（物理化学专业论文）纳米沸石与生物分子的相互作用研究及其在生物传感方面的应用.pdf

摘要 纳米沸石具有大的外表面积，丰富的表面作用位点以及可以进行多重调变的特 点，近年来被广泛的应用于生命科学领域的研究。大量的实验研究已经表明纳米沸 石类材料可以将大量的，多种的生物分子吸附在其表面并保持其相应的活性，因而 在生物分离，生物检测以及生物催化与传感等前沿领域有着广泛的应用。另外我们 的研究还发现纳米沸石自身的性质( 如形貌，尺寸和硅铝比) 会对利用纳米沸石吸 附生物分子以及后续利用产生影响。显然，造成这一现象的原因是由于不同的纳米 沸石表面对生物分子有着不同的相互作用。因此，为了更加合理的将纳米沸石材料 应用于生物检测等前沿领域并最终实现对纳米沸石材料的“定向的”表面设计与控 制，就非常有必要去研究纳米沸石如何对生物分子进行吸附，吸附的相互作用的本 质，以及这些相互作用如何影响吸附在材料表面上的生物分子的结构与性质等一些 更为基础的课题。因此，本论文的研究目的在于利用不同尺寸、形貌和硅铝比的纳 米沸石和模型蛋白，来系统研究蛋白质分子在不同纳米沸石表面的吸附行为以及其 与纳米沸石之日j 的相互作用，总结其中规律并进行初步应用。 本文首先利用外标法，使用紫外可见分光光度计研究了各种蛋白质分子在不同 纳米沸石表面上的吸附量。一方面，我们改变纳米沸石的性质，包括改变纳米沸石 的种类、尺寸、表面形貌以及化学组成( 硅铝比) ；另一方面，我们选用不同性质 的蛋白质，包括不同等电点、分子量以及形貌的蛋白质，系统的研究了不同纳米沸 石对蛋白质的吸附量的变化，总结出初步的吸附规律。结果表明：( 1 ) 纳米沸石的 尺寸越小，吸附量越大；( 2 ) 纳米沸石的硅铝比越低，吸附量越大；( 3 ) 尺寸效应 比硅铝比效应对蛋白吸附量影响显著。( 4 ) 分子量大的蛋白质吸附摩尔数较小。此 外，通过改变吸附的条件，如改变吸附体系的p h ，来分析和验证纳米沸石粒子与 蛋白质分子之间的静电相互作用模型。 本文还利用各种表征手段详细研究了多种蛋白质吸附在纳米沸石表面后其构 象规律。我们选用具有不同“光谱活性”的蛋白质，包括细胞色素c ( c y t o c h r o m e - c ) ， 肌红蛋白( m y o g l o b i n ) ，血红蛋白( h e m o g l o b i n ) ( 具有紫外可见吸收活性) ，牛血 清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) ( 具有荧光活性) ，采用紫外可见吸收光谱法 ( u v - v i s i b l e ) ，荧光光谱法f l u o r e s c e n c e ) ，再结合红外光谱法( f t i r ) ，分别研究 了这些吸附在不同纳米沸石表面上的蛋白质的活性中心，内源荧光环境以及二级结 构的变化，进而总结出纳米沸石与蛋白质物理相互作用的初步规律。我们发现：纳 米沸石的尺寸越大，硅铝比越低，沸石与蛋白质之间的相互作用就越强，其中尺寸 效应比硅铝比效应显著。此外，通过纳米沸石对蛋白质吸附结构变化的滴定实验， 我们迸步揭示并确认了蛋白分子在纳米沸石表面的多层吸附模型。 在本文的最后，我们利用层叠层技术( u 儿) 将纳米l t l 沸石组装在导电玻璃 i t o 的表面，并通过纳米沸石固定细胞色素c ，制备成纳米沸石修饰的酶电极。分 别利用循环伏安法( c v ) 和电流一时间法( i t ) 测定了细胞色素c 的电化学响应以 及其对双氧水的传感性能。实验发现所制备的酶电极不仅具有良好的电化学性能和 传感性能，而且可以通过控制修饰电极的组装层数来调变它们的传感性能。而纳米 沸石修饰酶电极之所以具有良好的传感性能主要源于纳米l t l 沸石不仅对细胞色 素c 有着较高的固定量而且还能尽可能的保持其活性构象。 关键词：纳米沸石，蛋白质，紫外可见吸收光谱法( u v 订s j m e ) ，荧光光谱法 ( f l u o r e s c e n c e ) 红外光谱法( f 1 1 r ) ，循环伏安法( c v ) ，电流时间法 ( i t ) ，层叠层( l b l ) a b s t r a c t n a n o z e o l i t em a t e r i a l sh a v em a n yu n i q u ec h a r a c t e r i s t i c sc o m p a r e dw i t ho t h e rt r a d i t i o n a l m a t e r i a l s f i r s t l y , t h e yh a v eal a r g ee x t e r n a ls u r f a c ea r e ab e c a u s eo ft h en a n o s c a l e e f f e c t s e c o n d l y , t h e r ea r el o t so fa d s o r p t i o ns i t e so nt h e i rs u r f a c ea n dt h e s ep o s i t i o n sc a nb e e a s i l ym a n i p u l a t e dv i ac h a n g i n gt h e i rs u r f a c ep h y s i c a l c h e m i c a lp r o p e r t i e st h r o u g h c o n t r o l l i n gt h es y n t h e s i sc o n d i t i o n so rm o d i f y i n gt h es u r f a c ew i t ho t h e rf u n c t i o n a la g e n t s c o n s i d e r i n ga d v a n t a g e sa b o v e ，n a n o z e o l i t eh a sb e e na p p l i e dt ol i f e - s c i e n t i f i cr e s e a r c h r e c e n t l y m a n ye x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tn a n o z e o l i t e sc o u l da d s o r bv a r i o u sk i n d so f b i o m o l e c u l e so nt h e i rs u r f a c ew i t hah i g ha d s o r p t i o na m o u n t i na d d i t i o n ，t h ea d s o r b e d b i o m o l e c u l e so nt h es u r f a c ee a nk b e pt h e i ra c t i v i t yw e l l a sar e s u l t ，n a n o z e o l i t e sh a s b e c o m ea “s t a r f o rb i o a p p l i c a t i o n , s u c ha sb i o s e p a r a t i o n ，b i o d e t e c t i o n ，b i o c a t a l y s i sa n d b i o s e n s o r m e a n w h i l e ，i tw a sf o u n dt h a td i f f e r e n tn a n o z c o l i t e sw i t hd i f f e r e n tp r o p e r t i e s c a np e r f o r md i f f e r e n ta d s o r p t i o nb e h a v i o rf o r t h es a m ea d s o r b e db i o m o l e c u l e s ，a n da f f e c t t h e i ra f t e r w a r db i o a p p l i c a t i o n t h i sc a nb ea t t r i b u t e dt ot h ed i f f e r e n ti n t e r a c t i o n sb e t w e e n d i f f e r e n tn a n o z e o l i t e sa n db i o m o l e c u l s ，c o m i n gf r o mt h ed i f f e r e n c eo nt h es u r f a c e p r o p e r t yo fa l lk i n d so fn a n o z e o l i t e i no r d e rt ob e t t e ru s en a n o z e o l i t ef o rb i o a p p l i c a t i o n ，i ti sn e c e s s a r yt od ot h er e s e a r c h a b o u th o wn a n o z e o l i t e si n t e r a c tw i t hb i o m o l e c u l e s ，w h i c hd e t e r m i n e st h ea d s o r p t i o n a m o u n t , a d s o r p t i o nc o n f o r m a t i o nc h a n g e sa n dp r o p e r t yc h a n g e so ft h o s ea d s o r b e d b i o m o l e c u l e s t oa c h i e v et h eg o a l ，i nt h i st h e s i s , w ec h o s ed i f f e r e n tn a n o z e o l i t e sw i t h v a r i o u ss i z e sa n ds i a lr a t i o sa sr e s e a r c hm o d e l s ，a n da n a l y z e dh o wt h e s ef a c t o r sc a n c h a n g et h e i ri n t e r a c t i o n sw i t hv a r i o u sp r o t e i n s f i r s t l y , w ed e t e c t e dt h ea d s o r p t i o na m o u n to fp r o t e i n so nt h es u r f a c eo fn a n o z e o l i t e p a r t i c l e su s i n gu v - v i s i b l ea b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r y i ti s f o u n dt h a t1 ) d i f f e r e n t n a n o z e o l i t e sw i t hd i f f e r e n ts i z e sc a na f f e c tt h ea d s o r p t i o na m o u n ta p p a r e n t l y , w h i c h m e a n st h es m a l l e ro ft h ez e o l i t es c a l e ，t h el a r g e ra d s o r p t i o na m o u n tt h e yw i l lh a v e ；2 ) d i f f e r e n tn a n o z e o l i t e sw i t hd i f f e r e n ts i a lr a t i o sc a na l s oa f f e c tt h ea d s o r p t i o na m o u n t ， w h i c hi st h o s ew i t hl o w e rs i a lh a v eh i g h e ra d s o r p t i o na b i l i t y ；3 ) t h es i z ec h a n g e p e r f o r m sab i g g e re f f e c tf o rp r o t e i na d s o r p t i o nt h a ns i a ir a t i o sc h a n g e 钔t h em o l n u m b e ro fa d s o r b e dp r o t e i n sw i t hb i g g e rm o lw e i g h ti sl o w e rt h a nt h o s ew i t hs m a l l e rm o l w e f g h t i na d d i t i o n , w eh a v es h o w nt h a tt h ea d s o r p t i o na m o u n tc a nb ec h a n g e db y a l t e r i n gp hv a l u eo fa d s o r p t i o ns o l u t i o n , f o rt h es a m en a n o z e o l i t ea n dp r o t e i n t h i s p h e n o m e n o nc a nd e m o n s t r a t et h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nm o d e lb e t w e e nn a n o z e o l i t e s a n dp r o t e i n s s e c o n d l y , w ed e t e c t e dt h ec o n f o r m a t i o nc h a n g e so ft h ep r o t e i n sa d s o r b e do i lt h es u r f a c e o fv a r i o u sn a n o z e o l i t e sw i t ht h et i m eo ra d s o r p t i o nc o n d i t i o n t h eu v - v i s i b l ea b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p yw a su t i l i z e dt od e t e c tt h es o r e tb a n dc h a n g e so ft h o s eh e m e - p r o t e i n s ，a n d t h ef t i rs p e c t r o s c o p yw a sa p p l i e dt o a n a l y z e t h es e c o n d a r y s t r u c t u r ec h a n g e so f p r o t e i n s i na d d i t i o n ，t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yw a su s e dt of r e do u th o wt h e e n v i r o n m e n to ft r y p t o p h a nc h a n g e sd u r i n gt h ea d s o r p t i o np r o c e s s i tw a sf o u n dt h a tt h e n a n o z c o l i t ew i t hs m a l l e rs i z eo rl o w e rs i a ir a t i o sh a sas t r o n g e ri n t e r a c t i o nw i t h p r o t e i n s ，t h u sc h a n g i n gt h ec o n f o r m a t i o no fp r o t e i n si nam o r ed e g r e e m e a n w h i l e ，t h e t i t r a t i o ne x p e r i m e n to fc y t o c h r o m ecd e m o n s t r a t e di tw a sam u l t i l a y e ra d s o r p t i o n m e c h a n i s mf o rt h ea d s o r p t i o no fp r o t e i n so nt h en a n o z c o l i t e s a tt h ee n do ft h i st h e s i s ，w eu t i l i z e dl a y e r - b y l a y e r ( l b l ) t e c h n i q u e ，t oa s s e m b l et h e n a n o l t l - z e o l i t eo nt h es u r f a c eo fi t oe l e c t r o d e t h e ne n z y m ee l e c t r o d e sw i t hd i f f e r e n t a s s e m b l yl a y e rn u m b e rw e r ec o n s t r u c t e dv i aa d s o r b i n gc y t o c h r o m eco nt h em o d i f i e d e l e c t r o d e c y c l i cv o l t a m m o g r a m ( c v ) a n da m p e r o m e t r i cr e s p o n s ec u r v ew e r ed e t e c t e d r e s p e c t i v e l yt os t u d yt h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ra n dt h eb i o s e n s o rb e h a v i o rf o rt h e e n z y m ee l e c t r o d e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn o to n l yt h ee n z y m ee l e c t r o d e sp e r f o r m e d w e l lf o rb o t l lt h ee l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s ea n ds e n s o rf u n c t i o n b u ta l s ot h ee n z y m e e l e c t r o d e sw i t hd i f f e r e n ta s s e m b l yl a y e rn u m b e rh a v ed i f f e r e n tb u tc o n t r o l l a b l es e n s o r p r o p e r t i e s t h e s ec h a r a c t e r i s t i c sc o u l db ed u e t ot h ef a c tt h a tn a n o z e o l i t e sa s s e m b l e do n i t oh a v eh i g hi m m o b i l i z a t i o na b i l i t ya n df a c i l i t a t ei n t e r a c t i o nw i t he n z y m e s k e yw o r d s ：n a n o z e o l i t e ，p r o t e i n , u v - v i s i b l e ，f h r ，f l u o r e s c e n c e , c v , i - t ，l a y e r - b y - l a y e r ( l b l ) 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作r 明确的声明 并表示了谢意。 作者签名： 近垒笾同期：丛2 ： 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名： 垂捡导师签名：2 圣墨妇。日期：鲨zi ：! 第一章绪论 1 1 纳米沸石材料简介 第一章绪论 1 1 1 纳米沸石的结构与性质 沸石类材料是一类重要的分子筛材料，在石油化工生产方面起着不可替代的作 用1 1 】。简单来说，沸石分子筛就是一种结晶型的硅铝酸盐。化学组成可表示为； m 。j n ( a l o z ) x ( s i o z ) y 】z h 2 0 。例如：a 沸石：n a l 2 ( a i o e ) m ( s i 0 2 ) 1 2 z h 2 0 ，x 沸 石；n a s 6 ( a 1 0 2 ) “s i 0 2 ) 1 0 6 z h 2 0 和y 沸石：n a 5 6 ( a 1 0 2 ) 5 6 ( s i 0 2 ) d 6 z h 2 0 。此外， 也可用磷、镓、锗、钒、铬、铁等元素替代或部分取代骨架硅或铝，而形成一些杂 原子型分子筛。天然分子筛( 沸石) 已发现约4 0 多种，人工合成分子筛已多达一、 二百种。沸石材料主要是由硅氧四面体和铝氧四面体组成的。硅氧四面体和铝氧四 面体可以通过顶点互相连接，从而形成各种各样的骨架结构。这些四面体首尾相连 可以形成多员环结构，如四员环，六员环等等。环与环相互连接又可以形成笼结构。 如双四员环连接可以形成立方体笼；双六员环连接可以形成六方体笼。不同结构的 笼通过氧桥互相联结形成各种不同结构的分子筛( 见f i g u r e1 1 ) 。沸石分子筛的结 构特点就是在其骨架结构中有许多规则的孔道和空腔，可以用来气体的分商【“。在 孔道和空腔中的阳离子( 平衡骨架阴电荷) 是可交换的p l 。由于分子筛具有明确的 孔腔分布，具有极高的内表面积，有良好的热稳定性( 依赖于其骨架组成，在空气 中热处理可达1 0 0 0 ) ，故广泛地用作工业催化剂或催化剂载体。在实际应用中主 要是利用沸石分子筛骨架中的各种酸性位来进行各种酸催化反应【4 j ，应用于石油裂 解工艺。另外，由于分子筛结构中有均匀的小内孔，当反应物和产物的分子线度与 晶内孔径相接近时，催化反应的选择性常取决于分子与孔径的相应大小。这种选择 性称之为择形催化围。无论是利用沸石的酸性还是择形性，都可以通过控制合成的 条件来对酸性位或者是孔道结构进行调变。 1 1 2 纳米沸石的合成与表征 1 1 2 1 纳米沸石的合成 1 ) 水热晶化法： 利用水热晶化法可以合成出多种纳米沸石：1 3 沸石、a 型沸石 6 - 7 1 、x 沸石罔、 y 沸石、l 沸石l 舢1 0 1 、7 _ 3 m 一2 1 1 1 1 2 1 、z s m 一5 、p 0 4 5 【1 3 l 、s i l i c a l i t e 1 【1 4 l 、羟基方钠石 复旦大学硕士论文第1 页 第一章绪论 1 5 2 6 1 a 1 ) 4 r i 多种氯环 第= 绪拇层次 多面体和笺 第三结构层次 留圄翁 a 型分子筛方钠石型x 、y _ 型分子筛 f i g u r e1 1t h es t r u c t u r ec o m p o s i t i o no fz e o l i t e 等。从产品的聚集形态分，通过水热晶化法合成出的纳米沸石产品主要有两类。一 是以分立的胶体粒子形式分散于溶剂中，形成沸石溶胶，它们主要在较低的晶化温 度下合成；另一类则以纳米沸石的聚集体形式存在，其晶化温度相对较高。 s c h o e m a n 等1 1 7 m j 深入探讨了具有m f i 结构的s i l i c a l i t e 1 的晶化机理及理化特 性，研究了沸石胶体的合成规律，发现了硅源，模板剂，碱度，水量及醇含量对沸 石粒径的调控作用，并对晶化温度的影响做了考察，f i g u r e1 2 是成胶配比为9 t p a o h ：0 1n a 2 0 ：2 5t e o s ：4 8 0h 2 0 的纳米沸石在不同温度下的晶化曲纠2 1 l 。u 等【2 2 1 用两步变温合成法对不同硅源合成s i l i c a l i t e 1 胶体进行了研究，发现以j 下硅酸 乙酯为硅源得到的纳米沸石粒径明显小于其它无定型二氧化硅为硅源所得的产品， 并且其粒径分布较窄。c o r k e r y 等瞄l 将水解后的s i 0 2 一t p a o h 溶胶在室温下经过4 0 个月的老化得到粒径约为5 5l l m 的s i l i c a l i t e 1 沸石。 复旦大学硕士论文第2 页 次嚣扒喵斟轷 卜太 ，r 第一章绪论 s y n t h e s i st i m e h f i g u r e1 2e f f e c to ft h ec r y s t a l l i z a t i o nt e m p e r a t u r eo nt h ep a r t i c l ed i a m e t e ro ft h e s i l i c a l i t e - 1c o l l o i d 2 ) 受限空间法： s c h m i d t 等采用受限空间法来控制纳米沸石的晶粒大小及分布，该方法是在惰 性中孔介质的有限的中孔空隙中晶化沸石，然后除去惰性介质得到了高结晶度的纳 米沸石1 2 4 埘】，例如，在炭黑微珠介质内合成出的s i l i c a l i t e 1 ( z s m 5 ，t s 1 ) 、b 、x 、 a 型沸石的粒径分布分别为2 0 7 5 、7 3 0 、2 2 6 0 、2 5 3 7 枷。并用此方法合 成出具有中孑l 结构的沸石单晶【2 6 , 2 8 l ，其中所合成的中孔t s 一1 沸石单品在烯烃的环 氧化反应中显示出良好的催化性能幽l 。 3 ) 干凝胶转变： 干凝胶转变技术( 办称气固相晶化) 也是得到小晶粒沸石的行之有效的方 法【2 9 侧，该技术是二十世纪九十年代出现的一种合成沸石的新方法，它与传统水热 法的根本区别是合成原料与溶剂甚至模板剂的分离。根据模板剂的挥发性和加入方 式的不同，干凝胶转变技术可分为气相转变法1 3 1 l 和水蒸气辅助转变法【3 j - 3 2 。例如， r a o 等f 3 3 1 用该方法在数小时内就可合成出粒径为1 0 0 1 8 0a m 的6 沸石，并且其合 成条件很宽，产率较高。但该方法得到的产品均以聚集体的形式存在，在纳米沸石 的组装领域不能利用。 1 1 2 2 纳米沸石的表征： 1 ) x 光衍射( x r d ) x r d 是表征纳米沸石晶型及结晶度的主要手段，但随着沸石晶粒的减小x r d 谱峰呈宽化趋势，所测的表观结晶度会有所下降，这主要是由于小粒子对x 射线的 消光作用1 3 4 1 。利用衍射峰的宽化值还可估算出平均晶粒大小，但其结果一般偏小【3 5 1 。 复旦大学硕士论文 第3 页 第一章绪论 例如f i g u r e1 3 是不同粒径大小的s i l i c a l i t e - 1 的x r d 谱。 一，肌一一。仳 “肌一。帆一! 51 01 52 02 53 03 5 20 。 f i g u r e 1 3x r dp a t t e r n so ft h es i l i c a l i t e - 1 ( 8 0 0 ) ( a ) ，s i l i c a l i t e 一1 ( 1 2 0 ) ( b ) ，a n d s i l i c a l i t e 一1 ( 8 0 ) ( c ) s a m p l e s 2 ) 红外光谱( i r ) l r 光谱是表征分子筛晶型及结晶度的有效辅助手段，对晶粒很小的沸石微晶， x r d 常表现为无定型结构，而i r 光谱则可观察到由很少几个晶胞构成的沸石微晶 的骨架振动【矧。与常规尺度的沸石相比，纳米沸石的i r 光谱在9 6 0c l n 4 左右常会 出现较强的硅羟基峰，但其强度往往会随着焙烧温度的增加而减小1 3 7 1 。此外 r a v i s h a n k a r 等吲还发现在纳米沸石s i l i c a l i t e 1 的红外谱图中( f i g u r e1 ，5 5 0c l n 。1 暑 暑 芒 卜 # f i g u r e1 4i rs p e c t r ao fh ea s s y n t h e s i z e d ( a ) a n dc a l c i n e d ( b ) s i l i c a l i t e - 1n a n o c r y s t a l s w i t hp a r t i c l es i z eo f8 0a m 复旦大学硕士论文第4 页 j占喇g_i 第一章绪论 处归属m f i 结构五元环振动的吸收峰分裂为双峰。 3 1 固体核磁共振( s o l i d n m r ) 固体核磁共振是用来表征沸石骨架结构的有效手段。随着沸石晶粒的减小，2 9 s i m a sn m r 和”m a sn m r 信号的半峰宽往往逐渐展宽，硅羟基峰也明显增强。 z h a n g 等通过对探针分子全氟丁胺吸附前后的1 hm a sn m r 谱的研究发现纳米沸 石中桥式羟基( 即b 酸中心) 蜂强度的降低明显大于微米级沸石，表明分子筛粒径 下降到纳米级后，外表面的b 酸在总的b 酸中所占的比例急剧增大瞄】。此外，z h a n g 等【3 9 j 还利用2 9 s im a sn m r 和2 7 a jm a sn m r 以及它们的交叉极化的m a sn m r 谱对纳米h z s m 5 沸石的稳定性进行了研究。 4 ) 粒径的大小和形貌表征： 纳米沸石的大小及单分散性也是其性质的一个重要参数。动态光散射( d l s ) 是 一种便捷的胶体粒子尺寸的测量方法，被广泛用来测量纳米沸石的粒径分布。t e m 和s e m 则可直观地表征纳米粒子大小、分布和形貌。从s e m 结果可知，大部分纳 米沸石粒子呈( 椭) 球形，这可能是小粒子具有较高的表面自由能，球形粒子可以最 大限度地减小粒子的表面能【3 7 1 。l a n d a u 等【4 0 j 利用高分辨率透射电镜( h r t e m ) 和低 温透射电镜( c r y o - t e m ) 发现其所合成出的6 0 1 0 0n m 的b 沸石粒子是由更小的 初级粒子( 1 0 2 0n m ) 的聚集体构成。例如s e m 图( f i g u r e1 5 1 f i g u r e1 5s e mi m a g e so fs i l i e a l i t e 一1 ( 8 0 ) ( a ) ，z s m - 5 ( 9 0 ) 嘞a n dt s 一1 ( 1 0 0 ) ( c ) n a n o e r y s t a l sp r e p a r e da t3 7 3k 1 1 3 纳米沸石在生命科学方面的初步应用 由于纳米沸石具有大的外表面积，丰富的表面作用位点以及可以进行多重调变 的特点，近年来被广泛的应用于生命科学领域的研究。无论是生物分离，生物检测， 还是生物催化与传感，都可以将大量的，多种的生物分子吸附在纳米沸石的表面并 复旦大学硕士论文第5 页 第一章绪论 保持其相应的活性。 ( 1 ) 生物分离 研究了模型蛋白b s a 和c e a ，分别以c u 2 + 、c 0 2 + 、z n 2 + 离子交换的纳米z s m 5 粉煤灰材料为吸附剂，以梯度浓度的咪唑溶液为洗脱液，详细研究了沸石为基质的 亲和金属离子亲和色谱的机理【4 “，f i g u r e1 6 是两种模型蛋白在上述沸石吸附剂的 分离结果。可见采用z n “离子交换的z s m - 5 粉煤灰能够很好地将二者分离。两种 蛋白所含有的不同组氨酸的数量和位置决定了其金属离子交换沸石的作用强弱 ( f i g u r e1 7 ) ，从而实现了二者在不同咪唑浓度下被洗脱与分离。此外，研究表明 以钴离子交换的b e a 纳米沸石硅藻土多级孔材料为吸附剂组装成离子亲合色谱 柱，能够实现麻鸭和小鼠的血清中s e p 蛋白与其它含硒蛋白的完全分离，且重现性 良好。 f i g u r e1 6t h es e p a r a t i o nf i g u r eo fc e a ( 1 ) a n db s a ( 2 ) f r o mt h ec h r o m a t o g r a m e o n s t r c u c t e db yz n 2 + _ z s m 5 0 l = c i 产翻t z n m ”- - 、，、 1 c h e l a t k m j 必酬k f i g u r e1 7t h ep i c t u r eo fi n t e r a c t i o n sb e t w e e np r o t e i n sa n dz e o l i t ei m m o b i l i z e di o n s 复旦大学硕士论文第6 页 j*售。赛d 第一章绪论 ( 2 ) 生物检测 研究发现利用纳米沸石丰富的表面性质如：可调的表面电荷以及亲水、疏水性 质，以及其在水有机溶剂中极高的分散性，并结合生物质谱m a l d i t o f - m s 自身 的特点，实现了痕量肽段以及蛋白酶解液的无歧视性富集和直接的 m a l d d t o f - m s m s 鉴定( f i g u r e1 8 ) 1 4 z j ，两且由于纳米沸石较小尺寸能够在质 谱的检测中和有机基质有效混合，所富集样品无需洗脱，避免了样品在洗脱过程中 的损失，简化了富集步骤。实验表明，与未经纳米沸石富集的情况相比，蛋白质检 出限提高5 0 - 1 0 0 0 倍。另外纳米沸石还表现出极好的抗哉性，即使是在1 m 的高盐 溶液中，也可以完美富集痕量多肽甚至在被检测肽段的质谱检测中表现出更高的信 噪比。还对其进行了肌红蛋白酶解液的富集，发现在溶液浓度降低1 0 0 倍的基础上， 经纳米沸石富集后仍然可以达到6 0 - - 7 0 的序列覆盖度在溶液浓度降低1 0 0 倍的基 础上，经纳米沸石富集后仍然可以达到6 0 - - 7 0 的序列覆盖度，并且大大改善了其 信噪比。另外，纳米沸石粒子与生物分子之间的相互作用受其表面结构、硅铝比的 影响在此文中也有明显的体现，例如：只有具有中等硅铝比的纳米沸石b 表现了一 个良好的无歧视的富集效果，过低的硅铝比导致较差的富集果，而低硅铝比的u m 纳米沸石甚至会影响后续的质谱出峰，严重影响了样品的检测。具有全硅组成的 s i l i c a l i t e 一1 纳米沸石却具有和中等硅铝比的b e t a 纳米沸石相当的富集效果。另外， 纳米沸石表面存在大量的活性硅羟基，可以进行有目的修饰，利用纳米沸石的这种 容易修饰性和大的外比表面积，通过必要的修饰在纳米沸石纳米固定了f e 3 + 离子， 根据其对蛋白酶解液中磷酸化肽段的特异性螫合作用，实现了磷酸化肽段的特异性 富集和直接的m a l d i t o f - m s m s 鉴定。f i g u r e1 9 给出了纳米沸石的表面f e 3 + 修饰改性过程以及选择性富集鉴定磷酸化多肽的示意图。从f i g u r e1 1 0 可以看出， 对纳米沸石粒子表面进行f c ”改性后，可以从蛋白酶解液中选择性地富集出磷酸化 多肽，从而减少了其他多肽在m s 检测过程中对磷酸化多肽的压制作用，为进一步 进行串联m s 鉴定，判断磷酸化数目和位点提供了可能f 4 3 1 。 f i g u r e1 8s c h e m ef o rn a n o z e o l i t e st oe n r i c hp e p t i d e sf o rm a l d i - t o f - m s d e t e c t i o n 复旦大学硕士论文第7 页 第一章绪论 ( 3 ) 纳米沸石粒子在固定化酶和生物传感方面的应用 a 纳米沸石粒子用于微流控芯片中的蛋白固定 蛋白质鉴定是蛋白质组学研究中最关键的一环，而最常规的鉴定蛋白质的流 f i g u r e1 9s c h e m ef o rm o d i f i e dn a n o z e o l i t e sf o rd e t e c t i o no fp h o s p h o p e p t i d e s f i g u r e1 1 0t h em a l d i t o f - m sp a t t e r n so fp h o s p h o p e p t i d e sf r o m1 3 - c a s e i nb yt r y p t i c ( 0 2 n m o l m l ) ( a ) b e f o r ea n d ，( b ) a f t e rt h ef e ”n a n o z e o l i t ee n r i c h m e n t 程是先将蛋白质经过胰蛋白酶酶解后再进入生物质谱测序，常规的蛋白溶液酶解一 般需要过夜，很耗时，很难达到蛋白质组学要求的高通量。微流控芯片由于其特殊 的空间限域作用，可以大大缩短蛋白的酶解时间。一般来讲，通道中固定的酶浓度 复旦大学硕士论文第8 页 鲁*目暑三甚 莹鲁3 u i 誊 第一章绪论 越高，酶解速度越快，但是仅仅靠通道内壁固定酶显然是远远不够的。我们课题组 研究发现某些纳米沸石粒子具有极高的蛋白吸附能力，而且纳米沸石本身又具有良 好的胶体分散性，很容易也被作为组装单元组装或者填充至任何通道或者衬底表 面。因此我们选择对胰蛋白酶具有极高吸附能力的l 1 r l 纳米沸石( 超过l o o o m e c g 纳米沸石) 作为酶固定化载体，丽将其固定于微流控芯片孔道中，利用其对胰蛋自 酶的固定能力，解决了原来微流控芯片仅靠通道内壁固定酶的缺陷，大大增加了微 流控芯片通道中酶的浓度，从而加速了蛋白的酶解速度。另外，此微反应器还具 有很好的操作稳定性l 删。 此外，分别选择了纳米u l 和1 3 沸石粒子，作为酶固定化载体，利用层叠层技 术，在导电玻璃电极表面成功地构筑了纳米沸石酶电极，发现该电极具有固酶量可 调、无需电子传递媒介、检测限低、稳定性好、寿命长的特点，经对酶电极电化学 性能、传感性能及其物理化学性质表征，发现纳米沸石较高的蛋自周载量和适中相 互作用是该电极具有良好性能的原因，为进一步发展多种酶传感电极提供了基础。 f i g u r e1 1 1 分别给出了通过石英微天平分析仪测量纳米b 沸石和p d d a 交替组装 组装在电极表面的过程( a ) 以及不同纳米b 沸石组装层吸附酪氨酸酶( b ) 的微重量分 析曲线。根据微重量分析曲线可以看出，随着纳米沸石组装层的增加，电极表面可 固定的酪氨酸酶的量也在增加，根据这个结果推算组装3 、5 、7 层纳米沸石粒子的 电极分别可以固定酶的量分别为7 9 5 , u g c m 2 ，1 1 2 6 如n 2a n d1 2 4 1 p g c m 2 ，而且随 着酶含量的增加，以苯酚为探针分子的电化学计时电流的值也随之增大( f i g u r e 1 1 2 ) ，说明我们可以通过简单的组装控制来控制电极表面固定的酶量，从而达到控 f i g u r e l 1 1 q c m f r e q u e n c ys h i f t s f o r c y c l e s o f a l t e r n a t e n a n o z e o l i t e p d d a a s s e m b l y a n df i r s tt w os t e p sp d d a p s sa s s e m b l yo ng o l dr e s o n a m r b ) o c m f r e q u e n c y s h i f t sf o r t h ea d s o r p t i o no ft y r o s i n a s e ( 1 0m e , m l ) o nt h ed i f f e r e m ( n a n o z e o l i t e p d d a ) n i t o e l e c t r o d e sr e s p e c t i v e l y 复旦大学硕士论文第9 页 第一章绪论 制甚至设计其生物传感性能的目的【4 5 - 4 6 。 f i g u r e 1 1 2 a m p e r o m e t r i cr e s p o n s e o ft h e t y r o s i n a s e ( n a n o z e o l i t e p d d a ) n i t o e l