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糖类相关基因芯片的设计与制备 中文摘要 研究背景：糖组学是近年来发展起来的生命科学前沿领域之一。糖同核酸一样是重要的 生物信息分子，而且是基因信息的延续，在基因组学和蛋白质组学发展的同时，对糖组 学的研究也显得非常迫切。糖蛋白糖链和糖脂糖链多存于在细胞表面和细胞分泌的蛋白 上，它们不仅可通过糖基化影响蛋白质功能，更重要的是还通过与糖结合蛋白的相互作 用调控细胞识别、信号传递、细胞内吞以及细胞生长、分化和凋亡等生物学行为。某些 疾病发生时，蛋白质和脂分子糖基化的异常会导致糖链发生结构和数量的改变。糖链的 合成是由基因编码的糖基化转移酶催化的，据估计哺乳动物细胞基因组中约有0 5 1 0 的基因参与糖链的合成与代谢。对特定时期生物体内的参与形成n 一与o 糖链的一 整套酶系统来进行基因表达谱研究，有助于揭示糖类相关基因与糖链形成的关系，具有 诊断学上的重要意义。 方法：基因芯片是近些年来应用较为广泛的一种高通量检测技术，本实验采用6 0 m e t 寡核苷酸芯片制备方法，对从c f g ( c o n s o r t i u mf o r f u n c t i o n a l g l y c o m i c s ) 和 c a z y ( c a r b o h y d r a t e a c t i v ee n z y m e s ) 数据库中对已报道的人的糖基转移酶、糖苷酶和磺 基转移酶基因进行筛选，并通过g e n e b a n k 数据库获取基因的m r n a 序列。应用o l i g o 6 0 软件对m r n a 序列进行探针设计并通过b l a s t 同源性比对。合成出6 0 m e t 寡核苷酸 探针由点样系统点至于氨基化玻片上，经过紫外交联等步骤制备出糖类相关基因芯片。 结果：设计出了糖类相关基因的6 0 - m e r 寡核苷酸探针，糖基转移酶探针1 3 0 个，糖苷 酶探针1 2 个，磺基转移酶探针4 8 个，管家基因探针1 0 个。制备出了糖类相关基因芯 片，芯片经过实验验证，证明我们设计和制备的芯片符合杂交实验的要求，能运用于实 际样品的研究；通过对大骨节病病人血液与正常血液样本的比较研究，筛选出差异表达 的糖类基因4 9 个，其中上调基因2 8 个，下调2 1 个。通过实时荧光定量p c r 技术对其 中2 个表达差异较大的基因进行相对定量，其结果与芯片结果呈现出一致性。本试验设 计和制备出了糖类相关基因芯片，为疾病与相关糖类基因关系的研究建立了技术平台。 关键词：糖基转移酶；磺基转移酶；糖苷酶；基因芯片；大骨节病 a b s t r a c t b a c k g r o u n d ：g l y c o m i c si so n em o s ta d v a n c i n gs p h e r ei n l i f es c i e n c e l i k en u c l e i c a c i d ，t h es a c c h a r i d ea l s op e r f o r mav e r yi m p o r t a n tp a r ti nt h ee x t e n s i o no fg e n em e s s a g e ，s ot h e r e s e a r c hi ng l y c o m i c sa p e a r se x t r e m l yu r g e dd u r i n gt h ed e v e l o p i n go fg e n o m i ca n dp r o t e m i c r e s e a r c h t h eo l i g o s a c c h a r i d ec h a i n si ng l y c o p r o t e i n sa n dg l y c o l i p i d so f t e na p p e r a n c ei nt h e c e l ls u r f a c e sa n dt h ep r o t e i n sw h i c hs e c r e t e de x t e r n a lc e l l t h eo l i g o s a c c h a r i d ec h a i n sp a l ya n i m p o t a n tw a yn o tn o l yi ne f f e c t i n gt h ef u n c t i o n so fg l y c o p r o t e i n ，b u ta l s or e g u l a t i n gw i t h c e l l - r e c o g n i t i o n ，s i g n a l t r a n s m i s s i o n ，e n d o c y t o s i s ，c e l l g r o w t h ，c e l l d i f f e r e n t i a t i o na n d a p o p t o s i s t h ec o n s t r u c t i o na n da m o u n to fo l i g o s a c c h a r i d ec h a i n sa r ec h a n g i n gd u r i n gs o m e d i s e a s e sh a p p e n i n g t h es y n t h e s i so fo l i g o s a c c h a r i d ec h a i n si sc a t a l y s i s e db yg e n e - c o d o g e n i c g l y c o t r a n s f e r a s e s i ti s c o n s i d e r e dt h a ta b o u to 11 0 g e n e si nm a m m a l i a ng e n o m e p a r t i c i p a t et h es y n t h e s i sa n dm e t a b o l i s mo fo l i g o s a c c h a r i d ec h a i n s t h er e a s e r c ho fg e n e t i c e x p r e s s i o no faw h o l es e to fe n z y m a t i cs y s t e mw h i c ht a k ep a r ti nf o r m i n gn - a n do - o l i g o s a c c h a r i d ec h a i n si sv e r yh e l p f u li nr e v e a l i n gt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eg l y c o g e n ea n d g l y c o s t a i n , i ti sa l s os i g n i f i c a n c ei nad i a g n o s t i cw a y p u r p o s e ：g e n ec h i pi sah i g h - f l u xd e t e c t i n gm e t h o de m e r g i n gd e c a d e sy e a r s o u re s s a y a d o p t a n a s s a yp r e p a r a t i v e m e t h o db y6 0 m e to l i g o n u c l e o t i d e w es h i f tt h eh u m a n g l y c o s y l t r a n s f e r a s e ，g l y c o s i d a s e sa n ds u l f o t r a n s f e r a s e sf r o mt h ed a t a b a s eo fc f g ( c o n s o r t i u m f o rf u n c t i o n a lg l y c o m i c s ) a n dc a z y ( c a r b o h y d r a t e - a c t i v ee n z y m e s ) , t h e np i c ku pt h e m r n a s e q u e n c e s i nt h eg e n e b a n k b yu s i n gt h eo l i g o6 0a n db l a s t ，w ec a nd e s i g np r o b e s f o rt h e h y b r i d i z a t i o np r o p e r l y f u r t h e rm o r e ，a f t e rp r i n t e do nt h ea m i n og l a s sw h e nt h e 6 0 m e ro l i g o n u c l e o t i d ep r o b e sa r er e a d y ，w ec a ng e tt h ef i n i s h e dp r o d u c t sb yo t h e r ss t e p s c o n c l u s i o n s ：w eh a v ed e s i g n e dh u n d r e d so f6 0 - m e to l i g o n u c l e o t i d ep r o b e s ，w h i c h c o m p o s e13 0g l y c o s y l t r a n s f e r a s eg e n e s ，12g l y c o s i d a s eg e n e s ，4 8s u l f o t r a n s f e r a s eg e n e sa n d10 h o u s e k e e p i n gg e n e s w ep r e p a r et h eg l y c o g e n ec h i pa n dc e r t i f i c a t ei t sr e l i a b i l i t yb ym o r e e x p e r m e n t s ；b e s i d e s ，w et a k eac o m p a r a t i v es t u d yi nt h ek b db l o o da n dn o r m a lb l o o db y h o m e m a d eg e n ec h i p ，a n df i n do u t4 9a b n o r m a lg l y c o g e n ew h i c hc o m p r i s e2 8u p - r e g u l a t i v e g e n e sa n d21d o w n r e g u l a t i v eg e n e s w ep i c k e du p2g e n e st h o s ee x p r e s s i n gd i s c r e p a n c y d e e p l ya n dt a k e dr e l a t i v eq u a n t i t i o n sb yr e a l - t i m ep c r t h er e s u l ts h o w st h a ti tc o n f o r m st o t h er e s u l tf r o mt h eg l y c o g e n ec h i p t h i sr e s e a r c hp r o v i d e san o v e lg l y c o s y l g e n ec h i pa sa t e c h n i c a lp a l t f o r mt oi n d i c a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ed i s e a s e sa n dg l y c o g e n e s k e yw o r d s ：g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s ，g l y c o s i d a s e ，s u l f o t r a n s f e r a s e ，a r r a y ，k a s h i n - b e k s y n d r o m e 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：醢虿) 垒 指导教师签名： 学位论文作者签名：陛2 j 丝 指导教师签名： 09 年月岁日 一夕年己月尹日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本 论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大 学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名i 降i 诬 d 多年歹月岁日 两北人学硕i j 学位论文 第一章文献综述 1 1糖组学的发展 1 1 1 糖组学的概况与研究进展 糖组学( g l y c o m i c s ) 是继基因组学和蛋白质组学后的新兴研究领域。由于糖本身 结构的复杂性使得人们对其的研究进展缓慢。直到2 0 世纪末，一些糖生物学家才提出 糖组的概念，并得到广泛认同。“糖组”定义为单个个体的全部聚糖，可进一步分解为 不同的层次，例如高等动物的糖组可分为糖蛋白组、蛋白聚糖组和糖脂组。针对糖蛋白 进行结构分析，确定编码糖蛋白的基因和蛋白质糖基化的机制和功能等，糖组学研究工 作的重点是对糖组的产生、结构与功能的全面分析。 之所以对糖组产生积极的研究进展，主要包括以下几个原因：1 许多生命现象发生 在细胞水平，但主要场所并不是在细胞基质与细胞核中，而是细胞表面。事实上，丰富 多样的聚糖覆盖了生物有机体的所有细胞，因此聚糖结构和各种生命现象的产生与形成 有着重要联系。2 具有足够的多样性是作为信息分子的基础，聚糖则恰好蕴藏了复杂的 结构。3 聚糖的分子结构改变从某些方面可能反映了它们的生物和分子进化作用。 1 1 2 糖组学的研究内容 糖组学的主要研究对象即为聚糖，而聚糖往往和蛋白质相连，因此其研究重点包括： 糖基化基因信息的研究；糖基化位点的研究；聚糖结构以及糖基化作用。 1 糖基化基因信息的研究 蛋白质糖基化是指糖链在肽链合成的同时或之后，由酶催化被连接到肽链上的特定 糖基化位点的过程。此类蛋白往往受到其上连接的糖链的影响，产生一定结构和活性的 变化。例如，许多遗传疾病都常常伴随异常的糖苷化和糖苷酶的缺少。因此，研究编码 糖蛋白的基因信息，有助于通过控制基因信息操作蛋白质上的糖链而使之正常表达其生 理作用。 2 糖基化位点的研究 对最主要蛋白质修饰的过程一糖基化及其位点的研究，有助于人们理解微生物感染 的机制，为抗感染药物的研发指明方向。 3 糖链功能的研究 事实证明，结构复杂的聚糖具有重要的生物功能，譬如可以影响蛋白的折叠，细胞 第一章文献综述 粘附及免疫识别等生物过程。研究糖链的功能，对于了解人体正常生理生化功能以及多 种疾病的发生发展等具有指导性作用【2 i 。 1 1 3 糖组学的研究技术 由于糖链结构的复杂性与多变性，迄今为止仍没有建立一种准确有效的方法对其进 行测定。因此，对糖链的分离分析等新方法的研究与建立便是其结构与功能研究的重要 基础和保证。 1 糖蛋白及糖链的分离纯化 目前发展的糖组的分离纯化技术主要有：糖捕获技术、糖微阵列技术、化学选择糖 印迹技术、激光微裂解技术等。但这些技术都只是处于初级阶段，有待进一步提高和完 盏 口o 1 )糖捕获技术 其主要步骤：凝集素亲和层析分离糖蛋白：使用a c h r o m a m o b a c t e r 菌的蛋白酶i 消化 糖蛋白成糖肽，凝集素亲和层析分离糖肽，h p l c 纯化糖肽，对糖肽进行序列分析、质 谱检测和解离常数测定；在数据库中搜索以获得相关遗传和糖基化信息；用不同类型的 凝集素进行多次循环，捕捉其他类型的糖肽进行分析。最终对某个细胞进行较全面的糖 组学研究【3 ，4 1 。 2 ) 糖微阵列技术 微阵列技术涉及到芯片技术，即将带有氨基的各种聚糖共价连接在包被有化学反应 活性表面的芯片上。此类芯片上排列了不同的糖结构，几乎包括所有末端糖的主要类型。 目前此技术已经成功运用于凝集素的筛选和表型5 。 3 ) 化学选择糖印迹技术 其主要步骤：将连有苯肼类似物基团的高聚物试剂与糖蛋白消化液混合，以捕捉聚 糖；离心过滤，从混合物中收集高聚物；将高聚物中的聚糖释放，并对其进行m a l d i t o f 质谱或m a l d i l i f t - t o fpt o f 又 y , 质谱分析【8 】。 2 糖链的标记 为了更有效的检测到糖链，需要对本身没有发色集团的糖进行标记或衍生化。目前 流行的糖链的标记技术主要有放射性同位素标记、探针标记等。 3 糖链的结构鉴定 测定糖类结构包括了测定其分子量、糖残基种类和数目、糖残基接合位置连接点与 其构型。质谱是解决糖结构的有效手段：软电离技术都适合于分析高极性、难挥发、热 不稳定糖类样品：t o f m s 和f t _ m s 是测大分子糖最佳选择，精度高特别适合糖复合 物或多糖降解后单和寡糖残基鉴定和序列测定。当然异构体区分特别是立体结构测定尚 2 两北人学硕 ：学位论文 待研究完善。糖蛋白或其它糖复合物都含寡糖链，多糖也由寡糖聚合而成，所以毹决寡 糖结构是关键。可用m a l d l l o f 测寡糖分子量与结构但产生碎片离子较少，提供结构 信息不多。近来用源后衰减技术来弥补此缺点。m a l d i - - m s 常用于糖复合物分析且碎 片离子少，如出现多个强峰则暗示样品是混合物，很可能各组分分子离子峰。常用m a l d i f t m s 来测糖复合物酶消解液中分离寡糖，天然糖复合物寡糖键组成有规律，可用于 结构判断。如哺乳动物机体中糖复合物所含n 一连结寡糖0 1 。 1 ) 基质辅助激光解吸离子化飞行质谱 当前，基质辅助激光解吸离子化飞行质谱( m a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o n t i m e o f - n i g h t ，m a l d i t o f ) 在蛋白质组研究中具有广泛应用。因为m a l d i t o f m s 具 有从非衍生分子中获得离子的能力，能够正确反映糖蛋白的构成，同时亦方便与其他技 术( j g l h p l c 、g c 或外切糖苷酶) 结合，提供更多的结构信息。但是m a l d i t o f 的分 辨率和质量精度较低，会导致蛋白质鉴定的不确定性，同时会引起分子中较弱的键断裂， 导致糖链部分或全部丢失，造成糖链的定位信息和结构信息不完整。所以m a l d i t o f 在糖组学研究中还存在遗憾【1 1 1 。 2 ) 傅立叶变换离子同旋共振质谱 高分辨率、高质量精度的傅立叶变换离子回旋共振质谱( f t - i c r m s ) 吸引了研究者 的注意。1 9 7 4 年c o m i s a r o w 等发明 f t - i c r - m s ，几经改进，直到h e i 珂等将电喷雾 离子化技术( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n ，e s i ) 弓i 入f t - i c r - m s 才真正开启了高精度生物学分析 的大门。e s i 高灵敏度改进，如m i c r o e l e c t r o s p r a y 和n a n o e l e c t r o s p r a v ，f t - i c r m s 可以分 析真正生物水平( n m 0 1 ) 的生物样品。f t - i c r m s 也受到糖组学研究的关注【1 4 1 。f t - i c r m s 多重的独特的分裂技术碰撞活化的分裂( c o l l i s i o n a la c t i v a t e dd i s s o c i a t i o i l ，c a d ) ，红外线 多光子分裂( i n f r a r e dm u l t i p h o t o nd i s s o c i a t i o n ，i r m p d ) 以及电子捕获分裂 ( e l e c t r o n c a p t u r ed i s s o c i a t i o n ，e c d ) ，可以确定后修饰的位置和修饰的结构。e c d 劈开 氨基酸主链而不影响后修饰部分，可以进行后修饰定位i r m p d 劈开后修饰部分，分析 后修饰的结构信息。m a r k 将小胶质细胞全蛋白质经p a 衍生后双向电泳分离，糖蛋白被 s y p r o r u b y 染色，在胶内用胰蛋白酶水解，先用m a l d i t o f m s 分析肽链组成，余下 的样品用m i c r o e s f t - i c r m s 测定糖链的结构信息，很轻松地获得几个糖蛋白的全部结 构。 1 2 糖链的结构 糖蛋白在自然界中的分布十分广泛，不仅存在于脊椎动物和无脊推动物中，也存在 第一章文献综述 于植物、单细胞有机体和病毒中。在高等动物中大部分糖类聚合物往往都与蛋白质共价 连接，在低等动物以及植物中情况也可能如此。 大量的研究已表明，各种错综复杂的生命现象的产生与疾病的形成过程均包含了许 多分子变化和复杂的代谢过程，其中糖蛋白的糖链在受精、发生、发育、分化、炎症与 自身免疫疾病，在癌细胞异常增殖及转移中都起到重要作用。 随着糖组学的发展，越来越多的糖蛋白被发现并研究。糖组学研究重点方向之一为 糖蛋白的糖链的组成与形成方式。目前研究的结果表明参与糖蛋白糖链的单糖主要为八 种。分别为b d 葡萄糖( g l c ) 、a d 甘露糖( m a n ) 、a d 半乳糖( g a l ) 、a d 一木糖( x y l ) 、 0 【d 阿拉伯糖( a r a ) 、a l 岩藻糖( f u c ) 、葡萄糖醛酸( g l c u a ) 、艾杜糖醛酸( i d u a ) 、 n 乙酰葡萄糖胺( g i c n a g ) 、n 乙酰半乳糖胺( g a l n a c ) 、n 乙酰神经氨酸( n e u n a c ) 即唾液酸( s i a ) 【1 5 】。这些单糖形成的糖链主要以n 连接与0 连接方式与糖蛋白相结合。 麓翰塘，a 耙 拳鬻，蜷，m 嘲 n 乙醒甏萄塘，疆c a c 段 h联 礁媛酸，s 施 n - 乙酰氮纂拳乳糖o d n a c拳乳镑o _ 术糖，x y l 意臻穗。触 图1 构成生物体蛋白糖蛋链的八种单糖分子结构 糖蛋白是蛋白质通过共价键与糖类结合的复合物，其中的糖基少则只有一个，多则 可达数百个，后者的糖基常常连接成寡糖链，又称为聚糖( g l y c a n ) 。 糖蛋白糖链结构具有多样性程度很大，从已经在几个数据库中可以获取已取得鉴定 的n 连接聚糖与o 连接聚糖的信息。通过如下两个网站：h t t p ：w w w g l y c o m i n d s n e t 和 h t t p ：w w w g l y c o s u i t e c o m 可以搜索到关于糖链结构的数据信息。以n 连接糖链为例， 目前经过化学鉴定的结构已经多到了5 0 0 余个，而这一事实表明，与哺乳动物糖蛋白 a s n 残基相连的各类型聚糖至少有上千种。 4 雠 r h名脚国n p f掣h 星 hno o 丫洲 盆一 。n弘嚣杠h 移k 釉 蓼蚀 衄 并q o 、 佣1 辩 r n k 西北人学侦i ：学位论文 1 2 1 糖蛋白的糖链连接方式 通常糖蛋白按照糖链与蛋白质的连接方式可以分为n 一连接与o _ 连接。 1 n 一连接糖蛋白 1 ) 糖基化位点： n 连接糖蛋白，由寡糖中的n 乙酰葡糖胺与多肽链中天冬酰胺残基的酰胺氮连接 形成。但是糖蛋白分子中并非所有a s n 残基都可与寡糖连接，只有在特定的氨基酸序列， 即a s n x s e r t h r ( 其中x 可以是p r o 以外的任何氨基酸) 3 个氨基酸残基组成的序列子 才有可能，这一序列于被称为糖基化位点。1 个糖蛋白子可存在若干个a s n x s e r t h r 序 列子，这些序列子只能视为潜在糖基化位点，能否连接上寡糖还取决于其周围的立体结 构【1 6 1 。 2 ) n 聚糖的五糖核心 由内侧的两个以d 1 ，4 键连接的g l c n a c 和外侧的3 个m a n 组成，其中两个m a n 分别以0 c 1 ，3 和0 c 1 ，6 键与内侧的另一个m a n 相连，构成n 聚糖的仪1 ，3 臂和0 【1 ，6 臂。 其内侧的m a n 再以p 1 ，4 键连接内侧的g i c n a c 。有些n 聚糖内侧的g l c n a c 还以 0 【1 ，6 键与一个f u c 相连，称为核心f u c 。也可再在1 3 - m a n 上连接一个g i c n a c ，这个 g i c n a c 位于两个0 c m a n 之间【1 7 】。 3 ) n 连接寡糖结构 n 一连接寡糖可分为三型： a 高甘露糖型( h i g hm a n n o s es u b t y p e ) 在这种类型中，五糖以外的糖基全部是m a n ，其中不分支时的连接为o 【1 ，2 ，而分 支时的连接为0 c 1 ，3 或a 1 ，6 。 1 ) h i g h - m a n n o s es u b t y p e 籼伍。斗2 h 蹴n d ，3 n 叠。啼4 g l c 雌雄l 啼a g 王c 雕c 啼舳n 。搬n 口，专2 k 堪a n a 。 图2高甘露糖n _ 糖链结构示意图 第一章义献综述 b 复杂型( c o m p l e xs u b t y p e ) 在仪1 ，6 m a n 的c 2 和c 6 位以及c t 1 ，3 m a n 的c 2 和c 4 位上连接有数目不同的外侧 糖链，一般简称为外链，又称天线。 每条天线从内。到外由互相连接的g l c n a e 、g a l 和s a ( n e u a c ) 或和f u c 构成，最短的 外链仅由一个g l c n a c 组成。凡是带有s a 的称为酸性糖链，缺少s a 或用f u c 取代s a 的 则称为中性糖链。 i i ) c o m p l e xs u b t y p e 土f t l c 旺l 爝畦嫩德2 啼6 雠3 g a 事l 啼毒钒c 眦侈”融吣 、6 6 m a n 8 l 啼4 g l c n r c i l l - - l , 4 g l c n a c - i , a a n 3 n e 砸c l z 2 - - 1 , 6o r3 g a 堆1 哆4 g l c n k c 势u d l l a n o , 1 图3复杂型n - 糖链结构示意图 c 杂合型( h y b r i ds u b t y p e ) 对于这种类型，在核心的两个0 c m a n 上，一个仪1 ，3 m a n 连接有复杂型的外链，是 由g l c n a c 、g a l 和s a ( n e u a c ) 或和f u c 组成的天线，而另一条0 c 1 ，6 m a n 上则连接一个 或多个m a n ，即其一半分子类似复杂型，另一半分子类似高甘露糖型，故称为杂合型。 i i i ) h y b r i ds u b t y p e 6 蚍王一p l m a n 仅t ? 饿n a 气硅乳羔，奄g 乏c 艇犍b ，4 g l c 榭妃a 盛矗 j t t 3 g 最l p1 4 g 】c n a c p l m a n a l 4 ) 天线数 6 图4杂合型n - h 结构示意图 两北人学硕f ：学位论文 复杂型n 聚糖的天线数目为l 一5 条，其中单天线很少见，仅存在于极少数糖蛋白 ( 如绒毛膜促性腺激素) 中，一般与0 c 1 ，3 m a n 连接。二天线比较多见，两条天线都以 d 1 ，2 键分别与两个0 【m a n 的c 2 位相连，故称c 2 c 2 二天线n 聚糖。 三天线有两种类型：一种是两条外链分别与1 2 1 ，3 m a n 的c 2 位( 3 - l ，2 键) 和c 4 位( p 1 ，4 键) 相连，另一条外链则连于a 1 ，6 m a n 的c 2 位( 3 - 1 ，2 键) 上，称为c 2 ，4 c z 三天线n 聚糖。另一种是两条外链与o c 1 ，6 m a n 的c 2 位和c 6 位( p 1 ，6 键) 相连，另 一条外链则连于0 【1 ，3m a n 的c 2 位上，称为c 2c 2 6 三天线n 聚糖。 五天线糖链仅存在于鸟类的糖蛋白中，即o c 1 ，6 臂上仅m a n 的2 ，4 ，6 位分别以p 1 ，2 键、p 一1 ，4 键和p - l ，6 键各接一条外链，又称c 2 ，4c 2 ，4 ，6 五天线n - 聚糖。 2o 连接糖蛋白 1 ) o 一连接寡糖结构 寡糖中的n 一乙酰半乳糖胺与多肽键的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基连接形成0 - 连接 糖蛋白。它的糖基化位点的确切序列子还不清楚，但在糖蛋白分子表面丝氨酸和苏氨酸 比较集中且周围常有脯氨酸的序列中普遍存在。含此连接键的糖蛋白有时称为o _ 糖苷键 型糖蛋白，这种连接方式很容易被稀碱水解。根据连接的氨基酸残基不同分为两种类型： a 糖基和羟赖氨酸的羟基连接 这类糖基只存在于胶原中，且只有一个半乳糖( g a l ) 或其外侧再连有葡萄糖( g l c ) ， 最终组成g l c g a l 二糖。 b 糖基或糖链与s e r 、t h r 的羟基连接 这类连接方式的种类较多，主要有以下几种形式： a ) 岩藻糖( f u e ) 与s e r t h r 连接：在一些含有表皮生长因子( e g f ) 结构域的蛋白质 中发现的仅有一个岩藻糖基的糖蛋白连接方式，其中s e r t h r 的n 侧常常是两个连续的 g l y 残基。 b ) n 乙酰氨基葡萄糖( g i c n a c ) 与s e r t h r 连接：这种连接方式也是每个连接位 点只有一个糖基，但可有多个连接位点。这种类型的连接存在于细胞质、核质或核膜的 蛋白质中，包括许多细胞骨架蛋白、神经细丝蛋白、突触囊泡蛋白、转录因子和癌基因 蛋白中。 c ) n 乙酰氨基半乳糖( g a l n a c ) 与s e r 1 1 l r 连接：这是最常见的o 连接方式，最 少时糖基只有一个g a l n a c ，多时可达1 8 个以上。 d ) g a l n a c 以1 ，4 键与蛋白质肽链上的s e r t h r 连接，有时又称为o g a i n a c 连 7 第一章文献综述 接或o g a l n a c 糖链o 在此基础上，其它糖基可连接成长链或分支糖链。 这类糖链在糖蛋白中普遍存在，因其广泛存在于粘蛋白中，又称为粘蛋白型聚糖。 糖基组成除g a l n a c 外，还有g a l 和g l c n a c 。酸性的o g a l n a c 聚糖末端可含有唾液酸 ( s a 或s i a ) ，高等动物中的s a 主要是乙酰神经氨酸( n e u a c ) 。有时末端也含有岩藻 糖( f u c ) ，但整个聚糖不含甘露糖( m a n ) 。 粘液蛋白中糖基化的程度高，平均大约每隔两个残基就出现一个糖基化的苏氨酸或 丝氨酸。但有的糖蛋白中只有几个苏氨酸或丝氨酸发生糖基化。如人低密度脂蛋白的脱 辅基脂蛋白c i i i 仅含一个糖基化的苏氨酸残基【l 引。 1 2 2 糖蛋白糖链的功能 许多执行不同功能的蛋白质都是糖蛋白，糖蛋白中的寡糖链不但能影响蛋白部分的 构象、聚合、溶解及降解还参与糖蛋白的相互识别和结合等，这些作用是蛋白质和核酸 不能取代的。 l 寡糖链对新生肽链的影响 1 ) 不少糖蛋白的n 连接寡糖链参与新生肽链的折叠并维持蛋白质j 下确的空间构 象。如用核酸点突变的方法，去除某一病毒g 蛋白的2 个糖基化位点后，此g 蛋白就 不能形成正确的链内二硫键而错配成链间二硫键，空间构象也发生改变。运铁蛋白受体 有3 个n 连接寡糖链，分别位于a s n 2 5 1 ，a s n 31 7 和a n s 7 2 7 。已发现a n s 7 2 7 连接有高 甘露糖型寡糖链，与肽键的折叠和运输密切相关，a s n 2 5 1 连接有三天线复杂型寡糖链， 此寡糖链对于形成正常二聚体起重要作用。可见寡糖链能影响亚基聚合。 2 ) 很多糖蛋白的寡糖链可影响糖蛋白在细胞内的分拣和投送。溶酶体酶合成后被 运输至溶酶体内就是一个典型的例子。首先溶酶体酶在内质网内合成后，其寡糖链末端 的甘露糖在高尔基体内被磷酸化成6 磷酸甘露糖，随后与存在于溶酶体膜上的6 磷酸甘 露糖受体识别并结合，定向转移至溶酶体内。若寡糖链末端甘露糖不被磷酸化，那么溶 酶体酶只能分泌至血浆，而溶酶体内几乎没有酶，导致疾病产生。 2 寡糖链对糖蛋白生物活性的影响 一般来说，去除寡糖链的糖蛋白，容易受蛋白酶水解，说明寡糖链可保护肽链，延 长半衰期。不少酶属于糖蛋白，若去除寡糖链，并不影响酶的活性，但也有些酶的活性 依赖其寡糖链，如1 3 羟1 3 甲戊二酰辅酶a 还原酶去糖链后其活性降低9 0 以上，脂蛋 白脂酶n 连接寡糖的核心血糖为酶活性所必需。 免疫球蛋白g 也是n 一连接糖蛋白，其糖链主要存在于f c 段，i g g 的寡糖链与i g g 结 8 两北人学硕f j 学位论文 合于单核细胞或巨噬细胞上的f c 受体，对补体c l q 的结合和激活以及诱导细胞毒等过 程有关。若i g g 去除糖链，其绞链区的空间构象进到破坏，上述与f c 受体和补作的结 合功能就丢失【1 9 1 。 3 寡糖链的分子识别作用 寡糖链中单糖间的连接方式的多样性是寡糖链起到分子识别作用的基础。如猪卵细 胞透明带中分子量为5 5 万的z p 3 蛋白，含有o 连接寡糖能识别精子并与之结合。受 体与配体识别和结合也需寡糖链的参与。红细胞的血型物质含糖达8 0 9 0 。a b o 系 统中血型物质a 和b 均是在血型物质o 的糖链非还原端各加g a l n a c 或g a l 仅一个糖 基之差，使红细胞能分别识别不同的抗体，产生不同的血型可见糖链功能之奇妙。细菌 表面存在各种凝集素样蛋白，可识别人体细胞表面的寡糖链结构，而侵袭细胞。 1 3 糖类相关基因 糖链结构是由数量众多编码糖基转移酶、糖苷酶和其它一些合成或修饰糖链如也参 与核苷糖的酶所协调发挥作用决定。研究表明，在不同的细胞中糖基转移酶表达的程度 并不相同，这也就是不同细胞具有细胞类型特异化的糖基化的原因。因此对于糖链结构 和功能的研究不仅仅是在于什么酶参与了反应，而是这些酶如何在一起协调发挥参与了 生物反应。 糖类物质参与了众多的生物学反应，如细胞连接、分子的运输与清除、受体反应、 信号传导等。近几年随着糖组学的深入研究，越来越多的研究工作重点转入到对糖蛋白 表面的糖链结构的研究上。糖基化过程产生了大量多种多样与蛋白或脂类相连的糖链， 过去的数十年对糖链的研究结果表明，在参与产生糖基化形成的过程中，糖基转移酶、 糖苷酶扮演了重要的角色。通过这些酶的参与，糖白蛋形成特异的糖链结构，对于生物 体内各种反应进行有效的介导与调控。 因此在对糖组学的研究过程中，作为参与糖链形成的糖基转移酶与糖苷酶成了从基 因水平研究糖组学的重要内容。 1 3 1糖苷酶 l 糖苷酶的定义 糖苷酶( g l y c o s i d a s e ) 是作用于各种糖苷或寡糖使糖糖苷键水解的酶的总称，又称 糖苷水解酶( g l y c o s i d eb y d r o l a s e ) 。随着采用广泛的生物材料进行酶的提纯和性质研究 的进展，已知在生物体中存在着许多种类的糖苷酶，在研究糖苷、寡糖、多糖中，利用 9 第一章义献综述 这些酶特异的水解作用是很必要。另外对这些酶的存在形态、分布、遗传缺陷、形式结 构的研究，具体地阐明了这些酶在生物体内的正常代谢中所起的作用。糖苷酶一般对糖 苷配基的特异性比对糖残基的特异性差，所以有许多仍未能确定其“真正的天然底物” 到底是什么。现在常根据糖残基的性质( 包括糖苷键的性质) 来进行命名和分类( 如a 葡糖苷酶、b 半乳糖苷酶) ，也有的使用历史上最初发现时来自底物名的惯用名( 如蔗 糖酶称为b 果糖苷酶，麦芽糖酶也被称为a 葡糖苷酶) 2 0 】。对于糖苷酶，也常有催化转 移糖苷给水以外的受体的反应，这个反应不一定有生理学的意义，但在作为分解酶用以 研究寡糖的结构时，须注意防止由于发生寡糖问糖残基的转换而犯意想不到的错误。 糖苷酶作为水解o 或s 糖苷的一类酶被分类在e c 3 2 1 系统。糖苷酶同样也可以根 据水解反应的立体化学特征进行分类，即被可以分成防卫与转化类型【2 1 1 。糖苷酶还可以 分为内切与外切性质的酶。此外糖苷酶也可以根据碱基序列的同源性进行分类。 根据序列进行分类是目前一种生物酶刚刚被测序并且对功能不太了解的时候最有 效的预测酶功能的一种方法。糖苷酶的一种分类方法是建立在序列的相似性上的，这也 导致了它拥有超过1 0 0 多个不同的家族【2 2 。2 4 】。 这种分类学方法可以在c a z y ( c a r b o h y d r a t e - a c t i v ee n z y m e s ) 网站上查询得到。通过 网站的数据库提供的一系列不断更新的分类所需的序列可以进行一种可靠的反应机制 预测，包括是防守还是转向反应，活性位点以及可能的反应底物。根据三维结构相似性， 在序列基础上进行分类的家族还可以进一步细分。如今关于糖苷键序列分析和3 d 结构比 较的成果已经可以对糖苷酶进行更加广泛范围的家族层级划分2 5 1 。 2 糖苷酶的的反应机理 1 ) 糖苷酶的转向反应 转化酶利用2 种酶的残基，通常是羧化物的残基，可以分别具有酸或碱的作用，如 下图的d 一葡萄糖苷( p - g l u c o s i d a s e ) 。 1 0 a c i d e n z 归。 n z y m e ( e o 氐 、1l j r o h ，hr o h h 盆勰o r h 曰醐+ 辩o h h 0 弋。，h h b 占h h + 、 _ ， o 一矿b a o 一o h 图5鼻葡萄糖苷酶可以使底物分别成为酸碱基团 两北人学硕 j 学位论文 2 ) 防卫型糖苷酶 防卫型糖苷酶具有两部反应机制，每一步都将导致一次转向反应，以此维持立体化 学的净保持量。上述两种酶联羧化物残基都涉及了反应。一个扮演了亲核试剂，另一个 发挥着酸或碱的作用。在第一部反应中亲核试剂攻击异头中心，通过酸性羧化物的协助 导致一个糖酶中问体的形成。在第二步反应中，已经失去质子的酸性羧化物扮演了一个 碱性物质以协助亲核的水来水解糖酶的中间体，使得水解进行。这种反应机制已经在蛋 清溶菌酶中被详细阐述。 a c i d b a s e e 。n z y m e c o , - 太o f o h ， l 曰擀! 舶 删n 、 f n u c l 唧h 阳o 丫o v e i n z v m e g l y c o s y ie n z y m ei n t e r m e o i a t e 图6 防守型反应会产生糖一酶中间复合体 l ，o h h l 禽麟o h a c h n o v 。 i e n z y m e c o , - 毽o ，e j d 弋伶 f _ - r o l 善蟛r 睾一秣一专曝= h 钟阶够 删 第一章义献综述 以使制造转化糖，用淀粉酶生产麦芽糖精) 中具有极其广泛的作用。木纤维素被加至棉 纤维洗涤中去污剂以维持棉纤维的良好性质2 7 1 。 在有机化学里，糖苷酶可以用作形成糖苷键的催化剂。既可以在生物体内平衡水平 打破的时候产生水解反应，又可以使转糖基化反应中保守型糖苷酶催化糖基部分从一个 活化的糖苷转到一个醇基以形成一个新的糖苷。 某些突变的糖苷酶可以明显提高从活化的糖基供体( 如糖基氟化物) 形成糖苷的效 率。糖合酶来源于防守型糖苷酶，通过特定位点诱变使酶的亲核体成为不那么具有亲核 性质的基团比如丙氨酸或者甘氨酸。另一种突变的糖苷酶是由硫胶质通过防守型糖苷酶 酸碱残基的定位突变形成。 1 3 2 糖基转移酶 1 糖基转移酶的定义 生物体内多种糖类物质包括双糖、寡糖和多糖的生物合成涉及到了数百种糖基转移 酶的活性。糖基转移酶将糖端部分从有活性的分子转移到特定的受体分子上，形成了糖 苷键。 从这个生物合成过程可以看出，糖基转移酶是糖基化过程的关键酶。目前已对多种 糖基转移酶的结构以及编码它们的基因研究清楚，并认为糖链的合成没有特定的模板， 而是通过糖基转移酶将糖基由其供体转移到受体上。糖基转移酶具有严格的底物专一性， 例如在n 糖链的外周有6 种不同方式连接的构象，分别有6 种不同的糖基转移酶负责它 们的转移，甚