（化学工艺专业论文）三七茎叶提取物中皂甙成分定性及三七皂甙Fa的制备.pdf

中文摘要 本文运用高效液相色谱一质谱和质谱质谱联用技术，在适宜的分析条件下， 对三七茎叶提取物中的皂甙成分进行分离并定性。同时，运用制备型高效液相色 谱，确定了从三七茎叶提取物中制备三七皂甙f a 的工艺条件。 高效液相色谱一质谱和质谱质谱联用技术是对中药成分定性的一种重要手 段。本实验确定液质联用中液相色谱的分离条件为：乙腈一l m m 的醋酸氨水溶液 作为流动相进行梯度洗脱，最终共分离出1 2 种皂甙。通过研究其一级质谱和二 级质谱，对1 2 种皂甙进行定性，分别为人参皂甙r g l ，r b l ，r e 及其同分异构 体，r b 2 ，r b 3 ，r d ，三七皂甙r i ，f a ，f c ，f e 和绞股兰皂甙。 以三七茎叶提取物为原料，三七皂甙f a 为目的产物，直接利用制备型高效 液相色谱从原料中提纯三七皂甙f a 。分别考察了流动相配比、流动相流速以及 原料上样量对分离过程和产品纯度的影响，最终确定了适宜的制备色谱条件为： 流动相流速是3 0 m l m i n ，流动相配比为甲醇：水= 7 0 ：3 0 ，原料上样量o 3 0 4 9 。在 此条件下，制得的三七皂甙f a 的纯度为9 1 2 。将制得产品进行液质分析，确 定为目的产物三七皂甙f a 。 关专目阑：三七茎叶提取物，三七皂甙f a ，制备型高效液相色谱， 高效液相色谱一质谱联用 a b s t r a c t i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t h eh p l c e s i m sa n dm s m st e c h n o l o g yw e r eu s e dt os e p a r a t e a n di d e n t i f ys a p o n l n si np a n a xn o t o g i n s e n gl e a v e sw i t hap r o p e ra n a l y t i c a lc o n d i t i o n b e s i d e s n o t o g i n s e n o s i d ef aw a si s o l a t e df r o mn o t o g i n s e n gf o l i u mw i mad e t e r m i n e d o p t i m a lt e c h n o l o g yb yu s i n gh p l c h p l c - m st e c h n o l o g yw a sav e r yi m p o r t a n tm e t h o dt oi d e n t i f yt h ec o m p o n e n t so f c h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e s ar e v e r s e d - p h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h i cm e t h o dw i t hg r a d i e n te l u t i o n ( a q u e o u sl m mn h 4 0 a c ，b u f f e r e d t o p h = 7w i t hn h a o h a c e t o n i t r i l e 、w a sp e r f o r m e di nt h i sw o r ka n d1 2k i n d so fs a p o n i n s w e r es e p a r a t e d t h em sa n dm s m st e c h n o l o g yo f t h es e p a r a t e ds a p o n i n sw e r e i n v e s t i g a t e da n dt h es a p o n i n sw e r ei d e n t i f i e da sg i n s e n o s i d er g l ，r b l ，r b 2 ，r b 3 ，r d ， r ca n di t si s o m e r , n o t o g i n s e n o s i d e sr a ，f a , f c ，f ea n dg y p e n o s i d ei x r e g a r d i n gn o t o g i n s e n gf o l i u ma sm a t e r i a l sa n dn o t o g i n s e n o s i d ef aa st h ep r o d u c t ， r e v e r s e p h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y w a su s e dt o p u r i f y n o t o g i n s e n o s i d ef a t h ee f f e c t so fq u a n t i t yo fl a wm a t e r i a l s ：t h er a t i oa n dt h ef l o w r a t eo ft h em o b i l ep h a s ei nt h es e p a r a t i o np r o c e s sw e r ei n v e s t i g a t e dr e s p e c t i v e l y , a n d t h u st h es u i t a b l ec h r o m a t o g r a p h yc o n d i t i o nw a sd e t e r m i n e d ：t h em o b i l ep h a s ew a s c o m p o s e do fm e t h a n o la n dw a t e rw i t har a t i oo f7 0 ：3 0 ，t h ef l o wr a t eo fm o b i l ep h a s e w a s3 0 m l m i na n dt h eq u a n t i t yo fl a wm a t e r i a l sw a s0 3 o 4 9 u n d e rt h ec o n d i t i o n s e s t a b l i s h e da b o v e t h ec o n t e n to f n o t e g i n s e n o s i d ef a w a sa b o v e9 l k e y w o r d s ：n o t o g i n s e n gf o l i u m ，n o t o g i n s e n o s i d ef a ， r e v e r s e - p h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yf o rp r e p a r a t i o n ； h p l c m s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：孑i 嗡 签字日期： 舢6 年o l 月曲日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨室盘生有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤壅盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：扣i 确， 签字日期：如5 年文月釉日 新签确令。、 签字日期占稚奠月力日 ， 前言 前言 三七是中国传统的珍贵药材，主要分布在云南省东南部的文山、蒙白和广 西壮族自治区西部的田东、田阳、靖西等地。三七成分复杂，其中皂甙是三七的 重要组成部分。临床研究表明，三七皂甙能降低动脉血压、扩张脑血管、抑制血 小板聚集，效果显著，此外还具有抗炎、抗心率失常、减少肝细胞损伤、降低血 糖等药理作用。 迄今为止，从三七的不同部位中已分离到3 0 多种单体皂甙成分。三七中皂 甙成分很多与人参相同，如r b l 、r b 2 、r b 3 、r c 、r d 、r e 、r g l 、r g a 、r h l 等， 也有些是三七独有的皂甙成分，如三七皂甙( n o t o g i n s e n o s i d e ) r l ，r 2 ，r 3 ，r 4 ， 心、f a f c 和f e 等。然而不同的皂甙单体药理作用是不同的，有些甚至截然相 反。如人参皂甙r 9 1 具有使神经系统兴奋和抗疲劳的功能，而人参皂甙r b l 具有 抑制神经系统活动和抑制应激引起的胃炎形成的作用。因此，为了更好的控制中 药的质量，有必要对三七不同部位的不同皂甙成分进行分离和定性。 三七皂甙f a 是三七特有皂甙，近年来研究表明其具有多种药用作用。因此 按照天然药物化学的研究方法，有必要分离并提纯出三七皂甙f a ，并进一步进 行药理药效的研究。 本文采用高效液相色谱一质谱和质谱质谱联用技术对三七茎叶提取物进行 分离和定性。通过建立适宜的色谱分析条件，从三七茎叶提取物中分离并鉴定了 1 2 种皂甙成分。同时，采用反相制备型高效液相色谱法，以三七茎叶提取物为 原料，对三七皂甙f a 进行分离纯化。确定了适宜的制备条件，得到纯度为9 1 2 的三七皂甙f a 。 第一章文献综述 1 1 三七概况及研究进展 1 1 1 三七概况 第一章文献综述 三七为五加科植物( p a n a xn o t o g i n s e n g ( b u r k ) f h c h e n ) 的根，主产于我国 广西、云南等省区，是我国特产的传统珍贵药材，它具有消肿定痛、散淤止血等 多种药理和生物活性，是经典的止血良药，是驰名中外的“云南白药”的主要成分 1 1 。目前有关三七的化学结构、化学成分、生理活性、药理实验及临床治疗得到 了普遍重视。 三七的化学成分比较复杂，主要含有皂甙、黄酮、蛋白质氨基酸、多糖蛋 白、甾醇无机物、挥发油和油脂等成分1 2 】。三七中的活性成分以多种达玛烷型四 环三萜皂甙为主【3 】。 1 1 2 三七皂甙的成分 三七皂甙是三七的一类最具特征性的活性成分，对三七皂甙的深入研究己 成为三七新药开发的主要内容。同时通过对三七进行化学分析和实验药理学、毒 理学研究表明，三七皂甙具有抗疲劳、止血、耐缺氧、抗衰老、降血糖和提高肌 体免疫功能等多方面作用，其中很多方面与人参皂甙作用相似 4 1 。但也有研究表 明：在抗衰老、耐缺氧、提高肌体免疫力方面，在相同剂量下，三七皂甙的作用 大于人参皂甙，因此三七成为目前更有潜力的贵重中药材。 目前为止，从三七中共分离出3 0 余种皂甙成分例，总皂甙含量6 2 4 一1 0 3 2 ， 其中三醇型皂甙与二醇型皂甙的比例为3 ：1 。三七中还含有其独特的皂甙成分， 如三七皂甙( n o t o g i n s e n o i d e ) r i 、r 2 、r 3 、r 4 、r 6 、f a 、f c 、f e 等。在三七的不 同生长部位中，皂甙组成不同，含量各异，药理作用也不尽相同。据报道， 地 下部分以2 0 ( s ) 原人参皂甙三醇型为主，药理作用表现为对中枢神经有兴奋作用； 而地上部分则相反，以2 0 ( s ) 原人参皂甙二醇型为主，对中枢神经有抑制作用。 因此，尽管三七中的皂甙成分与人参相似，但三七本身含有特有的皂甙成分， 而且皂甙含量及总皂甙中各单体皂甙比例与人参亦不同，这也是三七的药用区别 于人参的原因之一。三七的不同部位中所含皂甙具体情况如表1 1 t ”。 第一章文献综述 表1 - 1 三七中皂甙成分与分布 t a b l e1 - 1c o m p o n e n ta n dd i s t r i b u t i o no f s a p o n i n sf i o mp a n a x n o t o g i n s e n g 皂甙种类 根 根茎茎叶花蕾果梗种子 人参皂甙 人参皂甙人参皂甙 r b l ，r b 2 ， 人参皂甙 r b br b 3 ,人参皂甙r h ，r b 3 ，人参皂甙 g d 2 0 ( s ) r c2 0 ( s ) r b l ，r b 3 ，r c ，三七r b l ，r b 3 ， 人参皂甙 “ ” 人参皂甙r d ，f 2 三七皂甙f a r c ，r 正三 原人参二r 勘，绞股 三毛甙r 勘，绞股 皂甙f e ，绞f c ，f e 七皂甙f a 醇型蓝皂甙 蓝皂甙，股蓝皂甙绞股蓝皂f c ，绞股蓝 x ，三七 三七皂甙 甙，皂甙 皂甙甩f c ，f e x v ，x 原人参三 醇型 人参皂甙 r e ，r g l ， r e , 2 ，r h j 2 0 - 0 葡萄 糖人参皂 甙r f 人参皂甙 r e ，r g l ， r 9 2 , r h l 三七皂甙 r 1 ，r 2 ，r 3 ， p - 4 人参皂甙 r e 三七皂甙 r i 1 1 3 三七的药理作用和临床应用 五加科人参属植物三七的主要有效活性成分，含有多种单体皂苷。具有扩 张血管，降低心肌耗氧量，抑制血小板凝集。延长凝血时间，降血脂，清除自 由基，抗炎，抗氧化等药理作用，临床上主要用于心脑血管疾病的治疗【7 】【8 】。近 年来随着对其研究的不断深入，又发现了许多新的药理作用和临床用途，现综 述如下。 1 药理作用 ( 1 ) 缺血再灌注损伤的保护作用1 9 l 三七总皂甙通过抑制n b k b 的活化，减少中性粒细胞黏附分子表达及中性 粒细胞与内皮细胞黏附减少而起到心肌保护的作用；阻断中性粒细胞激活、浸润 第一章文献综述 和聚集，减轻缺血脑组织的炎症反应。保护缺血脑组、织保护神经元，降低脑缺 血后梗死体积比及水肿体积。 ( 2 ) 对神经细胞损伤的保护作用【1 0 l 刘雯等采用s k - n s h 细胞无糖培养方法，建立神经细胞能量代谢障碍模型， 通过细胞学、形态学与脂质过氧化损伤指标的检测，观察三七总皂甙对模型细胞 的保护作用。结果无糖培养下细胞皱缩、形态不完整，用药后细胞形态正常，神 经细胞存活数增加，细胞凋亡数降低，细胞脂质过氧化损伤减轻，表明三七总皂 甙对能量代谢障碍引起的神经细胞损伤有保护作用。 ( 3 ) 抗炎【1 1 】 三七总皂甙对多种实验性炎症模型有着良好的抗炎活性。它可抑制烫伤后巨 噬细胞t n f o t 的生成，抑制n f k b 活性。 ( 4 1 促进造血细胞生长 郑茵红等研究发现三七总皂甙对造血祖细胞有增殖作用。 ( 5 ) 对脊髓损伤早期的保护作用 三七总皂甙能明显改善损伤脊髓的微循环，保护脊髓的神经传导功能，对损 伤脊髓具有保护作用。 ( 6 ) 其它【1 2 】 三七总皂甙可抑制动脉血管的平滑肌细胞增殖，这是防治动脉粥样硬化发展 的重要环节；三七总皂甙可作为心肌细胞钙通道阻滞剂，这在离子通道水平上研 究对大鼠心肌细胞l 一型钙电流的抑制作用中得到了证实；三七总皂甙的钙通道 阻滞作用还可阻滞损伤后神经细胞内钙超载，保护颅脑损伤；三七总皂甙可降低 肾性高血压大鼠血压，增加肾组织n o s o d 含量；还可降低n b 4 细胞的促凝活性 及t f m r n a 的表达，诱导n b 4 细胞部分分化，有望作为新的抗凝药物。 2 临床应用 ( 1 ) 预防冠脉内支架植入术后再狭窄1 1 3 】 李淑梅等测定6 0 例病人用药前后q t 离散度，提示三七总皂甙有预防再狭窄 的作用。 ( 2 ) 糖尿病性神经病变等【1 4 1 李安发用路路通注射液治疗2 5 例2 型糖尿病合并周围神经病变患者，总有效 率7 2 ，与对照组比有显著差异性。 ( 3 ) 婴儿腹泻【1 5 】 裴淑丽等报道8 2 例腹泻婴幼儿静滴三七总皂苷注射液，结果平均止泻时间明 显短于对照组，且未发现不良反应。 ( 4 ) 毛细支气管炎 4 第一章文献综述 裴淑丽等对5 6 例“毛支”患儿在常规治疗的基础上加用三七总皂苷注射液，效 果较好且未发现不良反应。 ( 5 ) 脑出血 2 5 2 例急性脑出血患者早期使用三七总皂甙，提示脑出血早期应用三七总皂 甙治疗能促进血肿吸收，显著缩短水肿带的消失时间。 ( 6 ) 颅脑损伤 艾文兵等治疗急性重型颅脑损伤病人8 9 例，治疗组在常规治疗的基础上力n - - - - 七总皂甙，结果颅内压显著升高和重度脑水肿者较对照组明显减少，两组间差异 有显著性意义。 1 1 4 三七叶甙的提取分离方法 制备三七叶甙单体通常先从人参属植物三七的茎叶原料制备三七叶总皂 甙；再将三七叶总皂甙分离制备出三七叶甙单体。 1 三七叶总皂甙的提取分离方法【l 6 】 常用的三七叶总皂甙的分离提取方法可大致分为五种：冷渍法、有机溶剂萃 取法、酸水解法、大孔吸附树脂法、超声波提取法。其中，冷渍法为药典方法， 但较为费时。超声提取法省时省力，适用于工厂生产检验。大孔吸附树脂法提取 三七叶总皂甙的提取率在8 8 以上，且用该法能除去糖类等水溶性杂质及大部分 脂溶性杂质，降低了提取物的吸潮性，色泽好，同时纯度高，质量稳定。 因此综合考虑溶剂用量、乙醇浓度、加热时间对三七叶总皂甙的影响，现 行三七叶总皂甙的提取分离工艺为：提取溶剂用量为药材重量的1 3 倍，乙醇浓 度为3 0 ，加热时间为4 0 分钟，提取温度为7 0o c 。用乙醇加热回流提取，再用 正丁醇萃取或大孔吸附树脂纯化等，同法提取2 次，平行操作3 份，三七叶总皂 甙的平均提取率为9 4 9 2 。本法具有耗醇量少、提取率高、生产成本低的优点， 更适合工业生产。本实验中用已制备好的总皂甙样品，故此处只作简单说明。 2 三七叶甙单体的提取分离方法旧 ( 1 ) 硅胶柱层析 硅胶柱层析是最常用的皂甙分离方法。常采用的溶剂为不同比例的氯仿甲 醇水，水饱和乙酸乙酯与不同比例的甲醇混合物，以及正丁醇乙酸乙脂水，氯 仿甲醇乙酸乙脂一水，氯仿甲醇等不同比例的混合溶剂，经过反复层析可获得 皂甙单体。 硅胶柱层析常用的还有低压柱层析，即用薄层层析展开的吸附剂和展开剂， 在装紧的柱子上，l 5 k g c m 2 的压力下进行柱层析，以分离皂甙单体纯品，如三 七皂甙b l ，b 2 ，b 3 的分离。低压柱层析法优点是省时间及溶剂，每操作1 次， 第一章文献综述 约3 6 小时，分离效果也优于一般硅胶柱层析i l 卅。 硅胶柱层析还有干柱层析【l9 1 ，即用薄层层析条件，在装紧干柱上以展开剂 展开，溶剂展开完全后，按一定长度分段切割，各切割部分以乙醇洗脱后浓缩， 再以t l c 检查其纯度或色点。又如三七根皂甙d 2 与d 3 的分离即人参皂甙r d 和绞股蓝皂甙x v 的分离。 ( 2 ) 反相柱层析 在硅胶载体上涂敷非极性固定相，十八烷基硅烷键合硅胶( o d s ) ，常用有 l o l o rr p 8 ，r p 1 8 反相层析，以梯度甲醇洗脱，极性大的成分先出柱，一般用 于硅胶不易分离的极性皂甙，如三七叶中绞股蓝部分的精制，人参皂甙r e 的分离精制。熟三七皂甙的成分分离中【2 0 】，柱层析用硅胶，以氯仿甲醇水 ( 5 0 ：1 0 ：1 2 0 ：1 0 ：1 ) 系统梯度洗脱，有的部分以m c ig e l ，c h p 2 0 作填料，进行 反相柱层析，6 5 - - 8 5 甲醇洗脱，分得人参皂甙r 9 3 ，r 9 2 ，r e ，r d 和三七皂甙 r l ，r 2 及r 4 的单体皂甙。 ( 3 ) 离心薄层层析法 利用离心薄层层析仪分离纯化皂甙单体，其分离周期短，效果好，还节省 溶剂和吸附剂，对需求小量纯品皂甙是有效的分离纯化手段。张新郁【2 l 】应用北 京青云仪器厂出品的l b c 1 型离心薄层层析仪分离纯化三七总皂甙中的人参皂 甙r g l 、r b l 及r e 。离心薄层层析板为含草酸钠的硅胶h f 2 5 4 c m c n a 板，涂布器 制成薄板，室温凉干，8 0 9 0o c 烘3 小时备用。注样方法为开动薄层板旋转马达， 然后推动注射器匀速滴皂甙样品甲醇溶液于旋转的薄层板上，控制样品环宽在 0 3 o 4 c m ，甲醇挥发后进行洗脱，洗脱剂的系统为c h ：c h m e o h ( 9 5 ：3 0 ，8 0 ：3 0 ， 7 5 ：3 0 ，6 5 ：3 0 ，1 5 ：1 ) ，每份收集5 - 1 0 m g 的洗脱液。 ( 4 ) 高效液相色谱法f f i p l c ) 此方法需要高效液相色谱仪，高效液相色谱由于对挥发性小或无挥发性、 热稳定性差、极性强、特别是具有某种生物活性的物质提供了非常适合的分离分 析环境，因而广泛应用于生物化学、生物医学、药物临床、石油化工、合成化学、 环境检测和食品卫生【2 2 】等领域。适用于定量分析及分离一般方法难以分离的皂 甙，其中也有反相的h p l c 。如三七根中的三七皂甙r l 及人参皂甙r e 混合物的 分离【2 3 】。该混合物通过t o y as o d ah i c8 0 2u r 液相色谱仪，t s k - g e l l s - 4 1 0 柱 ( 7 5 m m x 3 0 c m ) ，流动相为甲醇水( 5 5 ：4 5 ) ；流速，2 0 m l m i n ，折光仪检测，上样 量为l m l ( 2 0 m g m 1 ) 。可分离出人参皂甙r e 和三七皂甙r l 。 又如分离根中的绞股蓝皂甙x v i i ，也是通过制备型的h p l c ，柱为r a d i a l p a ka ( o d s 硅胶，8 m m x l o c m ) ，溶剂为8 0 的甲醇水，流速1 3 m l m i n ，使用 折光仪( w a t e r sr - 4 0 1 ) 检测。 第一章文献综述 ( 5 ) 薄层层析 用于鉴别皂甙及其纯度，常用硅胶g 板，以蒸馏水调和铺板，或用硅胶一c m c n a 板，以硅胶和o 5 1 的羧甲基纤维钠调和铺板，羧甲基纤维素钠溶液吸取上 层透明澄清供用。用于分组皂甙分离的展开剂为c h c l 3 - m e o h h 2 0 ( 6 0 ：4 2 ：1 ) 均 相。 反相薄层层析：用高效薄层层析板r p 8 f 2 5 4 和r p 1 8 f 2 5 4 ( m e r c k 公司) ， 展开剂为6 0 8 0 的甲醇等。薄层板上极性大的皂甙r f 值大，而极性小的皂甙r f 值小。 显色剂：常用1 0 硫酸乙醇液或饱和硫酸氢铵乙醇溶液，1 0 5o c 加热1 0 分 钟或1 1 5 1 2 0 0 c 加热5 7 分钟，呈红紫色点。但在紫外光灯3 6 5 n m 下观察，原 人参二醇皂甙呈亮紫色，原人参三醇皂甙呈橙色1 2 4 】。 ( 6 ) 乙酰化衍生物分离法 用于一般方法难于分离的皂甙，如三七果梗中的人参皂甙r b l 及人参皂甙 r b 3 的分离，混合皂甙以醋酐、吡啶进行乙酰化，所得乙酰化衍生物通过硅胶柱 分离，以石油醚一丙酮( 6 5 ：3 5 ) 冲洗，分离的人参皂甙r b l 乙酰化衍生物及人参 皂甙r b 3 的乙酰化衍生物以三乙胺进行脱乙酰基，产物再通过硅胶柱层离，以氯 仿甲醇- 水( 6 5 ：3 5 ：1 0 ) 冲洗，可得人参皂甙r b l 及r b 3 的纯品。 1 1 5 三七及其制剂中化学成分的分析方法 我们进行测定之前必须先要净化分离，然后结合不同的方法进行含量测定。 常用的三七叶甙单体的测定方法如下： 1 光谱法阱1 ( 1 ) 比色法( 吸附树脂分离比色法) 一般先用大孔吸附树脂纯化三七总皂甙( p n s ) ，然后利用在冰醋酸溶液中三 七皂甙与香荚兰高氯酸( 或硫酸) 进行呈色反应，以测定三七及其制剂中三七总皂 甙含量。章观德在1 9 8 1 年就建立了用吸附树脂富集皂甙测定三七梗中总皂甙含量 的方法，其选择性好，吸附容量大，解析容易并具有再生简单的优点。黄桂宽等 还分别利用香草醛- 高氯酸法、苯酚酸酸法、苯芴酮c t m a b 法测定了三七茎叶 中的总皂甙，多糖和微量元素锗的含量。 ( 2 ) 导数光谱法 导数光谱比零阶光谱提供更多的信息，提高谱带的分辩能力，这在定性分析 中十分有用。叶基容等【2 6 】采用一阶导数光谱法，对中成药片仔癀进行鉴定研究， 指出在3 0 0 r i m 波长处的特征负峰归属三七。 光谱法一般用于测定三七总皂甙的含量。三七的皂甙成分紫外吸收为末端吸 第一章文献综述 收，与一些常用的有机溶剂的截止波长接近，影响测定，故利用皂甙的某些显色 反应，产生颜色后在可见光区运用比色法测定三七皂甙的含量。此法反应灵敏， 简单易行。但是皂甙显色反应产生的颜色受溶液浓度、反应温度、反应时间等因 素的影响，所以要控制好反应条件。此外，皂甙类成分的颜色反应专属性较差， 且中草药及制剂中成分复杂，光谱法已难以满足中药分析日益严格的要求。 2 色谱法 ( 1 ) 薄层色谱法( t l c ) 该法可用于三七及其制剂中药材的鉴别或单一有效成分的测定，其操作简 单、分离效果好，结果准确。由于皂甙在正丁醇中具有较好的溶解度，故展开剂 一般选用水饱和正丁醇的混合溶剂系统，常用硅胶g 薄层板，一般用1 0 硫酸 乙醇作为显色剂。t l c 操作简单，仪器普及，己成为目前中药及其制剂中皂甙 类分析的主要方法，随着薄层扫描仪的普及，薄层扫描法已成为薄层定量的首选。 例如用双波长扫描测定脑得生丸中人参皂甙r g l ，以氯仿- 甲醇- 水( 6 5 ：3 5 ：1 0 ) 下层 为展开剂，x = 5 2 5 n m ，a = 6 5 0 n m 。但是t l c 作为一种开发式的色谱体系，其色谱 行为极易受外晃因素的影响，其精度比起h p l c 则有所不及。用正相或者反相 t l c ，不同的吸附剂( 如硅胶g ，h 或g f 2 5 4 ，r p 8 f 2 5 4 ) ，不同的展开剂和不 同的显色剂( 如1 0 硫酸水溶液) ，可基本上分开三七的主要单体皂甙【2 7 】。李吉来 【2 8 】等将三七粗皂甙甲醇提取液经硅胶薄层层析( 展开剂：氯仿甲醇水 = 7 0 ：5 5 ：1 0 ) ，将总皂甙与杂质分开，所的总皂甙以香草醛高氯酸为显色剂进行比 色测定。此方法测定结果虽然较为准确，但步骤较繁琐且层析易受湿度影响。 经薄层层析后测定三七单体皂甙的方法有以下几种：目测法 2 9 1 ，在薄层上观 察斑点大小比较各皂甙的相对含量的方法称为目测法，其相对量用+ 号多少来 表示，由于影响斑点大小的因素很多，这种方法只能用来粗略的估计各个皂甙的 含量，误差很大；光密度计扫描法【3 0 】：将三七粗皂甙样品点于硅胶薄层板上， 以1 ，2 二氯乙烷正丁醇甲醇水( 3 0 ：4 0 ：1 5 ：2 5 ) 下层为展开剂，显色后，用光密度 计进行扫描可计算出各三七皂甙含量。此外，用香草醛高磷酸比色法【3 l j 可以测 定三七的分组皂甙。 ( 2 ) 气相色谱法( g c ) 田j 多用于测定三七中的挥发性成分。刘润民等采用s e 5 4 3 0 m 毛细管柱，柱温 为8 0 2 0 0 0 c ，程序升温3 0 c m i n ；1 0 d e g s c 填充柱，柱温1 8 0 。c ，分析了 三七中仁油中脂肪酸的组成及其相对含量。 ( 3 ) 超临界色谱法例 超临界色谱可用于皂甙元的测定，采用s b - c y a n o p r o p y l 5 0 石英毛细管柱， 柱温9 0 0 c ，f i d 检测器，流动相为c 0 2 ，分流进样，起始压力为1 0 0 m p a ，程序 第一章文献综述 升压1 0 1 m p a m i n ，至3 5 5m p a ，以胆固酵为内标物，对三七及云南白药中的人 参二醉和人参三醇进行含量测定，s f c f i e ) 法具有很高的灵敏度，人参二醇检测 限为3 9 7 x 1 0 2 9 ，人参三醇为4 1 7 x l f f l 2g 。 ( 4 ) 高效液相色谱法( h p l c ) 【3 4 】 高效液相色谱用于三七皂甙的分析测定，方法精确、灵敏，回收率高，结果 准确、可靠，重现性好，分析时间短，是目前优先发展的方法，也是三七皂甙的 现行法定标淮所规定的方法。高效液相色谱测定三七皂甙，常用固定相是各种键 合硅胶( r p 1 8 、o d s 、氨基键合柱、腈基键合柱等) ，流动相可用水甲醇、水 乙腈等，也可在流动相中加入适量的磷酸。 与h p l c 联用的通用型检测器有示差检测器限i ) 、质谱( m s ) 和蒸发光散射检 测器( e l s d ) 。前两者应用于人参及制剂中皂甙分析较多，少见于三七分析。i u 灵敏度低，基线受温度影响大，并与梯度洗脱不相容；m s 灵敏度高，且能提供 分子量、糖苷配基等信息，这在药物代谢及药代动力学研究中有独持的优势，但 设备昂贵，运行成本高复杂，相比之下，作为常规质控手段，e l s d 则以其高效、 方便、可靠的特点，在三七皂甙分析中更有发展前景。目前，已有人用h p l c - e l s d 法对多种中草药中皂甙成分进行分离分析，并取得了很好的效果，进一步推动了 高效液相色谱在皂甙分析中的应用。例如：朱洁等人用h p l c e l s d 法，用乙腈 和水作为流动相，测定了三七不同部位的皂甙的含量，并和传统的h p l c u v 方 法进行了比较m j 。 1 2 高效液相色谱理论 1 2 1 液相色谱法的发展历程 最初液相色谱是作为一种制备工具而出现的。历史上第一次提出“色 谱”( c h r o m a t o g r a p h y ) 这个词，并用来描述这种实验的人是俄国植物化学家茨维特 ( t s w e t t ) ，但当时这一技术并未得到人们的重视。直至3 0 年代以后，相继出现了 纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术。6 0 年代中后期，将气相色 谱的理论和实践经验应用于液相色谱系统的设计，加上在机械、光学和电子等技 术上的进步，沉寂了多年的液相色谱技术开始受到重视。7 0 年代中期以后，微 处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化水平和分析精度。近年来 随着生物工程和生命科学在国际和国内的迅速发展，为液相色谱技术提出了更 多、更新的分离、分析、纯化、制备的课题，大大促进了这一技术的迅速发展【3 6 】。 第一章文献综述 1 2 2 高效液相色谱构成与特点1 3 7 1 高效液相色谱法是在经典液相色谱的基础上，引入了气象色谱的理论，继承 了两者的优点，并且应用了颗粒较小的直径小的高效固定相，配备了高压输液泵 及高灵敏度的检测器而发展起来的- - f 7 强有力的分离分析技术。高效液相色谱仪 一般可分为4 个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此 外还配有辅助装置：如梯度洗脱，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首 先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流 出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱 进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来， 由此得到液相色谱图。同其他的色谱过程一样，高效液相色谱也是溶质在固定相 和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程，它借溶质在两相间分配系数、亲 和力、吸附能力、离子交换或分子大小不同引起的排阻作用的差别使不同溶质得 到分离1 3 8 】。 高效液相色谱仪的检测器有多种。不同检测器的检测原理和特点有所不同， 常用的有紫外吸收检测器、蒸发光散射检测器、荧光检测器、示差折光检测器和 电化学检测器等等1 3 9 j 。 高效液相色谱( h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ) l 拘特点如下： i 高压 液相色谱以液体作为流动相，因此液体流动时受到的阻力较大。为了能顺利 的通过色谱柱必须对载液施加高压。高压是高效液相色谱的一个突出优点。但是 因为液体不同于气体，它不容易被压缩，所以虽然使用高压但是没有爆炸的危险 性。 2 高速 高效液相色谱所需的时间较之经典液相色谱快得多，一般可达l l o m l m i n 。 个别可高达1 0 0 m l m i n 以上，这已经近似于气象色谱的流速。 3 高效 气象色谱的分离效能很高，高效液相色谱的柱效则更高，一般约可达6 0 0 0 0 理论板米。这是由于今年来研究了许多新型固定相，使分离效率大大提高，有 时一根色谱柱可分离出1 0 0 个组分以上。 4 高灵敏度 高效液相色谱已经广泛采用高灵敏度的检测器，这就进一步提高了分析的灵 敏度。如紫外检测器的最小检测量可到毫微克数量级；荧光检测器的灵敏度更高。 高效液相色谱的高灵敏度还表现在所需式样很少，微升数量级的样品就可以进行 第一章文献综述 分析。 总之，高效液相色谱具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范 围广泛等以下特点，所以特别适合用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的 化合物的分离分析。 高效液相色谱对于天然药物的分离纯化具有重要作用。高效制备液相色谱常 常作为最后的纯化步骤。2 0 多年来，随着h p l c 技术的不断发展和完善，成为 研究生命科学、遗传工程、临床化学和分子生物学等必不可少的工具。目前已经 发展出多种不同类型的h p l c 技术来分离和测定上述生物物质，用的较多的是反 相高效液相色谱、憎水相互作用色谱、高效离子交换色谱和凝胶过滤色谱。高效 液相色谱法是当今药物分析的最重要的分析方法，它被用于常规的药物生产过程 的控制，天然药物的成分分析，以及成功的监测新药的合成过程。 尤其是近年来，由于生物技术和医药工业的发展，传统的分离手段己经不能 满足对大量样品高纯度分离的要求，使得人们开始重新考虑发展液相制各色谱， 同时也开始了对液相制备色谱的深入研究，以期不断解决实际应用中出现的问 题。 1 2 3 高效液相色谱分离过程原理0 4 0 】 高效液相色谱分离的基本原理如图1 1 所示。 流动相 i 口a 日b hc lb = ，c l p b b a 图1 1 高效液相色谱分离原理示意图 f i g u r e1 - lt h es e p a r a t i n gp r i n c i p i u mo f h p l c 固定相流动相 固定相柱内填料，流动相洗脱剂。 h p l c 是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连 ；窑；末；-f一 第一章文献综述 续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。 通常，按溶质( 样品) 在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类： 分配色谱：分配系数 亲和色谱：亲和力 吸附色谱：吸附力 离子交换色谱：离子交换能力 凝胶色谱( 体积排阻色谱) ：分子大小而引起的体积排阻 色谱分离效能指标常用分离度r s 表示，定义为： r s ：兰堡2 二鱼2 + 暇 式中r 也和r 。l 为相邻两个组分的保留时间，w 2 和w l 为两相邻组分色谱峰 的峰宽。当r 仑1 5 时两个组分可以完全分开，r 史1 0 时两个组分可以分离。制 备液相色谱分离的目的是要得到大量的单一纯品，分离过程是在样品过载下进 行，s n y d e r 用r s 值表示这种过载，样品过载的黜值将低于1 2 5 。但在实践中， 为了提高设备的生产能力，r s 都大大低于这个数值。r s 值至少应该取多少，应 综合考虑产品纯度的要求和生产能力等各方面的因素，并不是r s 值越大越好。 分离度的大小是由热力学平衡和动力学因素两种效应决定的。影响分离度的 主要因素是容量因子k 、分离因子值和色谱柱的理论塔板数n 。其中k 和a 反映 了溶质的保留性质和色谱峰的相对位置，其取决于溶质、流动相、固定相的性质 以及温度等条件。但是仅从热力学平衡来考虑色谱分离是不充分的。即使在热力 学认为可行的色谱分离，由于色谱峰在通过柱子时的扩展，溶质有可能分不开。 谱峰扩展反映了色谱柱中的动力学因素，导致分离度下降。理论塔板数1 1 控制了 色谱峰的扩展程度，主要是由色谱柱本身的特性和色谱操作条件决定的【4 1 1 。 色谱分离理论指出，评价色谱分离有三个主要的指标：分离度，分离速度和 分离样品量，这三者相互关联和制约。对于一个特定的色谱分离系统改善任何 一项指标都必须依靠牺牲另两项指标来实现，或者任何两顶指标也可以靠牺牲其 余一顶而得到改善。对于分析液相色谱，其目的是对样品中的各组分作出定性和 定量的分析，分离度和分离速度是其主要要求，应尽量降低样品量。而制备色谱 的目的在于大量分离以取得一定回收率和一定纯度的单一产品，不得不损失分离 度和分离速度。 1 2 4 反相高效液相色谱 固定相的类型，决定了色谱分离的机理，我们可以按分离机理将色谱分为正 相、反相、凝胶、离子交换、疏水相互作用及亲和色谱等不同的种类。 第一章文献综述 1 反相高效液相色谱的定义 在液相色谱中，把采用非极性或弱极性的固定相和采用极性流动相操作成为 反相色谱；反之成为正相色谱。其中，反相液相色谱是应用最广的液相色谱方法。 2 反相高效液相色谱的分离机理【4 2 】 一般认为反相高效液相色谱有以下几种分离机理： ( 1 ) 溶质在填料表面的烃类和流动相之间进行分配； ( 2 ) 溶质在吸附于填料表面烃类上的“改性固定相”和流动相之间进行分配，这一 过程在添加了有机改性剂的情况下发生； ( 3 ) 溶质在吸附于填料表面烃类分子上，类似于吸附色谱。 3 反相高效液相色谱的色谱柱 反相高效液相色谱柱一直是液相色谱主要研究和发展的重要内容。 ( 1 ) 以硅胶为基质的反相高效液相色谱柱：常见的是用常规硅胶键合c 1 8 、c 8 等填料； ( 2 ) 以其他氧化物为基质的反相高效液相色谱柱： ( 3 ) 以聚合物为基质的反相高效液相色谱柱。 4 反相高效液相色谱的流动相 反相高效液相色谱一般采用极性溶剂或他们的混合物用作反相高效液相色 谱的流动相，例如水、甲醇和乙腈。为了提高检测的灵敏度，要求溶剂达到光谱 纯。 5 反相高效液相色谱的应用 反相高效液相色谱是h p l c 中应用最为普遍的一种模式，从一般小分子有机 物到药物、农药、氨基酸、低聚核苷酸、肽和分子量不大的蛋白质( i 石，瓦 瓦 葛，巧 巧 巧，因此最佳组合为a 2 b i c 2 ，对照正交实 验结果，此时三七皂甙f a 的纯度达到9 1 5 。 第三章三七皂甙f a 的制各工艺 2 对实验结果进行极差分析 直观上讲，一个因素对实验的结果影响大，就是主要的。这里的影响大，就 是指这个因素的不同水平对应的平均纯度之间的差异即极差大。相反，一个 因素的不同水平对应的r 小，就是次要的。从表3 - 4 中的r 值可知，r a r c r b ， 因此，因素a 是最主要的，因素c 次之，因素b 最差。具体关系如图3 - 9 所示。 主次 a 流动相配比c 流动相流速b 原料上样量 图3 - 9 按照极差r 大小的排列出因子影响主次顺序 f i g u r e3 - 9e f f e c to f f a c t o r sa c c o r d i n gt or a n g er 为了更直接的说明三个因素对实验结果的影响程度，作了三个因子的效应曲 线。分别如图3 1 0 ，3 1 1 和3 1 2 所示。 在流动相配比、流动相流速和上样量这些因素中，流动相配比对产品f a 纯 度有着显著的影响，流速也有较大的影响，但较之流动相配比就不那么明显了。 而在选择的上样量范围中，上样量的变化对于实验的结果几乎没有什么影响。 流动相配比对产品f a 纯度影响的效应曲线如下图3 - l o 所示： 述 丑 求 l 叮 暑s 旧 磐 v 毯 蒙 叠 8 0 7 0 6 0 5 0 6 66 87 07 27 47 6 流动相配比( 甲醇的质量分数) 图3 1 0 流动相配比效应曲线 f i g u r e3 - 1 0e f f e c to f f l o wp h a s er a t i o 在本实验中尝试了用甲醇体积分数为6 8 ，7 0 ，7 5 的三种不同的流动相 配比。经过正交实验后，从效应图3 1 0 中可以看到当流动相比例为甲醇水比 7 5 ：2 5 时f a 纯度较小，甲醇水比例为6 8 ：3 2 时效果也较差，只有在甲醇一水比例 第三章三七皂甙f a 的制备工艺 为7 0 ：3 0 时f a 纯度达到了9 1 5 。 在液固色谱法中，使用混合溶剂的最大优点是可获得最佳的分离度，可使流 动相保持较低的粘度，并可保持较高的柱效。对于已经确定的流动相组成，不同 的配比条件对物质的洗脱能力和洗脱效率也存在很大的差异。在本实验中本着经 济性和实用性的原则选择甲醇水作为流动相。但即使是确定的流动相组成在不 同的配比下洗脱能力也会有很大的不同，通过改变流动相配比可以调节其洗脱能 力。 根据分配色谱的作用机制：假设在有水和有机溶剂组成的混合溶剂流动相 中，极性弱的有机溶剂分子中的烷基官能团会被吸附在非极性固定相表面上的弱 极性溶剂分子进行置换，从而构成溶质在固定相和流动相中的分配平衡。吸附色 谱的作用机制认为溶质在固定相上的保留是疏溶剂作用的结果，当溶质分子进入 极性流动相后，占据相应的空间而排挤一部分溶剂分子；当溶质分子被流动相推 动与固定相接触时，溶质分子的非极性部分( 或非极性分子) 会将非极性固定相上 附着的溶剂膜排挤开，与非极性固定相上的烷基官能团相结合形成缔合络合物。 这种过程是