（蔬菜学专业论文）生姜原生质体培养与体细胞变异.pdf

中国农业大学博士论文 摘要 摘要 生姜( z i n g i b e r o f f i c i n a l er o s c ) 是姜科、姜属能形成根状茎的一个栽培种。广泛分布于亚洲 热带、亚热带地区，在南非、北美和澳大利亚也有栽培，是集调味品、食品加工原料和药用为一 体的高效多用途蔬菜。生姜以根状茎作为繁殖材料，繁殖系数低，容易通过种姜传播病害，而且 长期无性繁造成种性退化。由于姜很少开花结籽，因此无法通过有性杂交手段进行种质创新和品 种改蘸。本论文以河南鲁山县张良姜、陕西城固黄姜、湖北枣阳生姜、四川竹根姜为试材，建立 了生姜胚性愈伤组织诱导和植株再生体系、胚性悬浮系再生体系，获得了原生质体再生植株，分 析了离体培养过程中的体细胞变异情况。获得如下结果： 1 以各生姜地方品种的茎尖组织为材料，诱导产生了胚性愈伤组织，建立了高频再生体系。筛 选出了适于胚性愈伤诱导及扩增最佳培养基m s n + i o m g l 。2 ，4 - d + o 2 g l - k t + 3 0 蔗糖+ o 7 琼脂；胚性愈伤组织分化培养基m s + o 2 m g l 2 ，4 - d + 5 o m g l - 1 b a + 3 o 蔗糖+ o 7 琼脂；根状茎 形成培养基m s + 3 o m g l b a + 0 1 m g r n a a + 6 0 9 6 蔗糖+ o 7 琼脂。植物激素、氮源对生姜茎尖胚 性愈伤组织形成和再分化有较大影响。蔗糖比葡萄糖更利于根状茎的诱导，活性炭对根状茎诱导 役有明显作用。不同品种间胚性愈伤组织诱导、愈伤组织再分化以及植株再生能力存在一定的差 异。 2 以胚性愈伤组织为材料，建立了胚性细胞悬浮系，并获得了再生植株。结果表明悬浮细胞 干重和p h 之间有一定的相关性。接种量和a g n o a 含量对悬浮细胞的生长都有影响：最佳接种量为 1 0 ，最适a g n o a 浓度为6 o m g l - 1 。不同品种间胚性细胞悬浮系的生长能力不同。悬浮系愈伤组 织的分化能力低于其对应的胚性愈伤组织分化能力。 3 利用生姜胚性细胞悬浮系成功分离得到原生质体，获得s c 姜荐生植株。酶种类和浓度、渗 透压调节剂种类和浓度对分离原生质体有重要影响，最佳酶液组成为4 o 纤维素酶、1 o ，6 离析酶、 0 1 果胶酶、1 1 甘露醇、0 5 c a c l ：和0 1 g e s 。原生质体产量达到6 2 7 1 0 6 9 ，原生质体 活力为9 0 7 。悬浮培养时间对分离原生质的产量和活力有影响。葡萄糖比蔗糖更利于纯化后原 生质体分裂和生长。低浓度的a g n 0 3 ( 2 0 - 6 o m g l 。) 可以降低原生质愈伤组织褐化速度。不同品种 间在原生质体分裂、愈伤组织分化、植株再生方面有显著差异。 4 对各品种生姜的胚性愈伤组织再生植株、胚性悬浮系再生植株、原生质体再生植株进行形 态学、细胞学、分子生物学鉴定。结果表明，再生植株外部形态没有明显变异。再生植株的染色 体数目没有变异。i a p d 多态性分析表明，再生植株存在较广泛的体细胞变异。对各品种胚性愈伤 组织、胚性悬浮系愈伤组织、原生质体再生愈伤组织进行细胞学鉴定和r a p d 分析表明，愈伤组织 的体细胞变异率远远高于再生植株的体细胞变异率。继代次数对体细胞变异率也有影响，随着继 代时间的延长，体细胞变异率有上升趋势。 关键词：生姜原生质体体细胞胚悬浮培养再生植株体细胞变异 中国农业大学博士论文 摘受 a b s t r a c t g i n g e r ( z i n g i b e ro f f i c m a 缸r o s e ) i sac u l t i v a rp r o d u c i n gr h i z o m e so ft h ef a m i l yz i n g i b e r a c e a e i t i s m o s t l y d i s t r i b u t e d i n t h e a s i a n t r o p i c a la n ds u b t r o p i c sr e g i o n a n d s o u t h a f r i c a ，n o r t h a m e r i c aa n d a u s t r a l i aa l s op l a n tg i n g e r s g i n g e r sa r er i c hi nv o l a t i l eo i l sa n dw i d e l yu s e da s ac o n d i m e n t s ，d y e s ， b e v e r a g e ，m e d i c i n ea n dv e g e t a b l e g i n g e r sa n n u a l l yp r o p a g a t et h e m s e l v e sb yr h i z o m e sw i t hl o w p r o l i f e r a t i o nr a t e t h e ya r eh e a v i l ya t t a c k e db ys o i l - b o r op a t h o g e n s a n dt h eq u a l i t yo f r h i z o m e s d e g e n e r a t e sf o r t h el o n g - t e r ma g a m i cp r o p a g a t i o n g i n g e r ss e l d o mf l o w e r sa n dh a v es e e d s ，s oi ti s d i f f i c u l tt oc u l t i v a t en e wv a r i e t yt h r o u g hc r o s s b r e e d i n g i nt h i sp a p e r , i nv i t r ot i s s u ec u l t u r et e c h n i q u e s w e r ec a r r i e do u ti n c l u d i n gs o m a t i ca n de m b y o g e n i cc a l l u si n d u c t i o n e m b r y o g e n i cs u s p p e o s i o nc u l t u r e a n dp r o t o p l a s tc u l t u r e 1s o m a t i ce m b r y o g c n i cc a l l io f4g i n g e rg e n o t y p e sw e r ep r o d u c e d s o m a t i ce m b r y o g e n i cc a l l u s w a si n d u c e df r o mg i n g e rs h o o tt i p so nm sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h1 0m g l 2 ，4 - da n d0 2 m g - u 1 k t t h ec a l l u s ( a b o u t1 s c mi nd i a m e t e r ) w e r et r a n s f o r m e di n t ot h em s + 0 2 m g l - 2 4 一d + 5 0 m g l - 1 b a + 3 s o c r o s e + 0 7 a g 矾a n ds h o o t sa n dr o o t sw e r ef o r m e d a n ds h o o t sd e v e l o p e di n t oc o m p l e t e p l a n t l e t sw i t hr h i z o m e so ns o l i dm sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h3 0 r a g - l - 1b aa n d0 1 m g o l - 1 n a aa n d 6 s u c r o s e t h ee f f e c to fp h y t o h o r m o n e so ne m b r y o g e n i cc a l l u sf o r m a t i o na n dr e d i f f e r e n c i a t i o nw a s d i s c u s s e d t h ee f f e c to fs u c r o s eo nr h i z o m ef o r m a t i o nw a sr e s e a r c h e d 2s o m a t i ce m b r y o g e n i cs u s p e n s i o nc u l m r e so f4g i n g e rg e n o t y p c sw e r e ：e s t a b l i s h e d f r o mw h i c h ， r e g e n e r a t e dp l a n t l e t sw e r eo b t a i n e d t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ed r yw e i g h tf d w ) o fs u s p e n s i o n c u l t u r e sa n dp hc h a n g e si nm e d i u mw a sa l s od i s c u s s e d t h ee f f e c t so fi n o c u l a t i o na n da g n 0 3o i lt h e g r o w t ho fe m b r y o g e n l cs u s p e n s i o n sw e r ea l s od i s c u s s e d t h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o no fi n o c u l a t i o na n d l e v e lo fa g n 0 3w e r e1 0 a n d6 0m g l r e s p e c t i v e l y 3p r o t o p l a s t sw e r ei s o l a t e df r o me m b r y o g e n i cs u s p e n s i o n si n c u b a t i n gi ne n z y m es o l u t i o n c o n t a i n i n g4 0 c e l l u l o s eo n o z u k ar 1 0 ，1 0 m a c e r o y m er 1 0 ，0 1 p e c t o l y a s e y - 2 3 ，0 5 c a c l 2 ， 0 1 i v i e sa n d1 1 m a n n i t 0 1 t h ee n z y m em i x t u r ew e r ek e p ti nas t a t i o n a r yp o s i t i o nf o r6ha n d s h a k e n ( 6 0r p m ) f o r6ha t2 7 t h ey i e l da n dv i a b i l i t yw e r e6 2 7 x1 0 6 9 a n d9 0 7 r e s p e c t i v e l y p u r i f y i n gp r o t o p l a s t sw e r ec u l t u r e di n i t i a l l yi ns h a l l o wl i q u i dl a y e r s 4t h ec h r o m o s o m en u m b e r so f e m b r y o g e n i cc a l l u s - d e r i v e dp l a n t s ，e m b y o g e n i cs u s p e n s i o n d e r i v e dp l a n t sa n dp r o t o p l a s t - d e r i v e dp l a n t sw e r e2 2 ，e q u a lt ot h e i rp a r e n tp l a n t s t h e r ew e md i f f e r e n c e s o f m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s b e t w e e n i n v i t r o p l a n t s a n d p s x c n t p l a n t ss u c h 鹊l e a f t h i c k ，l e a f c o l o r a n d l e a fi n d e x t h er a p da n a l y s i so fr e g e n e r a t e dp l a n t si n d i c a t e dr e l a t i v e l ys o m a t i cv a r i a t i o n t h e c h r o m o s o m en u m b e rd e t e r m i n a t i o na n dr a p da n a l y s i so fe m b y o g e n i cc a l l u sa n de m b r y o e n i c s u s p e n s i o n - d e r i v e da n dp r o t o p l a s t - d e r i v e dc a l l u ss h o w e dg r e a t e rs o m a t i cv a r i a t i o nt h a nt h o s eo f r e g e n e r a t e dp l a n t s s o m a t i cv a r i a t i o nf r e q u e n c yo fi nv i t r op l a n t sw a si n e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n g s u b c u l t u r et i m e k e yw o r d s ：g i n g e r ；, e m b r y o g e n i cc a l l u s ；s u s p e n s i o n ；p r o t o p j a s t ；r a p d i i 缩写词表 缩略符号英文中文 ! 竺竺些! ! 竺墅型熊 曼墅! 竺 a f l p a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 扩增片段长度多态性 a ca c t i v a t e dc h a r c o a l 活性炭 2 ，, 4 - d 2 4 - d i e m l o r o p h e n o x y a c e i c a c i d2 , 4 一二氯苯氧乙酸 6 - b a 6 - b e n z y l a d e n m e 6 一苄基腺嘌呤 ( 1 hc a s e i nh y d r o l y s a t 6 水解酪蛋白 c p w c o m p o s i t i o no f p r o t o p l a s t w a s h i n g - s o l u t i o n 原生质体洗液 d w d r y w e i g h t 干重 id a f l u n r e s c e n td i a e e l a t e 荧光素双醋酸酯 f w f r e s hw e i 曲t 鲜重 k t k i n e l i n 激动素 m e s 2 ，( n m o r p h o l i n o ) e t h a n es u l f o n i ca c i d已( n 一吗啡啉) 一乙基磺酸 n a a 1 - n p h t h y la c e t i ca c i d 荼厶酸 p c r p o l y t n c r a s cc h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p v p p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 聚乙烯毗咯烷酮 r a p dr a n d u ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i ccd n a 随机引物扩增多态性d n a r p m r e v o l u t i o n sp e r m i n u t e 每分钟转数 i i i 独创性声明 v7 7 3 4 0 3 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：薪莫缉时间：加丁年舌月f 矿日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被杳蒯和借阅，町以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 卖英华 时间：耐年臼心日 导师签名 献抓餐 时间：各h r 年月省日 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 引言 姜( z i n g i b e r o f f i c i n a l er o s c ) 是姜科、姜属多年生草本植物。中国的中，南部至西南 部各省市广为栽培，日本、印度等东南亚国家，以及南非、北美和澳大利亚也有栽培。姜营养物 质丰富，每5 0 0 9 鲜姜含糖类4 0 9 、脂肪3 5 9 、蛋白质7 9 、纤维素5 9 、胡萝h 素0 9 9 、维生素c 2 0 m g 、 硫胺素0 0 5 m g 、核黄素0 2 r a g 、尼克酸2 r a g 、钙l o o m g 、磷2 2 5 m g 、铁3 5 m g ，还含有姜辣素、姜油酮、 姜烯酚、姜醇、水茴香烯、龙脑和桉油精等特殊成分，具辛香味。姜是集调味品、食品加工原 料和药用为一体的高效多用途蔬菜，我国近年来出口量逐步增加，经济效益不断提高，栽培面积 逐渐扩大。 因姜以根状茎作为繁殖材料，繁殖系数低，容易通过种姜传播病害，而且长期无性繁殖种性 退化“1 。由于无法采用有性杂交手段进行种质创新和品种改良，h o s o k i 等。1 1 9 7 7 年开始进行姜组 织培养研究，迄今已在脱毒快繁。1 、花器官培养“1 、体细胞胚胎发生“、器官发生、原生质体培 养和种质保存”1 等方面取得一定进展。 1 2 姜研究进展 1 2 1 姜资源与分类 姜起源于东南亚地区，现在亚洲的热带和亚热带地区，巴西、牙买加和尼日利亚等国家也广 泛种植。非洲姜辛辣味较强，中国姜辛辣味比较淡。姜的颜色有金黄色、茶色、黄色、米色、白 色和淡红色。印度姜大约有5 0 个品种，例如s u p r a b h a 、s u r u c h i 、s u r a v i 、y a r a d a 、h i m g i r i 、m a h i m a 和r a j a t h a 等。中国姜栽培历史悠久，资源丰富，地方品种颇多，主要有山东莱芜片姜、莱芜大 姜、广东疏轮大肉姜、广东密轮细肉姜、浙江临平红爪姜、江西兴国姜、陕西城固黄姜等。 姜的分类方法主要有两种，一是按生物学特性分类，二是按产品用途进行分类。根据植物学 特征和生长习性可以分为疏苗型姜和密苗型姜两类。山东的莱芜大姜和广东疏轮大肉姜是疏苗型 姜的代表品种，此类姜植株高大( 8 0 - 9 0 c m ) ，分枝少，根状茎肥大，姜球数少，节间长，单层排 列。而密苗型姜，一般株高6 5 8 0 c m ，分枝数较多，排列紧密，姜球数较多，姜球较小，节间短， 姜球多呈双层或多层排列，其代表品种如山东莱芜片姜、广东密轮细肉姜、浙江临平红爪姜等。 还可以根据用途分为食用型、药用型、加工型和观赏型。大多数品种为食用、药用兼用的品种， 例如山东的莱芜大姜、广西的玉林圆肉姜和江西的抚州姜等。适于加工为腌制品、糖渍品和酱渍 品的品种有广州大肉姜、浙江红爪姜、铜陵白姜、遵义大白姜等，这些品种一般根状茎纤维少、 肉质细嫩、含水量较高、质脆、辛香味浓而辣味淡。另外，姜科姜属的莱舍姜( 别名纹叶姜) 、 花姜( 别名球姜或姜花) 、斑叶茗姜、壮姜、恒春姜、河口姜等属于观赏姜。 1 2 2 姜栽培育种现状 根据国际粮农组织统计中国2 0 0 3 年姜产量1 1 ，1 9 0 吨，亚洲总产量6 4 ，4 6 1 吨。我国是世界上姜 产量虽大的国家，也是主要出口国之一，年出口量占世界总出口量的4 0 。目前我国姜的种植面 中国农业大学博士学位论文第一章丈献综述 积已达到1 0 万6 6 7 m 2 以上。南方主要分布在广东、浙江、台湾、福建、湖南、四川等省，北方则以 山东省为主产区。 栽培方式和遮荫程度对姜产量有重要影响”1 。传统的姜栽培方式中，主要采用插姜草或者搭 荫棚等地上遮荫方式。张振贤等通过对姜需光特性的研究发现，苗期遮荫后，姜的光合速率和 羧化效率随遮荫程度的增加而降低。而使用地面覆草或有色地膜覆盖“代替传统的地上遮荫方式， 不仅起到增产的作用，并且操作方便，降低成本。印度一些学者因地制宜，采用当地的一些有机 覆盖物也能达到增产的效果“1 。 另一限制姜高产的因素是病害。姜以地下根状茎无性繁殖为主，容易通过带病种姜传播病害， 尤其是姜瘟病。姜瘟病病原为青枯假单孢杆菌( p s e u d o m o n a ss o a n a c e a r u m ) ，不仅侵染姜，还 侵染番茄、茄子、辣椒等茄科植物。姜瘟病在世界各姜产区均有发生，造成减产，例如1 9 9 8 1 9 9 9 年度夏威夷姜因姜瘟病减产5 0 以上。r f l p 分析表明姜瘟病致病菌有若干生理小种，不同地区甚 至不同地块的小种也可能差别很大，更与侵染番茄、马铃薯、烟草等植物的生理小种有明显不同 ”1 。目前尚无理想的杀菌药剂，仍以生物防治措旌为主”1 。 受姜开花结籽困难的影响，长期以来姜良种培育工作主要集中在对自然变异的选择和利用 上。y u d h v i r 等”。对收集到的4 8 份姜材料研究表明，与姜产量相关的性状受加性基因控制，可以 通过选择提高产量：c h a n d r a m a n i 等”1 研究发现不同品种间的抗病性不同。这些结果为培育高产 抗病品种提供了依据。 1 2 3 姜的主要成分和药用价值 姜的化学成分复杂，己发现的有1 0 0 多种成分，分别归属挥发油、姜辣素和二苯基庚烷三大 类“。不同姜制品所含成分不尽相同。干姜总挥发油含量低于生姜，炮姜比干姜挥发油含量少2 0 ；生姜中总姜酚的含量也比千姜高；生姜中以游离氨基酸为主，而干姜以结合氨基酸为主“。 医学上的应用 各国都有关于姜药用的记载：印度从吠陀时期开始，姜就作为驱风剂广泛应 用；古希腊的伽林医师用姜治疗身体麻痹；阿拉伯医生公元前就把姜用作壮阳剂；我国现存最早 的中药专著神农本草经里记载“干姜，味辛温，主胸满，咳逆上气，温中止血、出汗、逐风， 温脾肠辟下痢。”。现代医学也证明生姜具有止吐o ”、强心、杀菌抗炎、抗运动病“”等作用， 对消化系统疾病“”、心血管疾病“”、肿瘤癌症“”等都有一定的防治作用。而且不同姜制品的药效 和作用机理也不尽相同u 。 化妆品上的应用 姜成分中的姜酚、姜酮和姜烯酚等酚羟基化合物具有还原性，能作为自由 基清除剂，这可能是姜油具有抗氧化作用的主要原因“”。试验表明，姜油对h 她氧化应激损伤的 作用明显强于维生素e ；同时姜油对h 2 0 2 诱导的d n a 的损伤有一定的保护作用。”。另外香料工业中， 主要是利用生姜生产的姜油、姜油树脂等制造食用香精和东方型男用化妆品( 如香水) “。 食品上的应用在食品工业，生姜已被用于加工染色姜芽、腌姜芽、泡子姜、姜罐头、酱姜、 糖醋姜、糖姜片、姜酒、姜汁啤酒、调味姜汁、姜珍、商泡姜汁等许多姜制品，生姜还用于烹饪、 焙烤食品( 面包、饼干、脆干等) 、咖喱粉等，在这些应用中，生姜除用作调料外，其中所含有的 2 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 抗氧化物质对于保证这些产品的风味和质量也是必不可少的。利用生姜提取物作为食用防腐剂， 可以防止油脂类食品贮存过程中产生的自由基，即脂肪酸自动氧化导致的败坏，从而延长含油食 品的保质期1 。 1 2 4 组织培养 姜以根状茎作为无性繁殖材料。繁殖系数低，而且容易通过种姜传播病害。由于姜很难结籽， 不能通过传统的有性杂交手段进行品种改良，1 9 7 7 年h o s o k i 等乜2 3 在姜茎尖培养获得成功。此后， 各国学者开始利用组织培养拣索培育姜新品种的途径。 离体再生体系的建立及其影响因素外植体的类型、大小、生理状态、培养条件和基因型等 因素影响姜离体再生过程。尤其外植体细胞或组织的原始状态对其再生途径有关键性的影响。例 如以姜芽作为外植体进行组织培养时，外植体越大就越可能通过不定芽途径再生植株，外植体越 小越容易通过愈伤阶段再生植株。幼嫩叶片作为外植体，也要通过愈伤阶段，经器官发生途径获 得再生植株。以幼嫩花序”1 、花药“2 ”和子房“1 等胚性组织作为外植体，都是通过体细胞胚途径 获得再生植株。 植物激素主要影响离体再生途径。生长素的作用主要是促进愈伤的形成和根的生长，不能促 进不定芽的产生”。其中2 ，4 一d 诱导形成胚性愈伤的效果最显著，其他生长素基本不能诱导产生 胚性愈伤，但是高浓度2 ，4 - i ) 抑制体细胞胚的进一步分化“”1 。细胞分裂素促进姜再生植株的扩 增1 和胚性愈伤的分化”“。多数研究表明b a 的扩增效果较好，而高浓度的k t 不但扩增率低，而 且强烈抑制茎的伸长和根的形成“。激素间存在着复合作用。多数研究表明高浓度的细胞分裂素 含量高促进姜的茎扩增”3 ”，生长素含量高有利于愈伤的形成。”。但是也有不同的报道，s h a r m a 等的研究等浓度的细胞分裂素和生长素获得最大的再生植株扩增率1 ( 2 o m g 1ba p 和n a a ， 2 o m g lk t 和n a a ) ；更有报道低浓度的k t ( o 1 m g 1 ) 与高浓度的i a a ( o 5 a g 1 ) 结合也获得 了较好的茎尖扩增效果”。 植物激素对再生途径的影响可能是通过诱导某些基因的表达，从而导致一些酶活性和代谢过 程的变化来实现的。研究中发现具器官发生能力的愈伤与无器官发生能力的愈伤的蛋白质带型不 相同：前者在器官发生阶段有六条特有的多肽，生根阶段有5 条特有的多肽表达“1 。碳水化合物 和蛋白质含量在器官发生期最高，高于诱导生根时期，并且显著高于无器官发生的愈伤组织。过 氧化物酶和过氧化氢酶活性在生根阶段较高。磷酸酯酶活性在器官发生阶段较高，诱导生根阶段 下降。 大部分试验中采用船培养基，或者是m s 改良培养基进行培养。包括降低大量元素的含量 ”，添加天然提取物。”，或者添加其他培养基的微量元素和有机成分。另外s a t m 等1 采用b 5 培养基培养茎尖上获得了再生植株；k i m 等。”采用n 6 培养基培养花药获得了成功。培养基中碳源 的影响根状茎的形成，蔗糖是根状茎形成的最佳碳源“”。张延国等“”研究发现，蔗糖浓度在 6 - 1 0 范围内，根状茎的诱导频率最高。但是i n d e n 等1 发现，随着蔗糖浓度的升高茎扩增率减 小。 迄今为止已经在脱毒快繁”“、离体授粉1 、体细胞胚胎发生。“和器官发生“”等不同组 织培养方面取得了一定进展，获得了大量新种质，为进一步的育种工作奠定了基础。但是原生质 3 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 体培养、体细胞融合以及转基因研究等方面一直没有突破。g e e t h a 等“”从试管苗叶肉细胞和悬浮 培养细胞中分离到了原生质体活力，但是所有类型原生质体只分化到愈伤阶段，均未获得再生植 株。 另外姜的初生芽、试管苗、微繁姜块等都可以用于姜种质资源贮存。贮存效果主要受试管苗 的苗龄大小、容器封口方式、温度以及甘露醇的浓度等因素影响“。 组织培养再生檀株体细胞无性系变异体细胞无性系变异( s o m a c l o n a lv a r i a t i o n ) 是指植 物组织培养中产生的变异，这些变异中有些是不能遗传的生理变异，另一些是遗传性变异。大量 研究表明，体细胞无性系变异是植物组织培养过程中的普遍现象，而且变异涉及的性状相当广泛 1 ”。影响体细胞无性系变异的因素主要有：植株的再生方式，离体培养的时间以及基因型等。 一些研究表明姜组培苗的外部形态与亲本相同，染色体形态和数量基本稳定，再生苗与亲本 的酯酶同工酶谱和过氧化物酶谱完全或基本一致“。r o u t 等“”通过对微繁苗的r a p d 分析，认 为再生植株不存在可遗传的无性系变异，但是其试验试材没有经过连续继代培养，不能说明连续 继代的姜再生植株也不存在可遗传的无性系变异。b a b u 等”由叶片通过愈伤途径产生的体细胞 胚，而再生的植株有2 的变异率。对于长期离体培养的生姜再生植株的体细胞变异率和变异的可 遗传性还有待于进一步研究。 1 25 研究和应用前景 传统的姜分类方法，只是基于植物学性状或用途进行分类，没有对不同地方品种，不同国家 品种进行系统的亲缘关系的研究。利用r f l p 、r a p d 、s s r 等分子标记技术对不同来源的品种进行 分析，进而研究其起源、亲缘关系、进化过程等，是重要的研究方向。 姜的辣味影响其在化妆品和食品加工贮藏方面的进一步应用。如何在不影响其作用成分的条 件下改善其提取工艺，去除辣味，是扩大其应用范围的关键。 姜长期无性繁殖，病害严重，急需培育高产抗病的新品种。利用脱毒快繁、突变体筛选i 体 细胞融合、转基因等生物技术，将会大大加快新品种培育的进程。利用体细胞无性系变异与其它 育种技术相结合，例如与辐射育种、化学诱变育种等，可以获得大量的突变体；在培养过程中加 入一定的选择压( 粗毒素) ，还可以获得有益的特定( 抗病) 突变体。另外可以通过细胞融合， 引人近缘物种的有利性状，丰富姜的种质资源。 1 3 原生质体培养研究进展 原生质体是去除细胞壁后得到的微球体。植物原生质体培养是将植物原生质体在一定条件下 培养，经过细胞壁再生而形成细胞，再分裂为细胞团的过程。植物原生质体可以从植物的根、茎、 叶、花等外植体或者从愈伤组织、植物细胞中获得。1 8 9 2 年，克莱若克( k l e r o k e r ) 首先从藻类 中分离得到原生质体。1 9 6 0 年，科钦( c o c k i n g ) 首次采用酶解方法大量制各得到番茄原生质体。 从此出现了原生质体培养技术。1 9 7 1 年，t a k e b e 和n a g a t a 首次利用烟草叶片分离原生质体， 并获得再生植株。到1 9 7 6 年，有1 2 种植物的原生质体能再生植株，1 9 8 3 年增加到7 0 种，1 9 8 6 年 超过8 0 种，到9 0 年代初期达到1 0 0 种以上。原生质体培养是8 0 年代的一个研究热点。日本和中 4 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 国在这一领域做出了很大的贡献。日本科学家成功地进行了大约7 0 个植物品种的原生质体培养。 我国获得t 3 0 个以上品种的原生质体再生植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和经济作物 大豆( w e ia n dx u ，1 9 8 8 ) 、水稻( w a n g 等，1 9 8 9 ) 、玉米( 蔡起贵等，1 9 8 7 ：孙敬三等，1 9 8 9 ) 、 小麦( 王海波等，1 9 8 9 ) 、谷子( 董晋江、夏镇澳，1 9 8 9 ) 、高粱( 卫志明、许智宏，1 9 8 8 ) 、大麦( 颜 秋生等，1 9 9 0 ) 、棉花( 陈志贤等，1 9 8 9 ) 、油菜( x u ，1 9 8 2 ) 、马铃薯( 李耿光等，1 9 8 8 ) 等。在木 本植物、药用植物、蔬菜和真菌原生质体培养方面的进展也十分迅速。 t a b l e 卜1 蔬菜植物中获得原生质体培养再生植株的种类 十字花科 白菜型油菜 菜心 芥菜 茎用芥菜 甘蓝型油菜 花椰菜 甘蓝 青花菜 皱叶甘蓝 大白菜 芜菁 荠菜 芝麻菜 诸葛菜 萝h 茄科 颠茄 辣散 番茄 子叶、下胚轴 叶，下胚轴 叶，下胚轴 叶 子叶、下胚轴、叶、 根、胚性悬浮细胞 子叶、下胚轴、叶、 于叶、下胚轴、叶、 下胚轴、叶 下胚轴、叶 卧 叶 叶、悬浮细胞 叶 叶片、叶柄 叶 c p c p e p c p c p 叶柄、e p c p 花茎 c p 根c p e p c p c p c p 。c e c p e p e p c p c p 悬浮细胞e p c p 叶c p 子叶、叶、茎皮层组织、 c p 赵，1 9 9 4 ，1 9 9 5 张兰英等，1 9 9 4 李文彬，1 9 8 6 ；赵矗军，1 9 9 0 雷建军1 9 9 1 李良才，1 9 8 2 ：许智宏，1 9 8 2 罗科，1 9 9 2 卫志明，1 9 9 0 许智宏，1 9 9 2 许智宏，1 9 8 2 ，吕德扬，1 9 8 2 ； r o b a r t s o n ，1 9 8 8 王晓佳，1 9 9 1 李世军，1 9 9 3 p i s a n ，1 9 8 3 卫志明，1 9 9 4 s i k d a r ，1 9 8 7 徐晓昕，1 9 8 8 ：罗科，1 9 9 2 h e g a z i ，1 9 9 2 g o s c h ，1 9 7 5 ： s a x e n a ，1 9 8 1 王光远，1 9 8 9 塑! 重堑三堕：! 竺 一 ! 翌! 望：! 塑! 洼：c p 愈伤组织分化芽再生植株ie p 胚状体再生植株；c s 愈伤组织分化芽；c e ，愈伤组织分化胚状体 5 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 续衰1 一l 蔬菜植物中获得原生质体培养再生植株的种类 t a b l e l 一1t h ev e g e t a b l es p e c i e si nw h i c hp l a n t sm e r er e g e n e r a t e df r o = p r o t o p l 8 s t 6 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 1 3 ，i 植物原生质体的特点 植物原生质体与植物细胞比较，具有一些显著特点。首先植物原生质体虽然去除了细胞壁， 但是其细胞核、细胞质和细胞膜等细胞内的结构仍然保持完整，没有受到破坏，仍然保留了植物 全套的遗传信息，因此，植物原生质体与植物细胞一样具有全能性，具有细胞壁再生以及分裂、 繁殖、生长、发育的能力，可以进行正常的新陈代谢，也可以分化发育成完整的植株。其次，植 物原生质体由于去除了细胞壁这一障碍，就使其吸收能力比完整细胞增强，便于细胞膜外的物质 进入细胞膜内，有利于氧的传递、营养成分的吸收、基因的转移核原生质体融合。同时利于胞内 产物的分泌，通过固定化原生质体培养，使较多的胞内物质分泌到细胞外，可以不经过细胞破碎， 直接从培养液中分离得到其代谢产物。最后，植物原生质体由于没有细胞壁的保护作用，稳定性 较差。易于受到渗透压等条件变化的影响。所以在原生质体培养过程中，必须添加适宜的渗透压 稳定剂等，以免原生质体受到破坏。 1 3 2 植物原生质体的分离和纯化 原生质体的分高分离得到大量活力旺盛的原生质体是原生质体培养成功的关键。植物原生 质体的分离方法有两种：机械分离法和酶解分离法。机械法分离原生质体的第一步是使细胞产生 质壁分离，第二步是切开细胞壁使原生质体释放出来。此法捧除了外加酶对原生质体的结构和代 谢的不利影响。但产生的原生质体少，而且需要采用能高度质壁分离的细胞才能得到少量的原生 质体，这对于细胞质浓密、液泡小的分生组织细胞就不适用。目前一般都采用酶解分离法分离原 生质体。植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成，故制各植物原生质体时主要采用纤维 素酶和果胶酶等，在适当的渗透压、温度、p h 值等条件下处理，使细胞壁酶解，进而分离到原生 质体的方法。酶解法可在较短时间内获得大量原生质体。但是对原生质体有一定的毒害作用。可 以加入a g n o , 减少酶解时产生的乙烯，加入过氧化物歧化酶减轻如一自由基对细胞膜的伤害。 不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不一样。 一般说来，首先将生长旺盛期的植物细胞收集起来，悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中。 然后加入适量的细胞壁水解酶酶解一段时间，使细胞壁破坏。分离除去细胞壁碎片、未作用的细 胞等，而得到原生质体。将植物细胞的细胞壁破坏而分离出原生质体时不能影响到细胞膜的完整 性，更不能使细胞内部的机构收到破坏，为此只能使用对细胞壁有专一作用的酶。 植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质构成。一般，纤维素约占干重的2 5 一5 0 ， 半纤维素约占5 3 0 ，果胶质约占5 。酶解叶片一般需用纤维素酶和少量果胶酶，降解愈伤组织 或悬浮细胞，需要纤维素酶，较多果胶酶，有些材料还需要加入半纤维素酶和其它酶类。 7 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 表i - - 2 常用的商品酶 t a b l a l 一2e n z y m ea n dc o m p a n y 种类名称及公司 纤维素酶 果股酶 c o l l u l a s e0 n o z u k ar - 1 0 ( k i n k iy a k u l tm a n u f c o l t d n i s h i n o m i y 如j a p a n ) c e l l u l a s eo n o z u k ar s ( k i n k iy a k u l ti a n u f c o l t d ，n i s h i n o m i y a j a p a n ) m e i c e l a s ep0 i e i j is e r i k ak a i s h al t d ，n i s h al t d ，t o k y o ，j a p a n ) c e l l u l y s i n ( c a l b i o c h e m ，c a l i f o r n i a9 2 0 3 7 ，u s a ) c e l l u l a s e ( s i g m a u s a ) d r i s e l a s e ( k y o w ah a k k ok o g y oc o ，j a p a n ) p e c t o l y a s ey _ 2 3o 【i k k o m a ns h o y uc o j a p a n ) m a c e r o z y m er _ 1 0 ( z i n k iy a k u l tm a n u f c o l i d ，n i s h i n o m i y a j a p a n ) m a c e r o z y m e ( y a k u l tb i o c h e m i c a l sc o ，j a p a n ) p e c t i n a s e ( s i g m a ，u s a ) p a t e ( p e c t i c a c i d a c e t y l t r a n s f e r a s e ) ( e o e c h s t 。g e r m a n y ) p e c t i n a l ( r o i ma n dh a a sc o u s a ) 半纤维素酶h e m i c e l l u l a s eh - 2 1 2 5 ( s i g m a u s a ) r h q z y m e 胛一1 5 0 ( r o h ma n dh a a sc o u s a ) 原生质体的纯化供体材料经酶解处理消化后，得到的是一种混合物，除了含有完整的未受 损的原生质体外，还有未被消化的细胞、破裂的原生质体、细胞器等成分等，因而必须去除杂质。 去除大块碎屑的方法是将酶解后的混合物通过4 0 1 0 0 u m 的网筛进行过滤，通过离心进一步纯化 ( 1 ) 沉降法将滤液置于离心管中，7 5 1 0 0 x g 下离心，使原生质体下沉，细胞碎片留在上清 液中。弃去上清液，把沉淀于管底的原生质体再悬浮，使原生质体下沉，细胞碎片留在上清液中。 弃去上清液，把沉淀于管底的原生质体再悬浮于配置酶液的具有渗透压稳定剂的培养基中或具有 等渗透压的清洗培养基中，再在5 0 x g 低速离心3 5 m i n ，反复悬浮离心3 4 次。将沉于管底的 原生质体用原生质体培养液悬浮。 ( 2 ) 漂浮法此法的原理是利用原生质体、细胞和细胞碎片等的密度不同而进行纯化，利用 密度大的高渗溶液，离心后使原生质体漂浮其上，细胞碎片等其他成分则沉到管底。具体做法是： 将2 0 2 5 的蔗糖或山梨醇溶液与酶一原生质体按一定比例混合，在7 5 1 5 0 x g 离心5 - l o m i n 后， 原生质体即集中在离心管的顶部，而碎片、叶绿体和未消化的细胞则沉于管底。用移液管小心地 将原生质体吸出，转移到另一个离心管中。