（法医学专业论文）气相色谱法及气质联用法检测动物组织中氧化乐果的研究.pdf

三、论文 前言6日u 舌 第一部分 材料与方法8 结果1 0 第二部分 材料与方法1 7 结果1 8 讨论1 9 结论2 2 四、本研究创新性的自我评价2 3 五、参考文献2 4 六、附录 综j 鲞2 7 致i 射3 9 个人简介4 0 l 3 5 用法检测动物组织氧化乐果的 研究 目的 l 、建立生物检材中氧化乐果的气相色谱和气相色谱质谱检测方法； 2 、建立氧化乐果中毒致死动物模型，观察犬氧化乐果灌胃给药致死过程的生 命体征； 3 、检测中毒致死犬各组织中氧化乐果含量，为氧化乐果中毒致死案件的检材 采取、检测及法医学鉴定提供科学依据。 方法 1 、样品的处理和气相色谱、气相色谱质谱检测：血、组织样品中加入内标 物马拉硫磷，加0 5 m l 1 0 三氯醋酸沉淀蛋白，二氯甲烷萃取，气相色谱质谱联 用法定性，气相色谱内标法定量检测氧化乐果。 2 、氧化乐果在犬体内的含量检测：犬8 只，经口灌胃给药1 4 m l k g ，观察给 药到死亡时的生命体征的变化以及中毒症状，待呼吸和心跳全部消失时，迅速解 剖动物，取心血、心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、脑、胆汁、尿液等冷冻保存， 沉淀蛋白后，二氯甲烷萃取，气相色谱质谱法定性、气相色谱定量检测氧化乐果。 3 、统计学方法：采用s p s s l l 5 统计软件处理数据，结果以均数标准差 ( x 占) 表示，t 检验。 结果 1 、症状犬在经口灌胃后出现中毒症状，给药后1 0 2 0 m i n 实验犬出现流涎， 流泪，大小便失禁，呕吐，瞳孔缩小，痉挛，肌束震颤，呼吸困难至减弱或消失。 实验犬平均在给药后3 6 6 3 4 - 1 6 8 7 m i n 死亡。 2 、氧化乐果在犬体内的含量实验犬体内氧化乐果的平均含量从高到低分别 依次为：肝、心、肺、脑、骨骼肌、肾、脾、心血、尿液、胆汁。 结论 l 、本文建立的生物检材中氧化乐果气相色谱质谱检测方法选择性好，定性 准确，气相色谱检测简便，快速，灵敏，定量结果准确，可用于氧化乐果中毒的 临床快速检验诊断和氧化乐果中毒( 死) 案件的法医学鉴定。 2 、氧化乐果意外死亡和中毒案件进行法医学鉴定时，除常见检材胃组织及胃 内容、心血外仍需采取肝、心、肺、脑等组织进行全面的农药定性和定量分析， 并结合症状及体征发现进行综合判定。 关键词 氧化乐果，动物组织，检测，气相色谱质谱联用，气相色谱法 2 英文论著摘要 s t u d yo nt h ed e t e c t i o no fo m e t h o a t ei n a n i m a lt i s s u ew i t hg ca n dg c m s o b j e ct i v e 1 t oe s t a b l i s ht h ea n a l y s i so f t h eo m e t h o a t ei nb i o m a t e r i a lb yag ca n dag c m s 2 t od e v e l o po m e t h o a t ei n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o nd e a t ha n i m a lm o d e l s ，a n d o b s e r v et h e m a i n l yv i t a ls i g n s o fd o g sa f t e ra n i n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o nw i t h o m e t h o a t e 3 t oi n v e s t i g a t et h ed e t e c t i o no fo m e t h o a t ei nd e a dd o g st op r o v i d eas c i e n t i f i c e v i d e n c ef o rt h ef o r e n s i ci d e n t i f i c a t i o no ft h ep o i s o n i n ga c c i d e n tc a u s e db yo m e t h o a t e m e t h o d 1 g c m sa n dg c ：t h es a m p l e si n c l u d i n gb l o o da n dt i s s u e s ，t ow h i c hi n t e r n a l s t a n d a r do b j e c t ( m a l a t h i o n ) w a sa d d e da f t e rp r e c i p i t a t i n gp r o t e i nw i t ho 5 m l10 t r i c h l o r o a c e t i ca c i d ，o m e t h o a t ew a se x t r a c t e dw i t hd i c h l o r o m e t h a n ea n da n a l y z e d q u a l i t a t i v e l ya n dq u a n t i t a t i v e l yb yg c m sa n dg cr e s p e c t i v e l y 2 t h ed e t e c t i o no fo m e t h o a t e ：8d o g sw e r eg i v e na ni n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o no f o m e t h o a t ew i t had o s eo f14 m g k g a ss o o na st h ev i t a ls i g n sd i s a p p e a r e d t h ed o g s w e r ed i s s e c t e da n dt h es p e c i m e n ss u c ha sh e a r tb l o o d ，h e a r t ，l i v e r , s p l e e n ，l u n g ，k i d n e y , s k e l e t a lm u s c l e ，b r a i n ，b i l e ，u r i n ew e r es a m p l e di m m e d i a t e l y , i nw h i c ht h ec o n c e n t r a t i o n o f o m e t h o a t ew a sd e t e r m i n e db yag ca n dag c m s 3 s t a t i s t i c sm e t h o d ：t h ed a t aw e r ec o l l e c t e d b ys o f t w a r es p s s 11 5a n d e x p r e s s e db y x s r e s u l t s 1 s y m p t o m s ：s a l i v a t i o n , l a c r i m a t i o n ，u r i n a r ya n df e c a li n c o n t i n e n c e ，v o m i t i n g ， p u p i l l a r ym i o s i s ，s p a s m ，f a s c i c u l a t i o na n dd y s p n o e a o c c u r e e da t10 - - , 2 0m i n i t e sa f t e r 姐i n t r a g a s t r i c a d m i n i s t r a t i o nw i t ho m e t h o a t e a n da l l d o g s f r o m i n t r a g a s t r i c a d r n i n i s t r a t i o nw i t ho m e t h o a t ed i e da f t e r3 6 6 3 4 - 16 8 7 m i n i t e s 3 2 t h ec o n t e n to fo n l 砒o a t ei nd o g s ：t h ea v e r a g ec o n t e n to fo m e t h o a t ef r o mh i g h t ol o w ：l i v e r , h e a r t ，l u n g ，b r a i n , s k e l e t a lm u s c l e ，k i d n e y , s p l e e n , h e a r tb l o o d , u r i n e ，b i l e c o n c l u s i o n 1 t h eg c m sa n dg cm e t h o di sm o r es e l e c t i v e ，m o r es e n s i t i v e ，s i m p l e r , m o r e a c c u r a t e , a n dc a nb ea p p l i e dn o to n l yt ot h ec l i n i c a ld i a g n o s i so fo m e t h o m ep o i s o n i n g , b u ta l s ot of o r e n s i ci d e n t i f i c a t i o no fo m e t h o a t ep o i s o n i n gd e a t h 2 b e s i d e st h en o r m a ls p e c i m e n ss t o m a c h ，s t o m a c hc o n t e n t sa n dh e a r t - b l o o d 。w es i l l l c o l l e c to t h e rt i s s u e ss u c ha sl i v e r , h e a r t ，l u n ga n db r a i ni no r d e rt ob em o r ef u l l s c a l e q u a l i t a t i o n a n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s t h e nw eg e tt oc o n c l u s i o n c o m b i n i n gw i t h s y m p t o ma n dp h y s i c a ls i g n k e vw o r d s o m e t h o a t e ，a n i m a lt i s s u e ，d e t e c t i o n ，g c m s ，g c 4 英文缩略语 缩略语英文全称 中文全称 g c g a sc h r o m a t o g r a p h y气相色谱法 g c m s g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y 气相色谱质谱联用检测 h p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 t l c s 龇l a y e r 幽m a t 。聊h ys p e c 哪 薄层色谱法 物组织中氧化乐果的 用来预防，消灭，驱除任何对农 作物有害生物，包括动物，昆虫和杂草内的微生物，如真菌，霉菌，细菌，病毒 和其他有机体，而这些杀虫剂的残留物经常掺合在人们的食物中引起中毒，目前 成为一大公害【1 ，2 1 。 德国化学家g e r h a r ds c h r a d e r 发现了有机磷化合物所含有的抗乙酰胆碱酯酶 的一般结构，并于1 9 4 4 年合成了第一个商品化有机磷杀虫剂一对硫磷【3 1 。自此， 大量的有机磷化合物被合成，并且迅速在世界范围内形成商品化。由于有机磷杀 虫剂( o r g a n o p h o s p h o i u si n s e c t i c i d e s ) 的高效杀虫作用及其残效短的优点，使该类 产品从数量到品种均得以迅速发展，是目前世界上使用最多的一类杀虫剂，也是 我国最广泛使用的一类农药，因其毒性大，少量杀虫剂混入食物中，一经服用就 能引起严重中毒，甚至死亡【4 】。 在中国，有机磷杀虫剂导致的中毒占农药中毒的7 3 ，而这其中大多是由氧 化乐果和敌敌畏引起的【5 1 。氧化乐果，化学名，0 ，0 二甲基s 2 ( 甲胺基) 2 氧 代乙基】硫代磷酸酯，是一种高毒有机磷杀虫剂，是根据乐果在生物体内经氧化代 谢而形成的一种毒力和毒性都比乐果大的化合物的原理【6 ，7 1 ，由工厂合成的有机磷 杀虫剂，在体内的主要作用靶点是乙酰胆碱酯酶和神经酯酶。在发展中国家广为使 用，这给环境和人类健康带来了极大的危害。 山西医科大学负克明教授主持了“十一五”国家科技支撑计划课题“高发率中 毒毒物动力学及其在死因判定中的应用研究”，对我国高发率中毒毒物法医毒物动 力学进行研列引。本研究属于该项目的一部分。 目前，对氧化乐果的研究多针对临床症状表现的案例报道【9 1 2 1 、作用机制 6 0 3 - 1 7 】、临床治疗【1 8 。2 2 1 、农药残留检测【2 3 2 8 】以及机体内氧化乐果的含量测定【2 弘3 0 1 ， 但有关氧化乐果生物体内各组织中的含量检测国内外相关报道很少，需进一步系 统研究。 本实验以犬建立动物模型，检测生物体各组织中的氧化乐果含量，为氧化乐 果中毒( 死) 案件的法医学鉴定提供实验依据。 本研究主要目的： 1 建立生物检材中氧化乐果的气相色谱和气质检测方法； 2 检测生物体各组织中的氧化乐果含量，为氧化乐果中毒和死亡案件的法医 学鉴定提供实验资料。 本研究分二部分： 第一部分生物检材中氧化乐果的气相色谱和气质检测方法研究； 第二部分氧化乐果在中毒犬各组织中的的含量检测 7 第一部分生物检材中氧化乐果的气相色谱和气质检 测方法研究 氧化乐果( o m e t h o a t e ，o m e ) ，又称氧乐果，是有机磷杀虫剂的一种，主要 应用于农业上防治害虫和螨类。由于氧化乐果毒性很大，常有用其投毒、自杀或 误食导致中毒或死亡案件发生【9 也1 。临床和法医工作中常需快速定性、定量检测 血和其他生物检材中氧化乐果。已报道的氧化乐果检测方法有毛细管电泳法【3 0 1 、 c - c 法【3 1 1 、h p l c 法【3 2 】、t l c s 法例和酶联免疫法【3 4 ，3 5 1 ，而生物组织中氧化乐果的 检测方法报道较少【2 9 3 0 1 。本文建立生物样品中氧化乐果的气相色谱和气相色谱 质谱检测方法。 材料与方法 一、药品和试剂 4 0 氧化乐果乳油购于天津京津农药厂； 氧化乐果标准品( 1 0 0 i - t g m l 1 ) 购于北京迪蒙特科贸有限公司； 内标：马拉硫磷原液( 1 2 3 9 m l 。1 ) 购于上海至鑫化工有限公司； 其余试剂均为分析纯。 二、主要仪器 a g i l e n t - 7 8 9 0 a 气相色谱仪( 美国a g i l e n t ) t r a c ed s q 气相色谱质谱联用仪( 美国t h e r m of i n n i g a n 公司) ； j y d - 6 5 0 l 智能型超声细胞粉碎仪( 南京新辰生物科技有限公司) ； d 型低速大容量离心机( 上海安亭科学仪器厂) 。 2 0 0 4 m p 6 型电子分析天平，s a r t o r i u s ，英国 华普达h y - 3 多功能振荡器，常州市华普达教学仪器有限公司 q l 9 0 1 涡旋混合器，江苏海门市麟麒医用仪器厂； 三、溶液配置 l 、氧化乐果标准溶液的配置 将氧化乐果标准液1 0 0 9 9 m l l 用丙酮稀释成1 0 l a g m l 一，置于4 冰箱保存。 2 、内标储备液的配置 r 精确吸取马拉硫磷原液( 1 2 3 9 m ld ) ，用乙醇将其稀释为l m g m l l 的储 备液，置4o c 冰箱保存。 四、实验动物 本地杂种犬，3 只，雌雄兼用，1 0 - - 2 0 k g ，山西医科大学实验动物中心提供。 实验前禁食2 4 h 。 五、仪器分析条件 气相色谱条件：d m - 5 毛细管柱( 3 0 m x 0 2 5 m m x0 2 5 p m ) ，f p d 检测器，进 样口温度：2 0 0 0 c ，空气1 0 0 m l m i n ，氢气7 5 m l m i n ，氮气2 0 m l m i n ，检测器 温度2 0 0o c 。程序升温：初始温度5 0 0 c - - * 2 5 。c m i n - - 1 5 0o c - - * 1 0 0 c m i n - + 2 0 0 o c ( 3 m i n ) 。lp l 不分流进样。 气相色谱质谱条件：d b 5 m 毛细管柱( 3 0m x 0 2 5m m x 0 2 5 p m ) ，e 1 源7 0 e v，质量范围： 5 0 3 0 0 a m u，柱温：5 0 一2 5 m i n 1 5 0 _ 1 0 0 c m i n 一2 0 0 0 c ( 3 m i l l ) ；离子源、传输线和进样口温度均 为2 5 0 。c ；分流进样，分流比为5 0 ：l ；载气：高纯氦气( 9 9 9 9 9 ) 流速1 0 m l m i n ， 恒流模式。 六、动物实验和样品处理 以2 0 倍l d s o ( 5 0 m g - k g 1 ) 氧化乐果经实验犬灌胃，犬在经口灌胃后出现中 毒症状，给药后1 0 2 0 m i n 实验犬出现流涎，流泪，大小便失禁，呕吐，瞳孔缩小， 痉挛，肌束震颤，呼吸困难至减弱或消失。实验犬平均在给药后3 6 6 3 士1 6 8 7 m i n 死亡，实验犬死亡即刻取心血和肝脏待检。 取肝脏1 9 或心血l m l ，加蒸馏水3 m l ，肝脏超声匀浆3 m i r a 加o 5 m l1 0 三氯醋酸，振荡3 0 s 沉淀蛋白，加l m g m l 马拉硫磷内标4 0 p l ，振荡l m i n ：加二 氯甲烷5 m l ，萃取1 5 m i n ，1 8 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，提取2 次，合并有机相，4 0 。c 水 浴浓缩至5 0 0 p l ，按上述仪器条件进样1p l 。气相色谱质谱法定性分析、气相色 谱内标工作曲线法定量分析检液中氧化乐果含量。 七、统计方法 实验所得数据用均数标准差( 工s ) 表示，各组数据用s p s s1 1 5 软件进 行t 检验。 9 图1 ，空白肝脏g c 图 图2 ，空白心血g c 图 1 0 图3 ，空白肝添加氧化乐果g c 图 图4 ，空白血添加氧化乐果g c 图 氧化乐果( t r = 7 0 6 0m i n ) 马拉硫磷( t r = l o 8 4 8m i n ) 氧化乐果( t r = 6 9 4 5m i n ) 马拉硫磷( t r = l o 7 8 1m i n ) h ：o - o 一 r r 蓁 耋 t n _ r - 图9 ，氧化乐果气相g c m s 总离子流图 氧化乐果( t r = 7 0 8 m i n )马拉硫磷( t r = l o 6 8 m i n ) 0 与一 一p s _ 1 0 夕 1 r 5 28i1114il_7-1158量i一卜9i52 4 7 iij| i i 2ii 1【l-一 札1 8 32 ：3 ihl i _ 一1 i i 1 i l i l i 量! 巾i - i j 图1 0 ，氧化乐果质谱图 二、响应曲线 取氧化乐果标准液( 1 0 0 p g m l ) ，用丙酮将母液稀释成5 0 0 、2 0 0 、1 0 0 、 5 0 、2 0 、1 0 、0 5 、0 2 、o 1 h g m l 的标准溶液系列。分别取1 h l 标准溶液，依上 述气相色谱条件下进样。以氧化乐果浓度( x ) 对氧化乐果峰面积( y ) 作线性回 归，回归方程为y = 2 3 3 2 3 x + 4 1 0 0 7 ( r 2 = o 9 9 3 4 ) ，线性关系良好，经t 检验p 3 ) 。 1 4 0 e + 0 5 1 2 0 e + 0 5 l - o o e + 0 5 嚣8 o o e + 0 4 i 星 墅6 o o e + 0 4 4 o o e + 0 4 2 0 0 e + 0 4 0 0 0 e + 0 0 0 1 02 03 04 05 0 氧化乐呆含量( u g m 1 ) 6 0 图1 1 ，氧化乐果响应曲线 三、精密度 取浓度为0 5 、2 0 、5 0 9 9 m l 的三种标准溶液在上述气相色谱条件下每样品 每日测定5 次，连续测定3 日，其日内、日间精密度见表1 。 表1 ，精密度测定结果 份) 、4 0 1 t g ( 3 份) ，按上述方法提取检测，以工作曲线计算样品回收率。如表2 所示。 表2 ，样品回收率测定结果 全血 肝 组分 加标含量0 t g m 1 ) 检出含量( “g m 1 ) 相对回收率( ) 检出含量( p g m 1 ) 相对回收率( ) 氧化乐果8 8 4 0 i 0 61 0 5 0 a ：0 1 9 2 0 - i - 0 811 5 0 士1 3 2 42 2 9 士1 8 9 5 7 i - o 22 5 3 i - 0 7 1 0 5 o 士0 6 4 03 5 6 ：t ：1 3 8 9 1 i - 0 13 9 2 ：t ：0 5 9 8 0 士o 6 五、工作曲线 分别取空白肝组织1 9 和心血l m l ，各1 3 份，置于离心管中，各加蒸馏水3 m l 和内标液4 0 p l ( 1 m g m l ) ，振荡，配制成氧化乐果质量浓度为0 0 5 、o 1 、o 2 、 1 4 图1 2 ，肝脏的工作曲线：y 为氧化乐果峰面积与内标峰面积比值，x 为肝组 织中氧化乐果浓度 y = 0 0 9 8 x 一0 0 6 8 o 氧化乐果含量( u g m l ) 图1 3 ，心血的工作曲线：y 为氧化乐果峰面积与内标峰面积比值，x 为心血 中氧化乐果浓度 4 2 0 8 6 4 2 0 2 1 l 1 峰面积比 1 6 第二部分氧化乐果在中毒犬各组织中的含量检测 近年来，氧化乐果因其防治病虫害效果好而被广泛使用，由其引起的中毒及 投毒、自杀案件屡见不鲜，成为法医工作者非常重视的毒物。对氧化乐果研究的 报道虽然很多，但多集中于临床症状表现的案例报道 9 - 1 2 】、作用机制【1 3 1 7 】、临床 治疗【1 8 啦l 、农药残留检测2 3 瑙1 以及机体内氧化乐果的含量测赳2 9 3 0 1 等方面，本 实验建立氧化乐果中毒致死动物模型，研究氧化乐果在中毒犬各组织中的含量测 定，为氧化乐果中毒死亡案件的检材采取和结果分析提供实验依据。 材料与方法 一、药品和试剂 同第一部分一 二、主要仪器 同第一部分二 三、溶液配制 同第一部分三 四、实验动物 本地杂种犬，8 只，雌雄兼用，1 0 - - 2 0 k g ，山西医科大学实验动物中心提供， 实验前禁食2 4 h 。 五、仪器分析条件 同第一部分五 六、动物实验和样品处理 本地杂种犬，8 只，雌雄兼用，灌胃，匀速注入2 0 l d 5 0 ( 5 0m g k g 1 ) 氧化 乐果，待呼吸和心跳全部消失时，迅速解剖动物，取心血、心、肝、脾、肺、肾、 脑、胆汁等冷冻保存。 样品处理同第一部分六 七、统计方法 同第一部分七 1 7 硅里 ：日刁写 一、g c 和g c m s 检测 同第一部分一 二、含量检测 中毒犬体内氧化乐果的含量检测见表4 和图1 4 。 表4 ，中毒致死犬体内各组织氧化乐果含量检测结果 样品 氧化乐果含量( p g m l o rp e j g ，n = 8 ) i 士s 最人值最小值 心血2 7 3 6 7 8 23 7 5 01 6 7 9 心1 4 6 2 6 2 8 1 61 8 7 5 91 0 2 5 6 肝1 8 1 8 9 2 6 1 52 2 7 2 11 4 8 1 5 脾 肺 肾 骨骼肌 脑 胆汁 尿液 3 6 3 2 8 1 1 1 1 7 2 8 3 9 0 8 6 4 7 6 1 8 6 8 7 3 6 4 2 3 0 8 1 0 3 1 6 4 7 7 7 8 0 2 2 7 4 1 4 3 9 6 8 1 4 9 0 5 1 7 4 2 1 8 4 1 9 1 0 9 5 6 1 6 7 5 0 1 2 2 2 2 5 4 8 2 2 4 0 6 7 4 8 2 7 0 8 4 4 7 7 4 9 8 3 4 3 0 5 3 9 2 5 0 2 0 0 1 5 0 1 0 0 5 0 0 心血心 肝脾肺肾骨骼肌脑胆汁尿液 组织或体液 图1 4 ，中毒致死犬体内各组织中氧化乐果的含量分布 1 8 【暑n蟪暑nv删钿垛蜒笔婿 讨论 一、生物检材中氧化乐果的气相色谱和气质联用检测方法 1 、内标物的选择 氧化乐果是磷酸酯类化合物，根据内标选择原则，本实验初步选择三丁基磷 酸酯作为内标物，但改变仪器条件( 如升高或降低进样口温度、加快或减慢载气 流速、改变升温速率等) 难以将其与氧化乐果峰分开，因此换用马拉硫磷做内标。 但在实验时发现，肝脏中马拉硫磷的提取回收率很低，故在处理样品时使用1 0 三氯醋酸沉淀蛋白，结果肝脏中马拉硫磷的提取回收率显著提高( 见图1 5 和图 1 6 ) 。这可能是肝组织中羧酸酯酶的存在加快了马拉硫磷的分解代谢速掣3 6 1 。 本实验对沉淀试剂1 0 三氯醋酸的用量进行了考察，当使用1 毫升1 0 三氯 醋酸沉淀蛋白时，由于萃取溶剂二氯甲烷比重较大，有机相在下层，沉淀蛋白后 有机相萃取的杂质较多；而减少1 0 三氯醋酸用量为o 5 毫升时，杂质干扰减少， 提取回收率相对提高。但若继续减少三氯醋酸用量，则蛋白沉淀不完全，影响马 拉硫磷的回收率。因此，本实验选用0 5 毫升l o 三氯醋酸为沉淀剂。 图1 5 未经沉淀蛋白的气相色谱图图1 6 经沉淀蛋白后的气相色谱图 氧化乐果( t r = 7 0 3 8m i n s )氧化乐果( t r = 6 9 7 4m i n s ) 马拉硫磷( t r = 1 0 8 1 4m i n s )马拉硫磷( t r = 1 0 7 8 3m i n s ) 另外，以马拉硫磷为内标，峰形良好，与氧化乐果分离度r s 2 ，且与生物 样品中的杂质峰分离良好。 2 、分析条件选择 已报道的氧化乐果检测方法 3 0 - 3 习中，t l c s 法、毛细管电泳法、g c m s 法定 1 9 性准确，定量较差；而g c 法则定量准确。生物样品提取液中杂质干扰比较大， 选用全谱扫描灵敏度低，本实验采用全谱扫描方式结合抽提离子( 氧化乐果的选 择离子m z 为7 9 ，1 1 0 ，1 5 6 ) ，大大提高了检测灵敏度，又避免了漏检组分。保留 时间结合n i s t 2 0 0 2 质谱谱库检索，使定性结果更为可靠。用气相色谱火焰光度 磷型检测器定量分析生物样品中氧化乐果，选择性好，杂质干扰少，灵敏度高， 检测线性范围宽，样品回收率及精密度均达到检案要求，可用于氧化乐果中毒或 死亡案件的法医学鉴定和法医毒物动力学研究，也可用于氧化乐果中毒的临床快 速检验。 二、动物模型 目前对氧化乐果实验研究的模型往往为小型动物模型【1 6 1 7 3 7 9 1 。本文采用犬 做实验动物，与人体组织器官的解剖结构在空间上的差别相对于小型实验动物， 如大鼠、家兔，要小很多，因此实验数据更为接近现实情况。本研究建立了犬的 氧化乐果灌胃给药致死动物模型，研究结果显示，犬在给药后的中毒症状和案例 报道 9 - 1 2 1 及实验研究的农药中毒症状 1 6 - 1 7 1 相似，所建模型可应用于氧化乐果意外 中毒和口服农药中毒死亡的死因判定的研究。 在现代社会中，由于生活压力增大，生活琐事，以及心胸狭隘导致口服大量 农药自杀事件时有发生。由于抱定自杀念头，所以自杀者常常会一次性口服大量 的农药，因此本研究在给犬灌胃给药剂量的选择上，结合氧化乐果对大鼠半数中 毒致死量和按大鼠与犬体型系数推算，选择了给药2 0 倍的犬半数致死量，这样更 贴近现实生活中发生的口服农药自杀事件，更好地为法医学鉴定提供科学依据。 此模型可获得充足、真实的实验数据，但由于个体差异，数据之间存在较大 的离散。 三、含量检测 实验结果显示，死亡当时各组织中氧化乐果含量由高到低分别为( t 检验， p 0 0 5 ) ：肝、心、肺、脑、骨骼肌、肾、脾、心血、尿液、胆汁，说明氧化乐果 在各组织中含量分布不均匀，主要分布于含血丰富和脂质含量高的器官和组织中 如肝、心、肺、脑等，影响农药在机体中分布的因素很多，主要有：农药的脂溶 性、毛细血管通透性、器官和组织的血流量、是否与血浆蛋白和组织蛋白的结合 等【矧。氧化乐果在肝脏中浓度最高可能主要因为其在肝脏与肝微粒体酶进行作用， 存在首关消除也可能是其影响因素；心脏和肺血流量丰富可能是造成浓度较高的 主要原因；有机磷农药易通过血脑屏障及其亲脂性，以及主要作用于神经细胞【4 1 l 的特点决定了氧化乐果在脑中有较高浓度，并产生神经毒性作用；肾及尿液中含 量较低说明氧化乐果在体内处于吸收分布时相，而未达到排泄时相。在现实案件 检测中，胃组织及胃内容是必不可少的检材，对毒物的定性是很重要的，但在本 实验中，给药剂量大，死亡时间短，胃内尚有大量未被吸收的氧化乐果，如图1 7 对于死后分布的定量分析意义不大，故未对胃组织及胃内容进行检测。 氧化乐果( t r = 7 3 8 4m i n )马拉硫磷( t r = l1 1 7 2m i n ) 四、法医学意义 鉴于以上氧化乐果的含量检测结果，我们建议法医师们在氧化乐果中毒或口 服自杀案例中，采集胃组织及胃内容、心血作为检材的同时，也应采集肝、心、 肺、脑等组织进行检测，结合i 临床表现h0 | 、案情分析、病理报告等进行综合分析， 做出科学结论。 2 l 结论 一、检测分析 本实验建立了生物检材中氧化乐果的气相色谱及气质联用的分析方法，二者 能使氧化乐果和内标物得到较好的分离，且精密度良好，可以准确地对检材中的 氧化乐果进行定性、定量检测，可以应用于法医学检案中。 二、动物模型 本文建立了氧化乐果染毒犬群体模型。此模型的优点是可保持尸体的完整性， 模型简单易复制，体位稳定性好，存放容易。 三、含量检测 2 0 l d 5 0 氧化乐果灌胃后，染毒犬在3 6 6 3 + 1 6 8 7 m i n 内死亡。各脏器组织氧化 乐果含量由高到低分别为( t 检验，p 0 0 5 ) ：肝、心、肺、脑、骨骼肌、肾、脾、 心血、尿液、胆汁，说明氧化乐果在各组织中含量分布不均匀。 本科研创新性的自我评价 目前对氧化乐果在生物检材中的含量检测研究国内外少有报道，本研究首次 建立氧化乐果中毒致死犬群体动物模型，为氧化乐果中毒案件的合理取材和人体 内氧化乐果中毒分布情况提供参考，为正确评价毒物分析结果提供科学依据。 参考文献 ll a w se l lh a y e sw j h a n d b o o ko fp e s t i c i d et o x i c o l o g y s a nd i e g o ，c a ：a c a d e m i c p r e s s 1 9 9 1 2s c o t tj gi s ia t l a ss c ip h a r m a c o l o g y 19 8 8 3g a l l om a ，l a w r y kn j o r g a n i cp h o s p h o r u sp e s t i c i d e s i n ：h a y e sj r e r ，l a w se r ，e d i t o r s , h a n d b o o ko f p e s t i c i d et o x i c o l o g yrc l a s s e so f p e s t i c i d e s j s a nd i e g o a c a d e m i cp r e s s 1 9 9 1 ( 2 ) ：9 1 7 1 1 2 3 4 黄光照主编法医毒理学【m 】人民卫生出版社2 0 0 4 5 h u a n gj a c u t ep e s t i c i d ep o i s o n i n gi nc h i n a 2 0 0 1 h t t p ：w w w n i h s g o j p g i n c m e e t i n 7 t h 7 p r o f i l e c h i n a p d f 6 炱克明法医毒物动力学中国法医学杂志阴2 0 0 8 ；2 3 ( 6 ) ：3 6 1 3 6 9 7p e t e re y e r , m a r i ar a d t k e ，f r a n zw o r c k r e a c t i o n so fi s o d i m e t h o a t ew i t hh u m a nr e dc e l l a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e 叨b i o c h e m i c a lp h a r m a c o l o g y 2 0 0 8 ；7 5 ( 10 ) ：2 0 4 5 - 2 0 5 3 8f r a n c am b u r a t t i e m a n u e l at e s t a i e v i d e n c e sf o rc y p 3 a 4a u t o a c t i v a t i o ni nt h ed e s u l f u r a t i o n o fd i m e t h o a t eb yt h eh u m a nl i v e r j 】t o x i c o l o g y 2 0 0 7 ；2 41 ( 1 2 ) ：3 3 - 4 6 9 h a a r d e m a ，j h j m m e e r t e n s o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d ep o i s o n i n g ：c a s e s a n d d e v e l o p m e n t s j 】t h en e t h e r l a n d sj o u m a lo f m e d i c i n e 2 0 0 8 ；6 6 ( 4 ) ：1 4 9 1 5 3 10e d d l e s t o nm ，s i n g h s ，b u c k l e yn o r g a n o p h o s p h o r u sp o i s o n i n g ( a c u t e ) c l i n e v i d 2 0 0 5 ；1 3 ：1 7 4 4 5 5 1 le d d l e s t o nm p a t t e r n sa n dp r o b l e m so fd e l i b e r a t es e l f - p o i s o n i n gi nt h ed e v e l o p i n gw o r l d q j m 2 0 0 0 ；9 3 ( 1 1 ) ：7 1 5 3 1 12l e ep ，t a id y c l i n i c a lf e a t u r e so fp a t i e n t sw i t ha c u t eo r g a n o p h o s p h a t ep o i s o n i n gr e q u i r i n g i n t e n s i v ec a r e i n t e n s i v ec a r em e d 2 0 01 ；2 7 ( 4 ) ：6 9 4 9 13n a n dn ，a g g a r w a lh l ( b h a r t ikc h a k r a b a r t id o r g a n o p h o s p h a t ei n d u c e dd e l a y e d n e u r o p a t h y ja s s o cp h y s i c i a n si n d i a 2 0 0 7 ；5 5 ：7 2 3 1 4s t a c e y m o r l e yd ，p a y n es s e c o n d a r yc o n t a m i n a t i o ni no r g a n o p h o s p h a t ep o i s o n i n g ： a n a l y s i so f a ni n c i d e n t q j m 2 0 0 4 ；9 7 ( 2 ) ：7 5 - 8 0 15 b u r a t t if m t e s t a ie e v i d e n c e sf o rc y p 3 a 4a u t o a c t i v a t i o ni nt h ed e s u l f u r a t i o no f d i m e t h o a t e b yt h eh u m a nl i v e r t o x i c o l o g y 2 0 0 7 ；2 4 1 ( 1 2 ) ：3 3 4 6 16f a r a g a t ，k a r k o u rt ，e lo k a z ya t e r a t o g e n i ce f f e c to fo r a l l ya d m i n i s t e r e dt e c h n i c a l d i m e t h o a t ei nr a t s b i r t hd e f e c t sr e sp a r tb ：d e vr e p r o dt o x i c 0 1 2 0 0 6 ；7 7 ：4 0 - 6 17a m i r am s ，h a m a d if ，g h a z ib ，k a m e lj ，e m n aa ，f e r i e le ，e ta 1 e f f e c t so fd i m e t h o a t eo i l b o n e m a t u r a t i o no f y o u n g r a t s d u r i n g t h e s u c k l i n gp e r i o d p e s t i c i d e b i o c h e m p h y s i 0 1 2 0 0 5 ；8 3 ：1 3 2 - 9 18r o b e r t sd m ，a a r o nc i cm a n a g i n ga c u t e o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d ep o i s o n i n g b n u 2 0 0 7 ；3 3 4 ：6 2 9 3 4 1 9e d d l e s t o nm ，b u c l d e yn a ，e y e rp ，d a w s o na h m a n a g e m e n to fa c u t eo r g a n o p h o s p h o r u s p e s t i c i d ep o i s o n i n g l a n c e t 2 0 0 8 ；3 7 1 ( 9 6 1 2 ) ：5 9 7 6 0 7 2 0e d d l e s t o nm ，d a w s o na ，k a r a l l i e d d el e