法叫做共焦生物芯片扫 描技术。图卜7 是g e n e r a ls c a n n i n g 公司s c a n a r r a y m 3 0 0 0 的扫描光路图，图中激 发光滤波器和发射光滤波器均为窄带滤波器，带宽约为1 0 n m 。 图1 7s c a n a n 到t m 3 0 0 0 扫描仪光路图 浙江大学硕士学位论文 2 c c d 型生物芯片扫描仪 c c d 型生物芯片扫描仪是利用c c d 作为荧光探测器件的生物芯片检测设备。 c c d 的全称是c h a r g ec o u p l e dd e v i c e ，其基本单元是h i o s 电容。目前，c c d 器件的 灵敏度已经可以达到1 0 “l x ，分辨率也已经可以达到5 0 0 0 4 0 0 0 或更高，光量子 效应接近8 0 。选用高质量的c c d 扫描得到的图像质量已经接近采用光电倍增管 所得到的图像质量。与激光共焦扫描仪相比，c c d 型生物芯片扫描仪一般情况下 不需要扫描传动平台，因而它的结构比较简单。另外，由于面阵式c c d 器件是对 一个区域成像，所以为了保证整个成像区域受照均匀，一般不采用激光器作为激 发光源( 激光光强的高斯分布会使整个光场光强分布不均，不利于信号的线性响 应) 。通常情况下c c d 型扫描仪使用高压汞灯或高强度氙灯作为激发光源。图1 8 是c c d 型生物芯片扫描仪结构原理图。 图卜8c c d 型生物芯片扫描仪结构图 如图卜8 所示，光源发出的光线经激发光滤光片后成为单色光，此单色光激 发生物芯片产生荧光，荧光通过发射光滤光片后成像在c c d 光敏面上。c c d 把光 信号转变成电信号，然后再利用模数转换器把电信号转变成数字信号，最后通过 数据采集卡送入计算机，进行进一步的处理。 比较激光共聚焦生物芯片扫描仪和c c d 型生物芯片扫描仪可以发现二者各 有其不同特点。激光共焦生物芯片扫描仪中采用的荧光探测器件光电倍增管在可 浙江大学硕士学位论文 见光范围内是最灵敏的探测器，并可通过改变电压方便地改变它的灵敏度。与光 电倍增管比较而言，c c d 对微弱信号的放大功能不如光电倍增管。采用光电倍增 管需要设计复杂的光学系统，并需要设计高压偏置及低噪声放大电路，使得整个 检测系统复杂，成本高。现有的高灵敏度、低噪声c c d 器件可以很好地克服c c d 扫描仪的缺点，另外，c c d 可以一次同时读取整个芯片，从而大大提高获取图像 的速度。和激光共焦生物芯片扫描仪相比，c c d 型扫描仪还可以方便地利用计算 机强大的处理功能，对测量数据进行软件上的处理。同时它的结构简单，价格便 宜。综合以上考虑，在本项目中重点研究了采用c c d 的生物芯片荧光检测技术。 1 2 5 悬浮式生物芯片检测技术 当前，对于悬浮式生物芯片的荧光信号检测多是使用流式细胞仪作为分析平 台。川。其检测原理是使单个微球载体一个一个地通过检测通道，并使用两种 激光同时对微球载体上的分类荧光和报告分子上的标记荧光进行激发，再根据得 到的荧光信号，确定待测分子的种类和数量。其检测原理图如图1 9 所示。 图1 - 9 悬浮式生物芯片串行检测原理 图1 9 是悬浮式生物芯片串行检测原理图。激光l 1 用于激发微球载体上的 分类荧光，通过对分类荧光的分析可以获取微球的分类信息；激光l 2 用于激发 报告分子上的标记荧光，对此荧光进行进一步的分析可以得到反应过程中的数量 浙江大学硕士学位论文 信息。对于微球载体，通常情况下是使用两种不同强度的荧光进行光学编码，所 以这里会发出3 种荧光信号。在分光镜s 1 、s 2 的作用下，3 种荧光信号被分开 并分别为3 个p m t 接收，其中f 1 、f 2 、f 3 为相应p m t 前端的滤色片。在流式 细胞仪中，因为使用激光作为激励光，得到的激发荧光具有较高的功率密度，这 样可以大大提高系统的探测灵敏度，因此这种方法得到了广泛的应用。但是由于 该检测技术采用的是串行检测的方法，即微球探针是逐个通过检测区域，所以就 限制了检测的速度( 每秒钟只能检测几十个微球) 。另外，使用p m t 需要设计 复杂的光学系统和高压偏置及低噪声放大电路，使得整个检测系统复杂，成本高。 这些情况极大地制约了悬浮式生物芯片技术的发展。 为了克服采用流式细胞仪作为悬浮式生物芯片检测平台速度慢的缺点，悬浮 式生物芯片的并行检测方案也就应运而生，其原理如图l 1 0 所示： 图1 1 0 悬浮式生物芯片并行检测原理图 c d 3 图中s l 、s 2 、s 3 为分光镜，f l 、f 2 、f 3 是滤光片。在悬浮式生物芯片并行检 测技术中，使用脉冲氙灯配合滤色片作为荧光激发光源。待测试液流经的微通道 被设计成扁平状，其厚度约为1 0 0 u m ，由于在这个厚度下，可以很容易使得微球 浙江大学硕士学位论文 探针在激发光前进方向上单排分布，所以液流在检测时近似为二维流场。光源能 够对整个检测区域均匀照明，每次可以同时激发一片区域中多个微球上的荧光物 质发出荧光，从而实现了生物芯片的并行检测。激发的荧光中含有三种不同的成 分，经分光镜s 1 、s 2 、s 3 后实现三种荧光的分离，再分别被系统中使用的高灵敏 度c c d 接收。c c d 接收到的信号包括2 幅分类荧光图像和l 幅报告分子荧光图像。把 这些荧光图像经过a d 转换后送入计算机中加以处理，就可以得到包括待测分子 种类和数量的全部信息。当c c d 以一定的速度拍摄时，每秒钟检测的微球数将达 数千个。与采用流式细胞仪的串行检测方法相比，这种方法大大提高了悬浮式生 物芯片的检测速度。 1 3 本论文主要研究内容 论文主要介绍了悬浮式生物芯片并行检测中的图像采集系统，详细分析了该 系统的整个设计过程和最终实验结果，论文的主要内容包括： ( 1 ) 介绍了生物芯片技术的发展现状和应用前景，比较了固态生物芯片和悬浮 式生物芯片各自的优缺点。同时，对于生物芯片的分类、制备方法和荧光信号的 检测作了较为详尽地分析。 ( 2 ) 重点分析了悬浮式生物芯片的并行检测方案。针对悬浮式生物芯片的并行 检测，提出了一种采用c c d 和c p l d 器件的图像采集方案。在论文中分析了系 统方案的确定、主要器件的选型、硬件电路原理图设计、p c b 制作和硬件电路 调试的整个过程，并附带介绍了c c d 和c p l d 的工作原理。同时，针对硬件调 试过程中遇到的问题提出了相应的解决办法。 ( 3 ) 介绍了系统开发过程中用到的软件开发平台q u a r t u s i i 、c + + b u i l d e r 、k e i lc 和图像采集软件s i o n a s s i s 乜m ，在此基础上，介绍了软件部分的开发流程。 ( 4 ) 搭建了实验平台，进行了荧光的图像采集实验，分析了系统完成软硬件调 试后的实验结果。最后，对整个系统的设计过程进行了总结，讨论了系统存在的 不足和改进方案。 2 浙江大学硕士学位论文 1 4 本章小节 生物芯片技术是2 0 世纪以来的重大科技进展之一，它的出现必将给人类的 生活带来巨大变化。虽然生物芯片技术还处在发展阶段，但是已经在众多领域显 示出了广阔的应用前景。本章主要介绍了生物芯片技术的发展和应用，比较了固 态生物芯片和悬浮式生物芯片各自的优缺点。对于生物芯片的分类、制备方法也 作了简要地介绍。由于论文的核心内容是关于生物芯片的荧光信号检测，所以本 章用了较大篇幅介绍了当前常用的荧光检测手段。在本章的最后，概述了本论文 的主要内容。 浙江大学硕士学位论文 第二章悬浮式生物芯片并行检测系统方案设计 2 1 悬浮式生物芯片并行检测系统 在悬浮式生物芯片检测中，采用串行检测的方法每秒钟只能检测几十个微 球，这样的检测速度显然不能满足生物芯片大规模检测的要求。为了克服使用流 式细胞仪作为悬浮式生物芯片检测平台速度慢的缺点，这里我们研究了一种采用 面阵c c d 的悬浮式生物芯片并行检测方法。 图2 1 悬浮式生物芯片并行检测系统原理图 图2 1 是悬浮式生物芯片并行检测系统的原理图。系统中使用脉冲氙灯作为 荧光激发光源。由于氤灯光谱范围较宽，为了得到需要的波长的激发光，首先要 浙江大学硕士学位论文 通过分色器件分离出这些波长的光。这里需要二种波长的激发光：一种是波长约 为6 3 5 n m 的激发光，用来激发微球上的分类荧光；另一种是波长约为5 3 2 n m 的 激发光，用于激发报告分子上的标记荧光。这二个波段的光经过扩束镜l 1 后均 匀照射在微球流经的检测区域。扁平的微通道可以使得微球近似以单层通过检测 区域。在激发光的照射下，微球和待测分子分别发出波长为6 6 0 n m 、7 2 0 n m 的分 类荧光和5 8 0 n m 的报告荧光。荧光的强度跟激发光的功率和荧光物质的数量成正 比。聚焦透镜l 2 用于收集三束荧光光线。荧光信号经过分光镜s 1 和s 2 后可以 分别得到这三束荧光。波长为7 2 0 n m 的分类荧光经过滤色片f 1 后被c c d l 接收； 波长为6 6 0 n m 的分类荧光经过滤色片f 2 后为c c d 2 接收；波长为5 8 0 n m 的报告荧 光经过带通滤色片f 3 后为c c d 3 接收。c c d 4 获得的图像为全息干涉条纹，全息 干涉条纹是波长为6 3 5 m 光线通过检测区域时微球引起的前向散射光和通过微 球探针间隙的直射光干涉产生的。由此全息干涉图可以得到微球的位置和尺寸信 息。 整个检测系统的通量是由c c d 的拍摄速度、c c d 光敏面的大小、成像物镜 放大倍数、微球间的分布距离等决定的。如果光源采用脉冲氙灯，检测区域大小 为1 m m 1 m m ，微球之间的统计平均间距为1 0 0 u m ，则每次采集到的荧光图像 中约包含1 0 0 个微球。如果c c d 拍摄速度为每秒1 0 帧，则1 秒内可检测1 0 0 0 个微球。可见这种并行检测方法大大提高了悬浮式生物芯片的检测速度| 2 2 。”。 2 2 悬浮式生物芯片并行检测系统结构介绍 2 2 1 微流场子系统 微流场系统是悬浮式生物芯片检测系统的重要组成部分，它包括三个部分： 流速控制装置、液流推进装置和液流承载装置。系统对微流场的设计要求如下： ( 1 ) 为了保证每个微球通过检测区域时只被c c d 记录一次，要求流场无回流。 ( 2 ) 为了保证每个带有荧光信息的微球都被检测到，要求流场连续、均匀、 平稳。 ( 3 ) 为了使微球通过检测区域时的速度和c c d 拍摄速度相匹配，要求能对流 浙江大学硕士学位论文 场速度进行控制。 检测区域 图2 2 悬浮式生物芯片检测系统中的微流场系统 图2 2 为悬浮式生物芯片检测系统中的微流场系统示意图。在此系统中，利 用步进电机实现流速控制；液流推进装置是由微量进样器实现的；液流承载装置 是由特别加工的微通道器件实现的。微通道的加工和液流的平稳推动是微流场系 统中的两个关键问题。为了能正确采集荧光图像，系统对微通道的透光率、平整 度、内部光洁度也有较高要求。通道加工通常有机械加工、激光刻蚀、湿法刻蚀 等方法。微通道呈扁平状，其厚度和微球在液流中的平均间距接近，因此微球在 流经检测区域时近似为二维分布。检测区域的大小与光学成像系统的放大率和 c c d 的光敏面大小有关。 2 2 2 光学子系统 在悬浮式生物芯片中，每个微球能结合的荧光分子极少。采用高强度的光激 发可以产生较多的荧光光子，提高检测灵敏度，所以在生物芯片扫描仪中经常采 用激光、氙灯、金属卤素灯等高强度光源。 由于荧光材料一般都存在光漂白现象，即荧光分子在激发光的照射下，产生 荧光的能力会逐渐变弱直至消失。光漂白的程度跟光照强度和照射时间有关，光 强越大，持续照射时间越长，则被漂白的程度也越大。在多次重复扫描时一定要 考虑光漂白作用带来的影响。由于波长短的激发光对荧光材料的光漂白作用较为 明显，所以生物芯片检测系统中用到的激光光源多选用波长较长的激光器。气体 激光器的能量较为稳定，功率也较大，波长可以从4 2 0 n i n 至近红外区，比较适 于在生物芯片扫描仪中使用，但是其体积较大，价格较贵。固态激光器和半导体 激光器功率一般不及气体激光器，但是体积较小，价格也相当便宜，因而在生物 】6 浙江大学硕士学位论文 芯片中也经常使用。为了激发微球载体上的不同荧光，需要使用不同波长的激发 光去照射检测区域，常用的激光波长为4 8 8 n m 、5 1 4 n m 、5 3 2 m 、5 4 3 n n l 、5 9 4 m 、 6 1 2 啪、6 3 3 m 、6 3 5 n m 等，功率为5 m w 至3 0 m w 。另外，在激光器输出后面 设置滤色片可以有效地降低系统噪声和减少背景光干扰| 2 “。对于c c d 型生物芯 片扫描仪，常使用发光强度大、发射光谱连续均匀的氙灯。金属卤素灯由于具有 发光效率高、寿命长、价格低廉的优点，也常被用于c c d 型生物芯片扫描检测 系统中 蕾l 。当使用氙灯或金属卤素灯等作为激发光源时，应配合使用高质量的 窄带干涉滤光片。在本系统中使用的是脉冲氙灯，在同步信号作用下可以实现 c c d 对流场的连续拍摄。 在光学子系统中另一个非常重要的器件是滤色片。光源分色时需要使用滤色 片从光源中提取出符合激发光光谱波段要求的光束，这种滤色片称为激发光滤色 片。另外，为了避免干扰，在c c d 接收前端也要使用滤色片来滤掉荧光信号范 围以外的杂散光，只让正确激发的荧光信号通过，这种滤色片称为发射光滤色片。 在激发光照射下，反应后的悬浮式生物芯片会发出三种不同波长的荧光，并 且这三种荧光混杂在一起。为了使每种波长的荧光只被一个c c d 探测到，需要 使用分色镜将这三种荧光分离。荧光信号在分色镜的作用下分成三束，每束光中 只包含一个波段的荧光，然后再分别由相应的发射光滤色片滤波后为c c d 接收。 2 2 3 图像采集和处理子系统 在悬浮式生物芯片检测系统中，图像的采集和处理也是其重要组成部分。当 携带有生物反应信息的微球通过检测区域时，在脉冲氙灯激发下，发射出三种波 长分别为5 8 0 n m 、6 6 0 n m 和7 2 0 n m 的荧光。在这些荧光信号经过成像和分色系统后， 分别用3 个c c 叻口以采集。c c d 的输出是和荧光光强成线性关系的电压值，然后再 把电压信号送入a d ，经过a d 转换后的数据通过数据采集卡传送到计算机中去 并重新生成图像。 图2 3 表明了悬浮式生物芯片并行检测系统中图像采集的原理。 浙江大学硕士学位论文 图2 3 悬浮式生物芯片并行检测系统图像采集原理图 由于荧光信号比较弱，因此需要使用高灵敏度、低噪声的c c d 进行采集。本 系统中使用的是k o d a k 公司的k a f 0 4 0 2 m e 型c c d ，分辨率为7 6 8 5 1 2 像素，像 素尺寸为9 m 9 炉。另外，由于需要传输的图像的数据量比较大( 每帧图像大 小约为6 3 mb i t s ) ，特别是在连续采集时数据量更大，因此在系统中使用了专 用的图像采集卡p c i 一1 4 2 2 以实现数据的高速传输。本系统中用到的其他主要器 件有：a l t e r a 公司的e p m 3 2 5 6 型c p l d 、a n a l o gd “i c e 公司的模数转换器件 a d 9 8 1 6 j s 。a t m e l 公司a t 8 9 c 2 0 5 l ，它主要用于对a d 9 8 1 6 的寄存器加以配置。 对于采集到的荧光图像，还需要经过一系列的处理和分析之后，才能从中得 到最终的生物学意义上的结论。图像处理过程包括图像中噪声的去除、微球的快 速识别和定位、荧光信号强度的提取等。 2 3 本章小节 为了克服当前悬浮式生物芯片串行检测速度慢的缺点，本章研究了一种并 行检测方案。在此方案中，专门设计的微通道可以使微球探针并行通过检测区域， 从而大大提高了检测速度。本章首先从总体上介绍了悬浮式生物芯片并行检测的 原理和方法，然后又分别从微流场子系统、光学子系统、图像采集和处理子系统 三个方面分别进行了详细的分析，从理论上分析了悬浮式生物芯片并行检测方案 的可行性。 浙江大学硕士学位论文 第三章悬浮式生物芯片图像采集系统设计方案 3 。1 悬浮式生物芯片图像采集系统要求分析 本课题所设计的悬浮式生物芯片图像采集系统主要作用是对生物芯片检测 过程中的荧光信号成像，并把得到的图像传输到上位机中保存。其具体的设计要 求包括如下几点： ( 1 ) 正确实现图像的获取和稳定传输； ( 2 ) 在图像采集过程中，能够实现单帧采集或者连续采集，连续采集要求速 度能够达到1 0 帧秒； ( 3 ) 当检测时间较长时，要求该图像采集传输系统具有较强的抗干扰能力， 工作稳定性好； ( 4 ) 从用户方面考虑，要求系统方便用户操作、便于维护。另外，考虑到市 场发展的因素，还要求系统与外界的接口具有良好的兼容性，易于扩展。 3 。2 悬浮式生物芯片图像采集系统的方案分析 3 2 1 图像采集器件的选择 通常意义上，图像采集器件的主要功能都是把外界的景物以图像的形式记录 下来。在本系统中，图像采集器件的作用是接收探测分子和报告分子发出的荧光 信息。由于悬浮式生物芯片中待探测的荧光信息极其微弱，因而这里要求探测器 件必须具有很高的灵敏度。 常用的图像采集器件主要有2 大类：真空图像传感器和固体图像传感器州。 真空图像传感器包括摄像管、变像管、像增强器等。其中摄像管是一种把可见光 或不可见光( 红外、紫外等) 图像转换为相应电信号的光电子器件：变像管的主 要作用是把不可见光图像转换成可见光图像：像增强器除了能够实现图像的光信 号到电信号的转换外，还能增强微弱的光信号的强度。固体图像传感器主要包括 c c d 型图像传感器和c m o s 型图像传感器。c c d 图像传感器具有快速自扫描、动 态范围大、复现性好、分辨率高的特点，特别是其具有的快速检测特性更是有着 浙江大学硕士学位论文 广泛的应用。c c d 的缺点在于不能把光敏单元阵列与驱动电路及信号处理电路集 成在一起，不易处理模数转换器、精密放大器、存储器等元件的功能，驱动脉 冲复杂，工作电压相对较高，而且不能与深亚微米超大规模集成技术( v i 。s i ) 兼 容。c m o s 成像技术在2 0 世纪8 0 年代逐渐成熟，9 0 年代初期c i o s 器件的集成规模已 经达到了百万。由于c m o s 器件可以采用v l s i 技术制造，并且可以把时钟信号、控 制电路、信号处理电路、模数转换电路等与图像传感阵列完全集成在一起，因而 可以极大降低成本和功耗。目前，c m 0 s 器件在噪声水平、量子效率、动态范围方 面仍不能和c c d 相比拟。 在本项目中，由于待探测的荧光信号极其微弱，所以对成像器件的灵敏度和 噪声水平有着很高的要求，这里我们选用了k o d a k 公司的k a f 0 4 0 2 m e 增强型c c d 作为荧光探测器件。 k a f 0 4 0 2 m e 产品主要性能参数如下： 二相驱动面阵c c d ，7 6 8 h 5 1 2 v 波长响应范围3 5 0 n m 1 0 0 0 n m 室温下动态响应范围7 6 d b 最大量子效率7 7 最大数据传输速率l o m h z 灵敏度1 0 uv e 暗电流 1 0 p a c m 2 2 5 光敏面积6 9 l ( h ) m 4 6 ( v ) 眦，像素尺寸9 0 um 9 0 um 在k a f 一0 4 0 2 m e 中，为了提高c c d 的响应范围，在每个像素单元上都有一个半 圆柱状的微透镜( m i c r o1 e n s ) 吲。微透镜可以把射向c c d 光敏面以外的光线转 向光敏面，从而大大提高每个像素的光线收集效率。微透镜结构如图3 一l 所示。 浙江大学硕士学位论文 图3 1k a f 一0 4 0 2 m e 中微透镜结构示意图 3 2 2 系统控制芯片的选择 在整个图像采集系统中，逻辑控制芯片是其中的核心器件，它的主要作用是 控制c c d 、a d 等各个分系统的互连和不同工作状态的转换。其具体作用包括以 下几点： ( 1 ) 产生c c d 的行、场同步时序， 息正确输出到模数转换器中。 ( 2 ) 产生模数转换器件的控制时序， 正确得到图像的数字化结果。 从而使得c c d 能够把得到的图像信 并且实现a d 和c c d 输出的同步， ( 3 ) 产生图像传输过程中c c d 、a d 与图像采集卡之间的同步信号。 ( 4 ) 用于在图像单帧输出、连续输出等不同工作状态之间的切换。 在电子电路系统中，常用的控制芯片包括微控制器( m c u ) 、微处理器( m p u ) 和可编程逻辑器件( p l d ) 等几种芯片，根据这些芯片各自的性能不同，它们的 应用领域也有所不同。m c u 即常用的单片机，其典型代表为l m e l 的5 1 系列单 片机，这类器件已经在市场上应用多年，早已经形成成熟的设计理念并得到了广 泛的软硬件支持，另外单片机还有工作稳定性好、环境适应能力强、价格低廉等 优点。其缺点是难以适用于复杂的电路控制中。微处理器是在精简指令集计算机 ( r 1 s c ) 概念提出来之后出现的一种新型处理器，主要包括a r m 、m i p s 、 p o w e r p c 等系列芯片。微处理器有着更加强大的运算处理功能、更快的运行速 溪汪大学蠖士学位论文 度，但同时芯片的价格也相应提高，由于这类处理器的设计思想多怒基于嵌入式 操终系统的设计愚路，因越茏法达到完全熬实时处理经韪。可编稷逻辑器彳孛是邋 几年出现的一种新型控制器件，它是在蕊片上按一定静方式集成大爨的与菲门和 触发器等基本逻辑元件，使用时将这些片内元件按照鼷求连接起来即可实现特定 靛功能。鬻越躬可壤程逻辚器转又分必笈杂可编程逻辑器 串( c p l d ) 移现场可 编程逻辑门阵列( f p g a ) 褥种。p l d 芯片采用硬件编程慝想，功能强大，设计 照加灵活，广泛应用于复杂的电路控制系统中。 结舍本燕绫设诗夔其髂媾提弱要求，撬爨建惩了a l 钯f a 公霉生产豹琶p m 3 2 5 6 ( 1 、q f p ) 芯片作为系统的控制芯片。潦过对实际器件的编程和验证，该芯片究 仝符合我们的设计需要。综合和仿真的结果表明，此芯片不仅满足当前系统设计 瓣簧要，纛蕊瞧绔系统戳嚣鹣扩震嫖窝了充分嚣褡鬃。舞予a d 嚣耱爨寄存器设 精采用的是一种近似的1 2 e 总线结构，而单片机可以锻方便的实现1 2 c 时序结构， 因此对于a d 寄存器的控制采用了a 椭e l 公司的a t 8 9 c 2 0 5 1 单片机。图3 2 为 磁a x 3 2 5 6 痰郄绪穗蕹鬻。葵侯毫毫基为3 3 v ，共畜s 8 繇争虿矮露，2 5 6 令宏攀 元，用户可自定义的引脚多迭1 1 6 个。 图3 2e p m 3 2 5 6 ( 1 d f p ) 内部结构框图 浙江大学硕士学位论文 3 2 3 模数转换器件 c c d 把探测到的图像信息转换成电压信号，为了能够把图像存储在计算机 中，就需要利用模数转换器件把模拟电压值转换成数字信号。这里我们选用了 a n a l o gd e v i c e s 公司的a d 9 8 1 6 ，它是一款主要用于处理c c d